低強度脈沖超聲波聯(lián)合引導(dǎo)骨再生術(shù)對Beagle犬牙周骨開窗缺損修復(fù)效應(yīng)的研究

高 翔 宋錦璘* 鄧 鋒 趙純亮 王智彪

1（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶市口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)研究中心，重慶 401147）2（超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級重點實驗室，重慶 400016）

引言

先天畸形、外傷或牙周病等因素，常導(dǎo)致牙槽骨發(fā)生不同程度缺損，造成牙齒支持組織破壞，牙周附著喪失，最終導(dǎo)致牙喪失［1］。目前，治療牙槽骨缺損的主要方法有植骨術(shù)、引導(dǎo)組織再生術(shù)（guided tissue regeneration，GTR）以及引導(dǎo)骨組織再生術(shù)（guided bone regeneration，GBR）等［2］。其中GBR作為一種基于GTR理論發(fā)展而來的再生性手術(shù)，將GTR術(shù)與骨移植治療聯(lián)合應(yīng)用，可以獲得牙槽骨再生［3］。GBR術(shù)后，牙槽骨完全修復(fù)上頜區(qū)約需6個月，下頜區(qū)約需3個月［4］。術(shù)后由于口腔衛(wèi)生差、吸煙、牙齦厚度不足等原因，常導(dǎo)致屏障膜早期暴露而影響療效［5－6］，亟待促進(jìn)牙槽骨修復(fù)、縮短修復(fù)時間的輔助療法。

低強度脈沖超聲波（lowintensitypulsed ultrasound，LIPUS）為強度低于100 mW/cm2的脈沖式超聲波，具有產(chǎn)熱相對較弱，無侵入性，具有促進(jìn)牙周組織修復(fù)的潛力［7－13］。以往研究側(cè)重LIPUS單獨處理對牙周組織的影響［8－10］，尚未見 GBR與LIPUS聯(lián)合應(yīng)用對牙周骨開窗缺損生物學(xué)改建效應(yīng)的相關(guān)報道。

本研究應(yīng)用GBR輔以LIPUS處理Beagle犬尖牙牙周骨開窗缺損模型，通過Micro-CT檢測及組織學(xué)分析，探討LIPUS對GBR修復(fù)牙周骨缺損的影響，以期為LIPUS輔助治療提高臨床GBR療效提供前期實驗參考。

1 材料和方法

1.1 實驗對象和材料

1.1.1 實驗對象

12～18個月齡健康雄性beagle犬5只（重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供），體重7～11 kg。尖牙無齲壞，牙周情況良好，牙齦無紅腫出血，牙槽骨無缺損。選擇尖牙為實驗牙，每只Beagle犬4顆尖牙按簡單隨機法分配到4個治療組：LIPUS（90 mW/cm2，20 min/d）組、LIPUS（90 mW/cm2，20 min/d）+GBR組、GBR組、空白對照組。每組5顆實驗牙。

1.1.2 實驗藥品

速眠新Ⅱ注射液（批號：005013，規(guī)格：1.5 mL/支，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所）、地西泮注射液（批號：H50021483，規(guī)格：2mL：10 mg/支，西南藥業(yè)股份有限公司）、康派特醫(yī)用膠（北京瞬康醫(yī)用膠有限公司）、醫(yī)用超聲耦合劑、2％鹽酸利多卡因、鹽酸腎上腺素注射液等。

1.1.3 實驗材料和儀器

聚四氟乙烯（polyetrafluoroethylene，PTFE）膜（FP301100，厚度：0.01 mm，Goodfellow Cambridge Ltd，英國）、低強度脈沖超聲實驗儀（國家超聲醫(yī)療工程中心提供）、切片機（Leica RM2135型轉(zhuǎn)輪，德國Leica公司）、Nikon DXM1200和NIS-Elements F3.0計算機圖像分析系統(tǒng)（日本Nikon公司）、Micro-CT（μCT80瑞士）、HPIntegrity工作站（Itanium?2處理器，64位OpenVMS操作系統(tǒng)）等。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建Beagle犬尖牙牙周骨缺損模型

速眠新Ⅱ注射液復(fù)合地西泮注射液對Beagle犬實施全身麻醉。麻醉后將Beagle犬固定，消毒鋪巾，口內(nèi)2％碘酊消毒，75％酒精脫碘，嚴(yán)格無菌操作。含腎上腺素2％利多卡因注射液浸潤麻醉。實驗區(qū)頰側(cè)牙齦做三角形切口，翻開全厚粘骨膜瓣，高速裂鉆配合骨鑿制備大小5 mm×5 mm矩形牙槽骨缺損，完全暴露尖牙根面，刮除殘留牙周膜組織，平整根面，SSW HP-700裂鉆沿缺損邊緣在根面上做連續(xù)切跡以便組織學(xué)觀測，同時在尖牙牙冠做“L”形標(biāo)記，指示缺損位置，冠部“—”形切跡距離矩形缺損冠向邊緣約15 mm（見圖1中（a）～（c））。

1.2.2 GBR手術(shù)

選擇下頜第一磨牙根分叉區(qū)牙槽骨作為供骨區(qū)，取適量牙槽骨，剪碎后放入生理鹽水中備用。將備用骨質(zhì)植入GBR和LIPUS+GBR治療組缺損區(qū)，用量大致平齊缺損周圍骨緣。高溫消毒后的PTFE膜修整后（面積比缺損周緣大2～3 mm）用康派特醫(yī)用膠粘結(jié)固定于牙槽骨面，覆蓋植骨區(qū)［13］。生理鹽水沖洗后，齦瓣復(fù)位，4-0絲線縫合關(guān)閉創(chuàng)面（圖1中（d）～（f））。LIPUS組和空白對照組省略此步驟。術(shù)后連續(xù)4 d給予肌肉注射青霉素（80萬單位/d）預(yù)防感染，術(shù)后 1周內(nèi)進(jìn)軟食，每日用1.5％洗必泰局部沖洗，1周后拆線。

圖1 牙周手術(shù)過程。（a）～（c）骨開窗建模；（d）～（f）GBR手術(shù)Fig.1 The process of periodontal surgery.（a）～（c）Fenestration wounds modeling；（d）～（f）GBR operation

1.2.3 LIPUS參數(shù)設(shè)定及處理方法

基于安全無創(chuàng)性原則，LIPUS治療參數(shù)為ISATA 90 mW/cm2，頻率1.5 MHz，調(diào)制信號波寬200 μs，重復(fù)率1 kHz，處理時間20 min/d［12，14］。連續(xù)4周（28 d）每天輻照1次。參考標(biāo)記線位置放置超聲治療儀探頭（見圖2）。

圖2 LIPUS處理Fig.2 LIPUS treatment

1.2.4 Micro-CT圖像三維重建

4周后，過量麻藥處死Beagle犬，用金屬片切片將上下頜尖牙完整取出，4％多聚甲醛液（pH=7）固定1周。Micro-CT運行參數(shù)為電壓55 kV，電流145 μA，圖像矩陣2 048像素×2 048像素，層距0.037 0 mm。將標(biāo)本固定放置于掃描容器中，保證掃描平面與牙長軸垂直，掃描方向從尖牙冠部至根尖部。獲取Micro-CT掃描圖像（見圖3）后，在HP Integrity 64位工作站中對圖像進(jìn)行重建分析。對實驗區(qū)進(jìn)行三維重建，對不同組織通過不同顯色和透明度區(qū)別觀察缺損區(qū)牙槽骨再生情況。1.2.5 制備組織切片

圖3 尖牙掃描后重建圖像Fig.3 The reconstruction image of canine after scanning

Micro-CT檢測后，在生理鹽水沖洗下用金屬片切片將實驗區(qū)牙根及牙周組織（不包括牙齦）完整取下（邊界大小10 mm×10 mm）并修整。10％EDTA 37℃恒溫水浴脫鈣2個月后，常規(guī)梯度脫水，浸蠟，石蠟包埋，沿牙根長軸做頰舌向連續(xù)切片，切片厚度5 μm。每個組織塊選取中間段5張切片用于HE染色和Masson染色（4張HE染色，1張Masson染色）。計算機圖像分析系統(tǒng)顯微鏡下采集組織切片圖像。

1.2.6 組織學(xué)定量分析

用計算機圖像分析系統(tǒng)（Nikon DXM1200和NIS-Elements F3.0）采集40倍下切片圖像，并用IPP-6.0圖像分析軟件進(jìn)行測量分析［7］，骨“開窗”缺損新生牙周組織生長模式如圖4所示，測量切片缺損總面積、新生骨組織面積。

圖4 骨“開窗”模型新生牙周組織生長模式圖（N：根面切跡；NC：新生牙骨質(zhì)；NP：新生牙周膜；NB：新生牙槽骨；BM：聚四氟乙烯膜；ST：軟組織）Fig.4 The growth diagram of new periodontal tissue in fenestration defect（N：notch；NC：new cementum；NP：new periodontal ligament；NB：new bone；BM：PTFE membrane；ST：soft tissue）

（1）缺損初始面積（total defect area，TDA）：根面缺損的總面積。

（2）新生骨組織面積（new bone area，NBA）：缺損區(qū)新生骨組織的面積總和。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，對相關(guān)資料進(jìn)行隨機區(qū)組設(shè)計的方差分析，組間比較進(jìn)行LSD檢驗，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床愈合情況

骨開窗模型臨床愈合情況有以下3種：（1）失?。糊l瓣缺損，PTFE膜移位或脫落；（2）暴露：齦瓣缺損，PTFE膜暴露但沒有脫落；（3）完全愈合：牙齦愈合良好，PTFE膜未暴露。失敗和暴露牙位不納入測量分析。各實驗組臨床愈合情況見表1。

表1 各實驗組臨床愈合情況Tab.1 The clinical healing between groups

2.2 實驗區(qū)大體觀察

各組牙槽骨缺損面積均不同程度縮小，新生組織從缺損周圍標(biāo)記處向中心生長，缺損處無明顯炎癥反應(yīng)。LIPUS+GBR和GBR組PTFE膜被結(jié)締組織包裹，固定于原處，未發(fā)生明顯移位（見圖 5和圖6）。

圖5 術(shù)中缺損大小Fig.5 The size of defect in operation

2.3 Micro-CT三維重建圖像分析

從重建的三維圖像中觀察發(fā)現(xiàn)，各治療組牙槽骨均有一定程度的修復(fù)。未進(jìn)行GBR術(shù)治療組，實驗牙內(nèi)新生牙槽骨面積較進(jìn)行GBR術(shù)治療組小，且牙槽骨表面空隙較多，提示新生牙槽骨的密度較低；進(jìn)行GBR術(shù)的治療組，實驗牙新生牙槽骨密度較高，提示牙槽骨再生量較高；空白對照組新生牙槽骨表面空隙較多，提示新生牙槽骨密度較低，新生牙槽骨面積在各治療組中最?。籐IPUS+GBR組新生牙槽骨表面空隙較少，新生牙槽骨面積最大，提示新生牙槽骨密度較高，牙槽骨再生量較高。

圖6 治療后缺損大小Fig.6 The size of defect after treatment

2.4 組織學(xué)觀察

2.4.1 LIPUS組：光鏡下可見豐富的成纖維細(xì)胞，

膠原纖維束及新生毛細(xì)血管；成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞功能活躍（見圖7和圖8），Masson染色新生組織中成熟骨組織膠原分布較廣。

圖7 成牙骨質(zhì)細(xì)胞及新生牙骨質(zhì)（HE染色，200×）Fig.7 Cementoblast cells and new cementum（HE Staining，200×）

圖8 成骨細(xì)胞及新生牙槽骨（HE染色，400×）Fig.8 Osteoblasts and new alveolar bone（HE staining，200×）（HE staining，400×）

2.4.2 LIPUS+GBR組：PTFE膜與牙周組織接觸良好，未見膠原纖維束穿過，膜下膠原纖維束及新生毛細(xì)血管豐富；成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞功能活躍；少量尚未吸收改建，大小不等移植骨顆粒分布缺損區(qū)，大量功能活躍的成骨細(xì)胞以植骨顆粒為支架編織合成新骨（見圖9和圖10）；陳舊骨與新生骨之間有明顯交界線，Masson染色與LIPUS組類似。

圖9 PTFE膜與周圍組織（HE染色，40×）Fig 9 PTFE membrane in vivo（HE staining，40×）

圖10 超聲處理+GBR組織學(xué)表現(xiàn)（HE染色，40×）Fig.10 Histological performance in LIPUS+GBR group（HE staining，40×）

2.4.3 GBR組：缺損處以成纖維細(xì)胞及新生毛細(xì)血管為主，膠原纖維束較少，成牙骨質(zhì)細(xì)胞靠近根面形成牙骨質(zhì)，少量植骨顆粒散在分布，Masson染色新生組織中成熟骨組織膠原分布相對較少。

2.4.4 空白對照組：缺損處可見少量新生骨組織，新生骨組織以軟骨膠原纖維為主，Masson染色顯示主要為非成熟的骨組織膠原成分（見圖11）。

2.5 組織學(xué)定量檢測

各治療組TDA無顯著性差異（P＞0.05）；各治療組新生骨組織面積及新生骨占初始缺損面積百分比（NBA％），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

3 討論

圖11 空白對照組組織學(xué)表現(xiàn)。（a）HE染色，100×；（b）HE染色，200×；（c）染色Masson，100×Fig.11 Histological performance in control group.（a）HE staining，100×；（b）HE staining，200×；（c）Masson staining，100×

表2TDA，NBA及NBA％測量結(jié)果Tab.2 The measurements of TDA，NBA and NBA％

牙槽骨缺損修復(fù)的動物模型需滿足兩個要求：一是能夠真實反應(yīng)牙周組織修復(fù)的過程；二是利于準(zhǔn)確評估處理因素對牙周組織的生物學(xué)效應(yīng)［15］。本研究選擇牙槽骨“開窗”模型為矩形“封閉”缺損，可有效排除外界感染因素的影響，有利于準(zhǔn)確評估LIPUS在GBR治療中的生物學(xué)效應(yīng)。

由于具有與人類相似的牙周組織結(jié)構(gòu)，犬常被用于牙周動物實驗［16］。研究發(fā)現(xiàn)，犬下頜頰側(cè)5 mm直徑的環(huán)形牙槽骨開窗模型術(shù)后16周，通過自愈可獲得完全牙槽骨再生［17］。急性牙周損傷建模后，動物組織的自愈性常導(dǎo)致對治療方法效果的過高評介［18］。LIPUS處理時間過長，Beagle犬牙周組織的自愈性的影響可能會更大。Ikai等發(fā)現(xiàn)Beagle犬牙周翻瓣術(shù)后，連續(xù)4周LIPUS輻照后可以活化成骨細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞，對牙周病組織愈合及牙槽骨修復(fù)有促進(jìn)作用［11］。因此，本研究選擇4周LIPUS處理時間，不僅可減少Beagle犬牙周自愈性對實驗結(jié)果的干擾，而且有利于LIPUS與GBR聯(lián)合應(yīng)用對牙槽骨缺損早期修復(fù)效應(yīng)的研究。

Micro-CT是一種高分辨率的三維重建影像技術(shù)，具有對組織無創(chuàng)、精確度高、直觀性好等特點，主要應(yīng)用于骨組織或口腔內(nèi)牙體組織、牙槽骨組織的重建分析［19］。本實驗利用HP Integrity工作站對Micro-CT掃描圖像進(jìn)行三維重建后，形態(tài)學(xué)觀察顯示，掃描后重建圖像，牙體組織和牙槽骨組織圖像清晰、真實、直觀，牙根面的骨缺損標(biāo)記線明顯，為定量分析新生牙槽骨提供有力保證。但由于重建實驗區(qū)域圖像的密度值主要通過灰度值表達(dá)，在牙槽骨修復(fù)初期，骨纖維密度灰度值較低，在掃描圖像上可能無法顯示或者顯示灰度值偏低，檢測過程中可能造成部分樣本丟失，使檢測結(jié)果較實際組織成骨能力低［20］。此外，在圖像重建過程中，牙周膜和牙齦等低密度組織不能顯影，故Micro-CT無法對牙周膜和牙齦等組織的修復(fù)狀況進(jìn)行分析。因此，Micro-CT對牙周組織修復(fù)的檢測具有一定的局限性，在實驗中應(yīng)結(jié)合組織學(xué)分析，以提高牙周組織修復(fù)分析的準(zhǔn)備度和精確度。

LIPUS作為一種非侵入性機械能，不僅可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，刺激細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)增殖，加快鈣鹽沉積［21］，而且能增強人牙骨質(zhì)細(xì)胞堿性磷酸酶活性，促進(jìn)膠原合成［22］。本研究中LIPUS組與LIPUS+GBR治療組HE染色切片可見大量成骨細(xì)胞與成牙骨質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)成立方狀，核大，細(xì)胞功能活躍，說明LIPUS處理具有促進(jìn)成骨細(xì)胞與成牙骨質(zhì)細(xì)胞功能活性的作用。此外，通過Masson染色對骨組織膠原的染色反應(yīng)，可以評價骨質(zhì)的成熟度［23］，LIPUS組與LIPUS+GBR治療組新生組織Masson染色顯示成熟骨組織膠原的分布較廣，說明LIPUS能夠促進(jìn)新生牙槽骨中骨膠原合成，提高新生牙槽骨成熟度。

本研究通過組織形態(tài)學(xué)測量方法，評價LIPUS與GBR聯(lián)合應(yīng)用對牙周骨缺損牙槽骨修復(fù)的作用。研究結(jié)果顯示LIPUS+GBR組較GBR組有更多的新生牙槽骨，統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異，說明LIPUS對牙槽骨修復(fù)具有促進(jìn)作用，但是LIPUS+GBR組新生牙槽骨量有限，僅占缺損總面積8.08％～12.52％，缺損區(qū)膠原纖維束較多，原因可能是：移植骨主要為皮質(zhì)骨，骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞含量少，自身成骨作用有限，主要起支架作用，引導(dǎo)附近相關(guān)細(xì)胞進(jìn)入缺損區(qū)形成新骨，該修復(fù)早期表現(xiàn)可能為先吸收再修復(fù)，由于實驗時間只有4周，組織學(xué)反應(yīng)主要表現(xiàn)為移植骨吸收。

4 結(jié)論

LIPUS輔助GBR治療，在一定程度上可以促進(jìn)牙周骨開窗缺損的早期修復(fù)。后續(xù)研究可考慮GBR術(shù)中選擇適當(dāng)?shù)囊浦膊牧希热缪乐芙M織工程復(fù)合材料，通過組織工程支架直接引導(dǎo)成骨反應(yīng)，以期進(jìn)一步提高修復(fù)療效。

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