兩種體外人肝細(xì)胞的不同培養(yǎng)方式的比較研究

楊 波 劉 寶 林 沈 力

（上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 2 00093）

YANG Bo LIU Bao-Lin* SHEN Li

（Institute of Biothermal Engineering，University of Shanghai for Science.＆Technology，Shanghai 200093，China）

引言

肝功能衰竭是一種死亡率很高的危重病癥。藥物保守治療效果有限，而原位肝移植（orthotropic liver transplantation，OLT）又存在種種棘手的難題。如果能以人工方法替代或部分替代肝功能，給以短暫支持，則可幫助自體肝細(xì)胞再生，促進(jìn)肝功能恢復(fù)或作為肝移植的過渡輔助。基于細(xì)胞功能構(gòu)建的生物人工肝（bioartificial liver，BAL）是較為有效的方法。生物人工肝中的核心部分是執(zhí)行肝功能的肝細(xì)胞，其直接決定著治療效果，因此生物人工肝的關(guān)鍵材料是培養(yǎng)具有正?；钚院凸δ艿母渭?xì)胞。大量分離的肝細(xì)胞并不能直接應(yīng)用于人工肝系統(tǒng)，因?yàn)榇藭r(shí)肝細(xì)胞處于損傷期，還不具備完善的功能，需要進(jìn)一步培養(yǎng)以恢復(fù)肝細(xì)胞特殊的生物功能，而人工肝支持系統(tǒng)的肝細(xì)胞培養(yǎng)不同于普通的細(xì)胞培養(yǎng)，需要進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)。目前大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng)主要有凝膠包裹、微載體、中空纖維、平板培養(yǎng)系統(tǒng)等，這些方法均能顯著提高培養(yǎng)肝細(xì)胞的規(guī)模和質(zhì)量［1－2］。肝細(xì)胞微載體粘附培養(yǎng)是近年來研究和應(yīng)用較多的高密度肝細(xì)胞培養(yǎng)方法［3－6］。

采用cytodex 3型微載體進(jìn)行人肝細(xì)胞L-02的微載體培養(yǎng)，對其功能進(jìn)行測定，同時(shí)與平面貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞進(jìn)行了對照研究，就目前常用的兩種體外方式培養(yǎng)的肝細(xì)胞在功能表達(dá)上是否存在差異，進(jìn)行了系統(tǒng)的比較研究。以尋求一種相對簡化的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)方式，同時(shí)又使其不失良好的結(jié)構(gòu)和功能表達(dá)，使人肝細(xì)胞能夠更好的應(yīng)用于體外生物人工肝的生物材料。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用的人肝細(xì)胞購于上海細(xì)胞生物研究所。cytodex 3微載體（球徑133～215 μm，Pharma sia Sweden）；實(shí)驗(yàn)試劑為標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)液，DMSO（無菌），胰蛋白酶-EDTA消化液（0.25％），曲利苯藍(lán)，尿素標(biāo)準(zhǔn)液，葡萄糖試劑盒等購自上海索萊寶生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)儀器有二氧化碳培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（日本Tommy有限公司），Nikon顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 微載體人肝細(xì)胞L-02的培養(yǎng)

主要步驟為：

（1）培養(yǎng)板的硅化：超凈臺(tái)上，取一次性無菌6孔細(xì)胞培養(yǎng)板一個(gè)，在每個(gè)孔中加入60 mL/L甲基硅樹脂乙醇溶液12 mL，輕輕搖勻，吸出多余的溶液，置于60℃電烤箱烘干備用；

（2）微載體滅菌處理：在超凈臺(tái)上，干燥的微載體在無Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液（PBS）（每克Cytodex加50～100 mL）中室溫下浸泡膨脹至少3 h；棄去上清液，用新配制的無 C a2+、Mg2+PBS（每克Cytodex加30～50 mL）洗滌微載體數(shù)分鐘；棄去PBS，換上新的無Ca2+、Mg2+的PBS（每克 C ytodex加30～50 mL）；然后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌（115℃，15 min，15 psi）；Cytodex非常穩(wěn)定，可以反復(fù)（至少 5次）、長時(shí)間（130℃，12 h，27 psi）進(jìn)行高壓滅菌而不影響其性能；所有溶液的pH應(yīng)為7.4；

（3）肝細(xì)胞接種前的平衡：在超凈臺(tái)上，將上述培養(yǎng)板孔中的液體吸出，再用滅菌的無Ca2+、Mg2+的PBS漂洗1次，吸棄PBS，用溫和的含有100mL/L胎牛血清（FBS）及上述RPMI 1640培養(yǎng)基漂洗微載體，將溫度調(diào)至37℃，培養(yǎng)基的pH=7.1～7.4，通入95％空氣和5％C02混合氣體，5 min后準(zhǔn)備接種；

（4）人肝細(xì)胞L-02的小體積接種：在超凈臺(tái)上，將分離的人肝細(xì)胞L-02按2×105cells/mL的密度接種于上述培養(yǎng)板孔中，補(bǔ)充上述培養(yǎng)基至5mL，置培養(yǎng)板于37℃、5％CO2、100％濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中；

（5）人肝細(xì)胞L-02的“相對”靜止培養(yǎng)：前6 h，每15～20min將培養(yǎng)板取出，在超凈臺(tái)上勻速、輕柔、水平搖晃1次，6 h后每1 h再搖晃1次，10 h后每2 h搖晃1次，每次搖晃時(shí)間均為1～2 min，16 h停止搖晃，置于培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h后換液，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色和透亮度來更換培養(yǎng)液，每次換去約4 mL的培養(yǎng)上清。

1.2.2 平面粘附人肝細(xì)胞L-02的培養(yǎng)

主要步驟為：

（1）配置培養(yǎng)液100 mL，取標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清10mL，RPMI-1640培養(yǎng)液90 mL，分別加入儲(chǔ)存瓶中混勻；吸取10 mL培養(yǎng)液至20 mL培養(yǎng)瓶中；

（2）吸取肝細(xì)胞懸液1 mL置于培養(yǎng)瓶；

（3）將培養(yǎng)瓶放入二氧化碳培養(yǎng)箱，在37℃、5％CO2二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

用倒置生物顯微鏡對培養(yǎng)過程進(jìn)行觀察拍照。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測白蛋白、尿素、葡萄糖含量

兩組均每48 h更換一次培養(yǎng)液，收集第2、4、6、8、10 d的上清液；以溴甲酚綠法，二乙酰一肟顯色法，葡萄糖氧化酶法在酶標(biāo)儀（LRM340M，北京博邁杰科技有限公司）上測定白蛋白、尿素和葡萄糖的含量。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以ˉx表示，采用SPSS V13.0軟件對數(shù)據(jù)作單向方差分析。

2 結(jié)果

2.1 L-02人肝細(xì)胞上清液的生化指標(biāo)（白蛋白、葡萄糖和尿素合成量）測定

2.1.1 兩種培養(yǎng)方式測定的人肝細(xì)胞白蛋白含量

圖1 10 d內(nèi)微載體培養(yǎng)和平面培養(yǎng)肝細(xì)胞白蛋白分泌量的變化曲線Fig.1 The curve of hepatocyte albumin concentration of microcarrier culture and plane culture in 10 days

比較兩種培養(yǎng)方式的肝細(xì)胞的白蛋白合成量的變化趨勢。在10 d培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，微載體的肝細(xì)胞白蛋白分泌量高于平面貼壁培養(yǎng)的肝細(xì)胞（見圖1）。兩組白蛋白合成量自開始培養(yǎng)后迅速升高，分別于第4和第6 d達(dá)最高峰，濃度分別為（40.97±3.28）mg/L和（35.69±1.21）mg/L。隨著細(xì)胞的生長減慢和部分細(xì)胞衰亡，白蛋白的合成量逐漸降低；至第10 d，分別為（15.18±2.37）mg/L和（2.4±2.76）mg/L。表1顯示了微載體培養(yǎng)的肝細(xì)胞和平面單層貼壁培養(yǎng)肝細(xì)胞10 d內(nèi)測定的白蛋白分泌量，用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)后得知微載體組和平面培養(yǎng)組在第6 d比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 肝細(xì)胞白蛋白合成功能（mg/L）Tab.1 Results of human hepatocyte L-02 secreted albumin

2.1.2 兩種培養(yǎng)方式測定的人肝細(xì)胞尿素合成功能

測定10 d內(nèi)兩種細(xì)胞培養(yǎng)方式的人肝細(xì)胞尿素合成量，兩種尿素合成量從開始培養(yǎng)先慢慢升高后逐漸降低（見圖2）。最高尿素合成量均出現(xiàn)在第6天，微載體組最高達(dá)（5.08±0.13）mmol/L，平面培養(yǎng)組為（3.94±0.10）mmol/L。用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)后得微載體組每天尿素合成量均顯著高于平面貼壁培養(yǎng)組（見表2），兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

注：*與平面培養(yǎng)組同樣培養(yǎng)時(shí)間比較有顯著差異（P＜0.05）

圖2 10 d內(nèi)微載體培養(yǎng)和平面培養(yǎng)人肝細(xì)胞尿素合成量的變化曲線Fig.2 The curve of hepatocyte concentration of microcarrier culture and plane culture in 10 days

2.1.2 兩種培養(yǎng)方式測定的人肝細(xì)胞葡萄糖代謝功能

通過比較兩種培養(yǎng)方式肝細(xì)胞葡萄糖合成量的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)在10 d培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)葡萄糖合成量先升高后逐漸降低（見圖3）。兩種培養(yǎng)方式葡萄糖最高合成量分別出現(xiàn)在第4、6 d，微載體組達(dá)11.19±0.27μmol/L高于平面培養(yǎng)組8.17±0.21μmol/L；由表3可知，微載體組葡萄糖合成量均高于平面培養(yǎng)組，其中第4、6和第8 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 肝細(xì)胞葡萄糖濃度（μmol/mL）Tab.3 Results of human hepatocyle L-02 consumed glucose

圖3 10 d內(nèi)微載體培養(yǎng)和平面培養(yǎng)人肝細(xì)胞葡萄糖合成量的變化曲線Fig.3 the curve of hepatocyte glucose concentration of microcarrier culture and plane culture in 10 days

2.2 肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

在倒置顯微鏡下觀察：L-02肝細(xì)胞懸液和微載體一起加到限制貼壁培養(yǎng)瓶（圖4（a）），1 h后，細(xì)胞開始向微載體聚集并粘附生長（見圖4（b））；18 h后，微載體上的肝細(xì)胞已經(jīng)很多，均附著于微載體上并開始鋪展（見圖4（c））；36 h后，大部分微載體已鋪滿細(xì)胞（見圖4（d）），多個(gè)細(xì)胞包裹的微載體相互粘連，成片狀或成團(tuán)聚集生長。細(xì)胞在微載體上可繼續(xù)生長10 d左右，10 d后已可見細(xì)胞從微載體脫落，死細(xì)胞開始增多。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)微載體組肝細(xì)胞生長情況（100×）。（a）0 h；（b）1 h；（c）18 h；（d）36 hFig.4 Morphologies and proliferation of cytodex cells（100×）.（a）0 h；（b）1 h；（c）18 h；（d）36 h

對照組新鮮分離的肝細(xì)胞為透亮圓形細(xì)胞，呈單個(gè)分散狀態(tài)（見圖5（a））。培養(yǎng)1 h開始出現(xiàn)伸展（見圖5（b））。培養(yǎng)18 h部分肝細(xì)胞貼壁，貼壁的肝細(xì)胞呈典型上皮細(xì)胞樣的多角形形態(tài)，胞體變平變薄，可見細(xì)胞伸展連接。培養(yǎng)36 h，細(xì)胞繼續(xù)黏貼伸展，細(xì)胞間出現(xiàn)島狀連接，逐漸聯(lián)成片狀聚集（圖5（d））。6 d后細(xì)胞需要換代培養(yǎng)或凍存，因?yàn)榇藭r(shí)，細(xì)胞瓶內(nèi)可見老化肝細(xì)胞已開始脫壁；繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)瓶內(nèi)貼附生長的很多肝細(xì)胞會(huì)脫落死亡。

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)平面組肝細(xì)胞生長情況（100×）。（a）0 h；（b）1 h；（c）18 h；（d）36 hFig.5 Morphologies and proliferation of plane cells（100×）.（a）0 h；（b）1 h；（c）18 h；（d）36 h

3 討論

生物型人工肝一般專指人工培養(yǎng)的肝細(xì)胞為基礎(chǔ)構(gòu)件的體外生物反應(yīng)系統(tǒng)，它不僅具有肝臟的特異性解毒功能，而且具有更高的效能。人工肝核心部分是執(zhí)行肝功能的肝細(xì)胞，如何培養(yǎng)長期存活并具有活性的肝細(xì)胞，是目前生物人工肝的一個(gè)主要研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。本研究基于此，就平面貼壁培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)這兩種目前常用的體外培養(yǎng)方式，對肝細(xì)胞活性的影響作一系列比較研究。

Cytodex-3載體在葡聚糖凝膠微球表面包被薄層膠原，不帶電荷，每克Cytodex3約含3.0×106個(gè)微載體、膨脹系數(shù)為15，可提供2 700 cm2的表面積，密度為1.04 g/mL，直徑大約141～211 μm，中位直徑（d50）175 μ m。比重1.030～1.045，透明，對細(xì)胞無毒性，表面包被了一薄層膠原基質(zhì)，該膠原成分適合肝細(xì)胞粘附、伸展和增殖。

本研究在相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［7－9］和工作條件的基礎(chǔ)上，以自行建立的方法，通過抑制性貼壁，定時(shí)手工搖動(dòng)，成功將人肝細(xì)胞L-02置于微載體Cytodex3樣本上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室小體積三維培養(yǎng)。微載體培養(yǎng)時(shí)，有幾個(gè)影響因素：（1）微載體濃度：微載體濃度高，提供的肝細(xì)胞生長的面積就大，可以滿足高密度肝細(xì)胞培養(yǎng)的要求；但過多的微載體會(huì)減少肝細(xì)胞的生存空間，因此，肝細(xì)胞培養(yǎng)需要有一個(gè)適宜的微載體濃度，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道采用的微載體濃度一般為3～10 g/L［10－12］?？紤]用間斷搖動(dòng)的方法懸浮微載體，微載體懸浮不均勻，濃度宜小，采用微載體濃度為0.5 g/100mL的濃度；（2）接種濃度：文獻(xiàn)報(bào)道微載體肝細(xì)胞培養(yǎng)的接種濃度多在5×105～5×106cells/mL［13－14］，接種細(xì)胞濃度過多，肝細(xì)胞生理活性和密度會(huì)逐漸下降、甚至造成細(xì)胞死亡；本實(shí)驗(yàn)室條件下，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)情況選擇了0.5×105cells/mL為肝細(xì)胞的接種濃度；（3）攪拌速度，實(shí)驗(yàn)中采用手工間斷輕微搖動(dòng)的方式，使肝細(xì)胞貼附于微載體之上；（4）實(shí)驗(yàn)中玻璃器皿的硅化，即抑制肝細(xì)胞貼壁，也抑制微載體貼壁，避免了二者貼壁對培養(yǎng)效果的影響，促進(jìn)肝細(xì)胞與微載體粘附，實(shí)現(xiàn)懸浮貼附培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)以0.5×105cells/mL的肝細(xì)胞接種濃度，5 g/L的微載體濃度，進(jìn)行肝細(xì)胞的培養(yǎng)，同時(shí)以25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行平面培養(yǎng)為對照組，對培養(yǎng)的人肝細(xì)胞L-02進(jìn)行定時(shí)的觀察檢測和評價(jià)，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)單層平面貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞在培養(yǎng)2 h后細(xì)胞開始貼壁，隨后貼壁生長聚集連接形成島狀，直至長滿瓶壁；而微載體培養(yǎng)的細(xì)胞也是2 h后開始黏附微載體，隨后在微載體上慢慢黏附聚集生長，多個(gè)微載體表面的肝細(xì)胞連接成團(tuán)，形成“肝細(xì)胞/微載體”的基本結(jié)構(gòu)模式。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，其包含的微載體及細(xì)胞數(shù)量增多，體積增大，直至1 mm左右。試驗(yàn)中微載體組培養(yǎng)的細(xì)胞存活時(shí)間為14 d，平面貼壁組培養(yǎng)的細(xì)胞存活時(shí)間為10 d。這說明微載體的培養(yǎng)方式更適合體外肝細(xì)胞的存活。

正常肝細(xì)胞具有分泌白蛋白、合成葡萄糖和尿素的功能，目前這3項(xiàng)功能亦被選作評估肝細(xì)胞活性的主要測定指標(biāo)。測定了10 d內(nèi)兩種培養(yǎng)方式下的肝細(xì)胞白蛋白分泌量、葡萄糖消耗和尿素合成量，兩組在培養(yǎng)的第4～8 d，肝細(xì)胞合成、代謝功能在整個(gè)培養(yǎng)過程中均處于較高水平，第6 d達(dá)峰值。微載體組與平面貼壁組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)微載體黏附培養(yǎng)的肝細(xì)胞保持較長時(shí)間強(qiáng)大的生化功能，說明肝細(xì)胞在微載體上貼附生長、聚集，借助微載體能形成一定的三維結(jié)構(gòu)，從而更好的保持肝細(xì)胞功能及生長，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［15－17］。

肝細(xì)胞微載體粘附懸浮培養(yǎng)，是一種較為理想的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)的模式。微載體肝細(xì)胞粘附培養(yǎng)可望為肝細(xì)胞移植、生物人工肝提供足夠數(shù)量、功能良好的肝細(xì)胞，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

4 結(jié)論

1）以自行建立相對簡化的方法，通過限制性貼壁，定時(shí)手工搖動(dòng)，成功地進(jìn)行了人工肝細(xì)胞的微載體黏附培養(yǎng)。

2）無論是單層平面貼壁培養(yǎng)還是微載體培養(yǎng)，肝細(xì)胞在培養(yǎng)第4～8 d合成及代謝功能及細(xì)胞狀態(tài)均處在一個(gè)較高的水平。培養(yǎng)10 d內(nèi)測定微載體組的葡萄糖、尿素合成和白蛋白分泌能力，均明顯高于單層平面貼壁組。

3）微載體組培養(yǎng)的肝細(xì)胞存活時(shí)間為14 d，平面貼壁組培養(yǎng)的細(xì)胞存活時(shí)間為10 d。

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