磷脂酰聚乙二醇單甲醚的合成及其自組裝納米膠束的研究

武 莉 陳 靜 劉天軍

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津生物醫(yī)學材料重點實驗室，天津 300192）

引言

磷脂是細胞膜的構(gòu)筑材料，具有很好的生物相容性和成膜性，可以形成囊泡和膠束，在藥用輔料方面有著廣泛的應(yīng)用。然而，磷脂分子量較小，形成的囊泡和膠束穩(wěn)定性不夠，作為長循環(huán)和緩釋材料的應(yīng)用方面受到很大的限制。目前的解決辦法是在其中加入含有長循環(huán)的組分：聚乙二醇、多聚糖、環(huán)糊精等成為長循環(huán)磷脂，以提高磷脂膠束或膠囊的穩(wěn)定性［1］。從化學結(jié)構(gòu)相似相溶的原理出發(fā)，外加結(jié)構(gòu)與磷脂最為相似的組分應(yīng)該具備很好的互溶性，從理論上講對其結(jié)構(gòu)改善也應(yīng)最好。因而含有磷脂組分的高分子或大分子體系的研究受到人們的廣泛重視，將磷脂接枝于高分子骨架或側(cè)鏈上形成高分子化磷脂（mPEG-磷脂）便是在該背景下的研究。聚乙二醇（PEG）是一種中性、無毒、具有生物相容性的親水性聚合物，在藥物制劑方面有著廣泛的應(yīng)用［1］，而磷脂是生物膜的組成成分，具有良好的生物降解性和生物兼容性［2］，將聚乙二醇（PEG）和磷脂相結(jié)合制備兩親性聚合物可以兼顧其良好的生物相容性和長循環(huán)的目的。實踐證明PEG衍生化磷脂作為藥用輔料具有較好的應(yīng)用價值，可以有效提高藥物的長循環(huán)特性［3-6］，特別是用于抗腫瘤藥物載體，可以延長腫瘤組織藥物作用時間，有效抑制腫瘤生長，增強藥效［7-8］。

目前主要以聚乙二醇磷脂酰乙醇胺（PEG-PE）應(yīng)用較多［9］，是在體內(nèi)可降解并經(jīng)美國食品藥品管理局（FDA）批準的可用于人體的藥物載體材料，PEG-PE納米膠束可有效攜載它莫西芬、紫杉醇和地喹氯銨等多種水溶性差的抗腫瘤藥物，且顯示了較高的抗腫瘤效果［10］，但多為進口，價格昂貴，在一定程度上制約了其廣泛的應(yīng)用。因此，開發(fā)新型的PEG衍生化磷脂至關(guān)重要。

本研究制備了新型PEG衍生化磷脂——磷脂酰聚乙二醇單甲醚（mPEG-磷脂），通過自組裝形成納米膠束后進行透析分離純化，并進行了MS、1HNMR等結(jié)構(gòu)表征。通過溶劑揮發(fā)法制備mPEG-磷脂膠束，并通過熒光探針法、掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡和粒度及電位分析儀等對其性能進行了研究。

1 材料和方法

1.1 材料

直接進樣質(zhì)譜儀（ESI-MS）（Trace DSQ，熱電菲尼根公司，美國）、核磁共振譜儀（300 MHz）（Mercury，Varian公司，美國）、掃描電鏡（JSM-6700F，JEOL公司，日本）、透射電鏡（JEM-100CXⅡ，JEOL公司，日本）、粒度儀（Zetasizer Nano ZS，Malvern公司，英國）、熒光分光光度計（F-4500，HITACHI公司，日本）、載氯化鈀的樹脂（本室合成）、二異丙基乙胺（DIPEA）、化學純，河南四方化工有限公司、三氯氧磷（分析純，天津大學科威公司）、聚乙二醇單甲醚（mPEG）（分析純，廣州市靖誠貿(mào)易有限公司）、其它試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 1，2-十六?；ㄊ孽；?、十二?；└视投ィ?、2、3）的合成

圖1為1，2-十六?；ㄊ孽；⑹；└视投サ暮铣陕肪€。載氯化鈀的樹脂加入到反應(yīng)斧中用氫氣還原，然后加入3-芐基-1，2-十六?；ㄊ孽；⑹；└视投?00 g、二氯甲烷溶解，密封。從反應(yīng)釜的出料口通入氫氣，放氣到2.02×105Pa，重復3次，關(guān)閉放氣閥，再通入H2，350 r/min攪拌，待壓力降到10×105Pa后，再補加到15×105Pa，待壓力不再降低時即可。反應(yīng)完畢，放出未反應(yīng)的H2，打開反應(yīng)斧，過濾，濾液旋干，得粗品。用三氯甲烷/石油醚重結(jié)晶，得目標產(chǎn)物。

圖1 1，2-十六?；ㄊ孽；?、十二?；└视投サ暮铣陕肪€Fig.1 Synthetic route of 1，2-palmitoyl-diacylglycerol，1，2-tetradecanoyl-diacylglycerol or 1，2-Lauroyldiacylglycerol

1.2.2 磷脂酰聚乙二醇單甲醚（4-15）的合成

圖2為磷脂酰聚乙二醇單甲醚的合成路線。氮氣保護下，將甘油二酯的干燥四氫呋喃溶液于0℃滴加到DIPEA和三氯氧磷的干燥四氫呋喃溶液中，繼續(xù)攪拌2 h，0℃下繼續(xù)滴加聚乙二醇單甲醚和吡啶的干燥四氫呋喃溶液，室溫反應(yīng)6 h。過濾，向濾液中加入與三氯氧磷等量的水，攪拌1～2 h，蒸干溶劑，得固體，乙醚沉降得磷脂酰聚乙二醇單甲醚粗品。磷脂酰聚乙二醇單甲醚粗品在水中攪拌成膠束后透析，旋干水，即得到白色產(chǎn)物。

1.2.3 磷脂酰聚乙二醇單甲醚膠束的制備

磷脂酰聚乙二醇單甲醚溶于二氯甲烷，在1 000r/min攪拌下滴入蒸餾水中，滴加完畢后再攪拌6 h，常溫下?lián)]去二氯甲烷，離心，上清液過微孔濾膜，即得磷脂酰聚乙二醇單甲醚膠束。

1.2.4 臨界膠束濃度（CMC）的測定

采用芘探針熒光法測定兩親性磷脂酰聚乙二醇單甲醚的臨界膠束濃度。準確稱取一定量的磷脂酰聚乙二醇單甲醚，配制濃度為5×10-4mol/L的水溶液。并稀釋成不同濃度的磷脂酰聚乙二醇單甲醚溶液；以水、乙腈、丙酮、甲醇及正丁醇為溶劑配制終濃度為2×10-6mol/L的芘溶液。分別向10 mL容量瓶中加入0.1 mL芘的丙酮溶液，揮干丙酮。分別取10 mL配好的磷脂酰聚乙二醇單甲醚的水溶液，加到容量瓶中使芘的終濃度達到2×10-6mol/L，振蕩使溶液均勻，為了平衡芘與膠束，混合液在65℃水浴中加熱3 h，再室溫放置1天。激發(fā)波長為335nm測定芘探針在不同極性溶劑中的熒光光譜，測定不同濃度的待測液在373和384 nm兩峰的熒光強度，以濃度為X軸，I384/I373為Y軸作圖，由曲線的突變點確定磷脂酰聚乙二醇單甲醚的CMC值。

圖2 磷脂酰聚乙二醇單甲醚的合成路線Fig.2 Synthetic route of Diacylglyceryl-Phosphatidyl-O-Methoxy（Polyethylene glycol）

1.2.5 膠束粒徑、粒徑分布及Zeta電位的測定

磷脂酰聚乙二醇單甲醚溶解于二氯甲烷中，在1 000 r/min攪拌下滴入蒸餾水中，滴加完畢后再攪拌6 h，常溫下?lián)]去二氯甲烷，離心，上清液過微孔濾膜，采用Zeta PALS-亞微米粒度及電位分析儀測定膠束的粒徑、粒徑分布以及Zeta電位。普魯蘭多糖、二糖及單糖的水溶液濃度以糖的羥基數(shù)與PEG的氧個數(shù)的mol比分別為：1∶4，1∶2，1∶1，2∶1，4∶1。

同法測定不同濃度氯化鈉、葡萄糖水溶液中的膠束粒徑及離子濃度對膠束粒徑的影響。

同法測定不同濃度普魯蘭多糖、二糖及單糖中的膠束粒徑及離子濃度對膠束粒徑的影響。

1.2.6 膠束的形貌表征

用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）觀察膠束的形貌。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種1，2-十六?；ㄊ孽；?、十二酰基）甘油二酯的合成和結(jié)構(gòu)分析

研究中合成了3種磷脂分子，包括：產(chǎn)物 A ：1，2-十六?；视投ィ?）、產(chǎn)物 B ：1，2-十四酰基甘油二酯（2）和產(chǎn)物C：1，2-十二酰基甘油二酯（3）。

產(chǎn)物A的產(chǎn)率為 7 0％，熔點：67～68℃。1HNMR（300MHz，CDCl3）：σ 0.88（t，6 H），1.20～1.25（br.s，48 H），1.57～1.62（m，4 H），2.02～2.06（t，1 H），2.30～2.37（m，4 H），3.71～3.75（d，2 H），4.20～4.34（m，2 H），5.06～5.10（br.s，1 H）。ESI-MS：m/z 1159為2M+Na峰。產(chǎn)物B的產(chǎn)率為74.5％，熔點：60～61℃。1H-NMR（300MHz，CDCl3）：σ0.87（t，6 H），1.20～1.25（br.s，40 H），1.56～1.63（m，4 H），2.02～2.06（t，1 H），2.24～2.34（m，4 H），3.57～3.59（d，2 H），4.15～4.37（m，2 H），5.22～5.25（br.s，1 H）。ESI-MS：m/z 1047為2M+Na峰。產(chǎn)物C的產(chǎn)率為77.8％，熔點：52～53℃。1H-NMR（300MHz，CDCl3）：σ 0.88（t，6 H），1.25（br.s，32 H），1.56～1.632m，4 H），2.02～2.06（t，1 H），2.25～2.34（m，4 H），3.58～3.59（d，2 H），4.15～4.37（m，2 H），5.22～5.26（br.s，1 H）。ESI-MS：m/z 935為2M+Na峰。

2.2 磷脂酰聚乙二醇單甲醚（4-15）的合成和結(jié)構(gòu)分析

利用三氯氧磷直接將甘油二酯與聚乙二醇單甲醚直接連接起來，合成PEG衍生化的磷脂。這比傳統(tǒng)的用PEG修飾磷脂［11］的方法簡單得多，傳統(tǒng)的方法是先利用甘油二酯合成磷脂酰乙醇胺（腦磷脂），再利用一個二元酸酐通過酰胺鍵和酯鍵把磷脂與聚乙二醇單甲醚連接起來。這兩種化合物在結(jié)構(gòu)上相差不多，只是酰胺鍵和酯鍵的差別，所合成的磷脂酰聚乙二醇單甲醚中無酰胺鍵存在，只含有酯鍵，與磷脂更接近，都含有疏水烷基鏈和親水PEG鏈，自組裝成膠束的性能也相似。甘油二酯、聚乙二醇單甲醚和水依次與三氯氧磷上3個氯發(fā)生親核取代反應(yīng)。醇羥基與三氯氧磷發(fā)生取代的能力比較弱，需在堿性條件下反應(yīng)，由于三氯氧磷上有3個位點可以反應(yīng)，為了盡可能的控制甘油二酯只與一個位點進行反應(yīng)，故選擇了空間位阻比較大的二異丙基乙胺，與第2個位點反應(yīng)的時候可以用三乙胺或吡啶［12-13］做催化劑。在反應(yīng)過程中這些堿與生成的氯化氫結(jié)合生成鹽酸鹽，以沉淀的形式析出。由于在整個過程中磷?；?、PEG酯化與水解三步反應(yīng)順次連續(xù)進行，因而前兩步反應(yīng)結(jié)束后過濾除掉生成的鹽，再行水解，可以獲得純凈的目標產(chǎn)物。甘油二酯溶于乙醚，而PEG幾乎不溶于乙醚，用乙醚沉降即可除去未反應(yīng)的甘油二酯，但不能分開PEG與PEG-磷脂。PEG-磷脂與PEG在各種溶劑中的溶解性很相近，嘗試了多種溶劑，都未能把二者利用溶解性的差異而分開。PEG-磷脂同時含有親水鏈段和疏水鏈段，其自組裝性能與單純PEG不同［14-15］，故利用PEG-磷脂的自組裝性能，讓其在水中自組裝成膠束后，用透析法除去未反應(yīng)的PEG。

表1 磷脂酰聚乙二醇單甲醚（4-15）的產(chǎn)率和結(jié)構(gòu)分析Tab.1 The yields and structural analysis of phosphatidyl polyethylene glycol monomethyl ether（4-15）

2.3 PEG-磷脂膠束的臨界膠束濃度（CMC）、粒徑及分布

芘單體熒光振動精細結(jié)構(gòu)具有明顯的溶劑依賴性，因此常被用作熒光探針來研究聚合物在溶液中的聚集狀態(tài)［16］。芘是強憎水性探針，在水中的溶解度為2×10-6～3×10-6mol/L。在膠束和其它大分子體系中，芘會更好地溶解在聚集體的憎水區(qū)，因此芘被廣泛用于聚合物CMC的研究。利用芘探針在不同極性環(huán)境中I384/I373值的突變確定CMC值。圖3是磷脂酰聚乙二醇單甲醚濃度的對數(shù)與芘的I384/I373值的關(guān)系圖。

從圖中看到初始時，隨著各磷脂酰聚乙二醇單甲醚濃度的增大，兩峰的比值變化很平緩，但當達到某一濃度時，兩峰比值有突變現(xiàn)象，再繼續(xù)增大磷脂酰聚乙二醇單甲醚的濃度，這一比值基本保持不變的趨勢。由于在磷脂酰聚乙二醇單甲醚濃度很低時，沒有膠束的形成，環(huán)境的極性沒有明顯變化，所以I384/I373值的變化不大。當磷脂酰聚乙二醇單甲醚濃度達到一定數(shù)值時，開始有膠束形成，芘探針進入膠束的疏水區(qū)，其環(huán)境的極性急劇減小，使I384/I373值發(fā)生突變。當磷脂酰聚乙二醇單甲醚濃度達到這一值以后，環(huán)境極性基本不變化，故I384/I373值基本趨于平緩。經(jīng)測定得到，各磷脂酰聚乙二醇單甲醚的CMC值見表2。聚合物的CMC值與疏水鏈段的性質(zhì)和長度、親水鏈段的長度、聚合物分子量等多種因素有關(guān)。固定疏水鏈段時，隨著親水鏈段PEG的分子量地增加，聚合物的CMC值稍微增大；而固定親水鏈段PEG的分子量時，隨著疏水鏈段地越長，聚合物的CMC值稍微減小。

圖3 1，2-十六?；视投?3-磷脂酰聚乙二醇單甲醚濃度對I384/I373比值的影響。（a）mPEG1-2C16；（b）mPEG2-2C16；（c）mPEG3-2C16；（d）mPEG5-2C16Fig.3 The relationship of fluorescence intensity of I384/I373and the concentration of 1，2-Dipalmitoyl-Glycero-3 Phosphatidyl-O-Methoxy（Polyethylene glycol）.（a）mPEG1-2C16；（b）mPEG2-2C16；（c）mPEG3-2C16；（d）mPEG5-2C16

由圖4和表2可知，磷脂酰聚乙二醇單甲醚膠束的粒徑都集中在100～200 nm。對于同一親水鏈段，隨著疏水鏈段的長度改變，所得膠束的粒徑并無明顯的變化。同樣，對于同一疏水鏈段，親水鏈段長度的變化對膠束粒徑的影響也不甚明顯。

2.4 不同濃度氯化鈉、葡萄糖對膠束粒徑的影響

由于生理介質(zhì)中含有NaCl以及不同的單糖、二糖和多糖，它們對于膠束的形態(tài)、粒徑和穩(wěn)定性會產(chǎn)生不同的影響，本文探討了不同濃度氯化鈉、葡萄糖二糖對PEG修飾磷脂的膠束粒徑及其穩(wěn)定性的影響。

表3為mPEG1-2C16在不同濃度的氯化鈉水溶液中形成膠束的粒徑。從圖5可知，膠束的粒徑隨著氯化鈉濃度的增大而減小。原因主要有兩個方面：一是氯化鈉的鹽效應(yīng)有使疏水鏈段往一起聚集的傾向，因而使疏水鏈內(nèi)核變得緊湊，粒徑減?。欢切》肿勇然c分散在親水鏈段的內(nèi)部，由于離子效應(yīng)使親水外殼也變得緊湊，粒徑也減小。

表2 磷脂酰聚乙二醇單甲醚的CMC、粒徑及分布Tab.2 CMC and Diameter of Diacylglyceryl-Phosphatidyl-O-Methoxy（Polyethylene glycol）

圖4 磷脂酰聚乙二醇單甲醚的粒徑與烷基鏈長短和mPEG分子量的關(guān)系圖Fig.4 Plots of the diameter vs the length of alkyl chian and the molecular weight of mPEG

表3 不同濃度的氯化鈉水溶液中的膠束的粒徑Tab.3 Micelle diameter in different concentration of NaCl water solution

圖5 膠束的粒徑與氯化鈉的濃度的關(guān)系圖Fig.5 Plots of the micelle diameter vsthe concentration of NaCl water solution

表4為mPEG1-2C16在不同濃度的葡萄糖水溶液中形成膠束的粒徑。從圖6可知，膠束的粒徑隨著葡萄糖濃度的增加而增大，這可以從兩個方面來解釋：一是葡萄糖結(jié)合于親水鏈段之間，由于葡萄糖的分子較大水分子，使親水外殼變的疏松；二是葡萄糖以氫鍵結(jié)合于膠束的親水外殼上，隨著附著在膠束表面上的葡萄糖的增加，粒徑也相應(yīng)地增大。這兩者共同的影響都是使膠束的粒徑增大。

表4 不同濃度的葡萄糖水溶液中的膠束的粒徑Tab.4 Micelle diameter in different concentration of glucose water solution

圖6 膠束的粒徑與葡萄糖的濃度的關(guān)系圖Fig.6 Plots of the micellediametervs the concentration of glucose water solution

2.5 不同濃度多糖、二糖及單糖中的膠束粒徑及其對膠束粒徑的影響

表5和圖7表明，多糖對膠束的粒徑影響較大，隨著多糖濃度的增加，膠束的粒徑明顯增大，粒徑從200 nm增大到500 nm左右，而在這個濃度范圍內(nèi)，二糖和單糖對膠束粒徑的影響都不大，粒徑均在200～300 nm。主要原因可能是多糖對膠束的影響為多糖以氫鍵與親水鏈段PEG相結(jié)合，纏繞在膠束的外殼上，使粒徑增大。基于該實驗表明，在生理環(huán)境中因為糖、鹽以及其它生物大分子的存在，長循環(huán)磷脂構(gòu)成的膠束穩(wěn)定性與結(jié)構(gòu)會發(fā)生顯著變化。該問題為緩釋或長循環(huán)藥物制劑的研究設(shè)計提供了一些有價值的啟迪。

圖7 粒徑與糖種類和糖濃度的關(guān)系圖Fig.7 Plots of the diameter vs the concentration of glucose water solution

2.6 膠束的電位

用Zeta PALS-亞微米粒度及電位分析儀測定膠束的電位，結(jié)果見表6，所合成的四種磷脂分子形成的膠束，其Zeta電位均約為-38 mV，這與磷脂酰聚乙二醇單甲醚的結(jié)構(gòu)中含有磷羥基是相符的。

表5 不同濃度的葡萄糖水溶液中的膠束的粒徑Tab.5 Micelle diameter in different concentration of glucose water solution

2.7 膠束的形貌表征

磷脂酰聚乙二醇單甲醚膠束在透射電子顯微鏡下觀察其形貌，結(jié)果如圖8（a）和圖8（b）所示，從電鏡照片可以看到磷脂酰聚乙二醇單甲醚膠束呈球形，平均粒徑在200 nm左右，粒子比較均勻，還可以看到核-殼結(jié)構(gòu)。磷脂酰聚乙二醇單甲醚膠束在掃描電子顯微鏡下觀察其形貌，結(jié)果如圖8（c）所示，從電鏡照片可以看到水中磷脂酰聚乙二醇單甲醚膠束呈球形，膠束的平均粒徑在100 nm左右，粒子較均勻。

表6 mPEG-磷脂的Zeta電位Tab.6 Zeta Potential of mPEG-phospholipids（a）mPEG1-2C16；（b）mPEG2-2C16；（c）mPEG3-2C16；（d）mPEG5-2C16

3 結(jié)論

本研究利用簡單的原料，選擇甘油二酯與聚乙二醇單甲醚通過三氯氧磷直接相連，合成了12種新的兩親性聚合物磷脂酰聚乙二醇單甲醚，并對各產(chǎn)物進行了MS、HNMR等結(jié)構(gòu)表征。該類聚合物在水中易形成具有明顯核-殼結(jié)構(gòu)的球狀膠束，粒徑在100～200 nm；臨界膠束濃度在10-6mol/L，與小分子的表面活性劑相比，CMC值較低，在水中的穩(wěn)定性增強。同時固定疏水鏈段時，CMC值隨著親水鏈段PEG的分子量的增大而增大，而固定親水鏈段PEG的分子量時，CMC值隨著疏水鏈段的增長而減小，具有很好的構(gòu)效關(guān)系。在離子效應(yīng)和氫鍵效應(yīng)對膠束的影響方面：隨著氯化鈉的濃度增加，膠束的粒徑減小，隨著多糖的濃度增加，膠束的粒徑增大。綜上，磷脂酰聚乙二醇單甲醚自組裝納米膠束結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是一種潛在的納米藥物載體。

圖8 磷脂酰聚乙二醇單甲醚的TEM和SEM。（a）膠束TEM；（b）單個膠束TEM；（c）膠束 SEMFig.8 TEM and SEM of Diacylglyceryl-Phosphatidyl-O-Methoxy（Polyethylene glycol）.（a）TEM of micelles；（b）TEM of a micelle；（c）SEM

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