模擬失重對(duì)大鼠血液電阻抗譜影響的實(shí)驗(yàn)研究

宮 宇 沈 斌 陳 林 方 云 馬 青

（寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波 3 15211）

引言

在失重環(huán)境下，機(jī)體生理機(jī)能會(huì)受到一定的影響，其中血液系統(tǒng)主要發(fā)生如下變化：血容量減少［1］，紅細(xì)胞、血紅蛋白量減少［2］以及血液流變性的改變［3］。血液系統(tǒng)的這些變化或多或少影響宇航員的健康與工作。因此，對(duì)失重血液學(xué)的研究十分必要。但是，受宇航員數(shù)量、實(shí)驗(yàn)條件、設(shè)備等諸多因素的限制，在地面通常采取大鼠尾部懸吊模擬失重的方法進(jìn)行相關(guān)研究［4］。以往的模擬失重方法多集中于運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)［5］、生殖系統(tǒng)［6］、基因表達(dá)［7］、心血管系統(tǒng)［8］等方面的研究。缺少模擬失重條件下血液電阻抗特性的研究，尤其是利用RC等效電路模型探討血液電學(xué)性能變化。美國和前蘇聯(lián)航天員飛行后紅細(xì)胞和血紅蛋白含量的監(jiān)測(cè)表明：短期飛行6～10 d即出現(xiàn)紅細(xì)胞質(zhì)量和血紅蛋白含量降低，飛行40～60 d下降最多［9］，由此采用60 d尾部懸吊模擬失重。利用大鼠模擬失重模型和血液等效電路模型，研究模擬失重引起血液電學(xué)參數(shù)（電阻率和電容）變化的電生理機(jī)制，為研究模擬失重導(dǎo)致其他組織細(xì)胞電特性改變奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

采用雄性SD大鼠12只，鼠齡為6～8周，體重為210～240 g，由寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按體重質(zhì)量匹配原則隨機(jī)將動(dòng)物分成對(duì)照組（control，CON）和尾部懸吊組（tail suspension，SUS），每組各6只。

1.1.2 主要試劑及儀器

氨基甲酸乙酯（CP，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國）；4294A阻抗分析儀（Agilent Technologies公司，美國）、5415D/5415R離心機(jī)（Eppendorf公司，德國）、Haematokrit 210離心機(jī)（HETTICH公司，德國）。

1.2 大鼠模擬失重實(shí)驗(yàn)

210～240 g雄性SD大鼠12只。SUS組6只大鼠先在吊尾鼠籠內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，再實(shí)施尾部懸吊實(shí)驗(yàn)。SUS組大鼠在吊尾期間，始終保持前肢與籠底接觸，后肢懸空不負(fù)重，身體長(zhǎng)軸與水平面成30°的狀態(tài)。建模時(shí)間為60 d。CON組大鼠不做任何處理，在同一環(huán)境下飼養(yǎng)，可在籠中自由活動(dòng)。兩組動(dòng)物均可自由飲水和進(jìn)食。

1.3 血液采集

吊尾模擬失重結(jié)束時(shí)，SUS組和CON組大鼠均經(jīng)20％氨基甲酸乙酯（5 mL/kg體重）腹腔麻醉，頸動(dòng)脈采血3～5 mL，置于抗凝管中，待電阻抗譜測(cè)量。

1.4 電阻抗譜測(cè)量

電阻抗譜測(cè)量系統(tǒng)由Agilent 4294A阻抗分析儀、42942A適配器、16192A夾具和臺(tái)式計(jì)算機(jī)構(gòu)成。在0.01～100 MHz范圍選取80個(gè)頻率點(diǎn)，每個(gè)頻率點(diǎn)均測(cè)量電阻抗幅模（modulus，|Z|）和相位角（phase angle，φ），得到大鼠血液阻抗的實(shí)部ReZ=|Z|cosφ和虛部Im Z=|Z|sinφ。其復(fù)阻抗Z=|Z|×e－jφ=ReZ+jImZ。每個(gè)頻率點(diǎn)自動(dòng)循環(huán)掃描進(jìn)行3次測(cè)量，取其均值。交流激勵(lì)信號(hào)0.5 V，測(cè)量溫度為室溫（25±1）℃。測(cè)量池（measuring cell）由透明的有機(jī)玻璃圓管兩側(cè)各嵌入兩平行圓型鉑片（Pt電極）制成（見圖1）。測(cè)量池規(guī)格：直徑d=13 mm，電極間距l(xiāng)=10.4 mm，面積S=132.66mm2，容積1.38 mL。每個(gè)血液樣本測(cè)量在1 min內(nèi)完成。

圖1 測(cè)量池示意圖Fig.1 Schematic diagram of measuring cell

1.5 血細(xì)胞壓積測(cè)量

取阻抗測(cè)量后的部分血液注入比容管（長(zhǎng)度75 mm，外徑1.5 mm），用Haematokrit 210微量血液離心機(jī)以9 000 r/min，離心10 min，分別測(cè)量全血長(zhǎng)度（L）與紅細(xì)胞長(zhǎng)度（λ），計(jì)算血細(xì)胞壓積 H ct=（λ/L）×100％，又稱紅細(xì)胞比容（hematocrit，Hct）。

1.6 等效電路模型

圖2為血液等效電路模型［10］。Ro：細(xì)胞外電阻，Co：細(xì)胞外電容，Rm：細(xì)胞膜電阻，Cm：細(xì)胞膜電容，Ri：細(xì)胞內(nèi)電阻，Ci：細(xì)胞內(nèi)電容。細(xì)胞三相（細(xì)胞外相、細(xì)胞膜相和細(xì)胞內(nèi)相）之間關(guān)系：細(xì)胞內(nèi)相與細(xì)胞膜相串聯(lián)后，再與細(xì)胞外相并聯(lián)。血液復(fù)阻抗Z的計(jì)算公式為

圖2 血液等效電路模型Fig.2 The equivalent circuit model of blood

1.7 殘差分析

殘差（residual error）定義

復(fù)阻抗幅摸殘差

復(fù)阻抗相位角殘差

馬克思、恩格斯說：“各民族的原始封閉狀態(tài)由于日益完善的生產(chǎn)方式、交往以及因交往而自然形成的不同民族之間的分工消滅得越是徹底，歷史也就越是成為世界歷史?！盵14]P88歷史和現(xiàn)實(shí)已經(jīng)日益證明了這個(gè)預(yù)言的科學(xué)價(jià)值。學(xué)習(xí)馬克思主義這一思想，就要堅(jiān)持互利共贏的開放戰(zhàn)略，不斷拓展同世界各國的合作，積極參與全球治理，同各國人民一道努力構(gòu)建人類命運(yùn)共同體，把世界建設(shè)得更加美好?！皹?gòu)建人類命運(yùn)共同體”是馬克思主義這一思想在當(dāng)今條件下的新境界。

電阻抗實(shí)部殘差

電阻抗虛部殘差

復(fù)阻抗幅模對(duì)數(shù)殘差：

式中，下標(biāo)max表示n個(gè)頻率點(diǎn)實(shí)測(cè)的最大值，下標(biāo)min表示n個(gè)頻率點(diǎn)實(shí)測(cè)的最小值，fit i為第i個(gè)頻率點(diǎn)對(duì)應(yīng)的擬合數(shù)值。

經(jīng)計(jì)算大鼠血液電阻抗譜電路模型擬合的殘差值如表1。

表1 大鼠血液電阻抗譜電路模型擬合的殘差值（％）Tab.1 There sidualerror（％）of curvefitting for impedance spectra of rat blood with equivalent circuit model

1.8 曲線擬合方法及計(jì)算過程

參見阻抗分析軟件Zview的使用說明書［10］。

2 結(jié)果

2.1 模擬失重對(duì)大鼠紅細(xì)胞壓積的影響

60 d模擬失重大鼠血液的紅細(xì)胞壓積（SUS組）Hct=29.86％±9.10％低于CON組Hct=38.87％±5.00％（P＜0.01），表明模擬失重致大鼠紅細(xì)胞數(shù)量減少。

2.2模擬失重對(duì)大鼠血液Bode圖的影響

圖3是SUS組與CON組大鼠血液Bode圖。圖3（a）是SUS組與CON組大鼠血液電阻抗幅模|Z|與頻率f的關(guān)系曲線，稱為幅－頻特性曲線。兩組動(dòng)物血液的電阻抗幅模|Z|在低頻段（f＜0.1 MHz）基本穩(wěn)定不變，從0.2 MHz頻率開始，|Z|逐步衰減至電阻抗高頻極限值，曲線呈反S型。SUS組|Z|（f）曲線相對(duì)于CON組曲線整體向下移動(dòng)，使阻抗譜向低阻方向變化，導(dǎo)致細(xì)胞外的血漿、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的電阻抗皆降低，其電路模型參數(shù)（見表2）改變：SUS組的細(xì)胞外電阻RO，SUS=185.5Ω·cm小于CON組RO，CON=216 Ω·cm；SUS組的細(xì)胞膜電阻Rm，SUS=0.015 MΩcm小于CON組Rm，CON=100 MΩcm；SUS組的細(xì)胞內(nèi)電阻Ri，SUS=325 Ω·cm小于CON組Ri，CON=330 Ω·cm。幅-頻特性曲線表征了模擬失重大鼠全血（細(xì)胞外、細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)）電阻抗的改變。從表1殘差分析可知，CON組Res（|Z|）=4.28％，SUS組Res（|Z|）=4.85％，擬合效果比較理想。

圖3 模擬失重對(duì)大鼠血液Bode圖的影響。（a）幅頻曲線；（b）相頻曲線Fig.3 Effect of simulated weightlessness on the Bode plot of rat blood.（a）amplitude-frequency curve；（b）phase-frequency curve

2.3 模擬失重對(duì)大鼠血液Nyquist圖的影響

圖4是SUS組與CON組大鼠血液的復(fù)阻抗平面圖，亦稱為Nyquist圖。橫軸為血液阻抗的實(shí)部Re Z=|Z|cosφ，縱軸為阻抗虛部Im Z=|Z|sinφ的負(fù)值。

圖4兩組曲線皆表現(xiàn)右側(cè)圓弧和左側(cè)翹尾特征［10］，右側(cè)圓弧清晰地顯示血細(xì)胞膜β色散幅度變化（ΔRe Z）。兩組比較可得：1）SUS組曲線向左平移、圓弧半徑減小；2）圓弧最高點(diǎn)為復(fù)阻抗虛部峰值Im ZP，SUS組Im ZP，SUS（26.92±9.68）低于CON組Im ZP，CON（36.21±8.24）的25.66％（P＜0.05）；3）SUS組β色散幅度ΔRe ZSUS=（82.95±24.29）Ω·cm小于CON組ΔRe ZCON=（108.61±20.34）Ω·cm的23.63％（P＜0.05）。從表1殘差分析可知，CON組的Res（|ReZ|）=4.28％、Res（Im Z）=8.25％，SUS組Res（|ReZ|）=4.85％、Res（Im Z）=8.98％。

圖4 模擬失重對(duì)大鼠血液Nyquist圖的影響Fig.4 Effect of simulated weightlessness on the Nyquist plot of rat blood

2.4 模擬失重對(duì)大鼠血液Nichols圖的影響

圖5是SUS組與CON組大鼠血液的Nichols圖。橫軸為電阻抗模量的對(duì)數(shù)值lg|Z|，縱軸為相位角φ（弧度）的負(fù)值。此圖同Nyquist圖相類似。兩組比較得出結(jié)果：1）SUS組曲線向左平移、圓弧面積減??；2）圓弧最高點(diǎn)為相位角峰值φP，SUS組數(shù)值（φP，SUS=（0.17±0.04）rad）低于CON組（φP，CON=（0.21±0.03）rad）的23.53％（P＜0.01）；3）曲線交橫坐標(biāo)的右截距為低頻復(fù)阻抗幅摸對(duì)數(shù)（lg|Z|0）：SUS組（lg|Z|0，SUS=（2.26±0.06）Ωcm）比CON組（lg|Z|0，CON=（2.33±0.05）Ωcm）減小3.00％。從表1可知，CON組的Res（φ）=6.47％、Res（lg|Z|））=4.19％，SUS組Res（φ）=6.85％、Res（lg|Z|））=4.57％，擬合效果尚可。

圖5 模擬失重對(duì)大鼠血液Nichols圖的影響Fig.5 Effect of simulated weightlessness on the Nichols plot of rat blood

依據(jù)圖3～圖5的曲線擬合分析，得到模擬失重后大鼠血液電阻抗譜的等效電路參數(shù)，見表2。

表2 模擬失重對(duì)大鼠血液等效電路參數(shù)的影響Tab.2 The effect of simulated weightlessness on equivalent circuit parameters of impedance spectra of rat blood

3 討論和結(jié)論

血液是最基本的組織之一，主要包括紅細(xì)胞和血漿及少量的白細(xì)胞和血小板。紅細(xì)胞是結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的細(xì)胞，屬于不均勻的電介質(zhì)體系，由紅細(xì)胞膜將血液分隔成三相（細(xì)胞外相-細(xì)胞膜相-細(xì)胞內(nèi)相）兩界面（細(xì)胞外液-細(xì)胞膜界面、細(xì)胞膜-細(xì)胞質(zhì)界面），形成具有不同介電常數(shù)和電導(dǎo)率的結(jié)構(gòu)。當(dāng)外加電場(chǎng)作用于血液時(shí)，界面限制電荷的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致電荷積累，在電特性不相同的兩種介質(zhì)間發(fā)生了界面極化現(xiàn)象，稱為Maxwell-Wagner效應(yīng)［11］，此效應(yīng)在交流電磁場(chǎng)作用于生物細(xì)胞時(shí)普遍存在。

隨著外加電場(chǎng)頻率的增加，血液電阻抗頻譜反映細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)的電特性。當(dāng)加載低頻（f＜0.1 MHz）交流電場(chǎng)作用于血液時(shí)，電流將選擇電阻抗小的血漿區(qū)域流動(dòng)，繞過紅細(xì)胞，在細(xì)胞外流過，故低頻段血液電阻抗譜代表細(xì)胞外血漿的電阻抗特性，在圖3a呈現(xiàn)高阻抗的電容阻斷，以及圖3b相位角皆接近為零的血漿電特性。隨著施加于血液的外加電場(chǎng)頻率增至中頻段（f=0.1～10 MHz）時(shí)，細(xì)胞膜電容的容抗將減小，圖3a呈現(xiàn)急劇的阻抗減小過程和圖3b出現(xiàn)山峰變化及圖4、圖5出現(xiàn)半圓弧，故中頻段血液電阻抗頻譜反映血液內(nèi)部紅細(xì)胞膜的電學(xué)特性，呈現(xiàn)出細(xì)胞膜電容充放電過程，其代表性指標(biāo)包括：φP、Im ZP、Δ|Z|、ΔRe Z。隨著施外加電場(chǎng)頻率增至高頻段（f＞10 MHz）時(shí)，電流將穿過細(xì)胞膜流入細(xì)胞內(nèi)液，在圖3a表現(xiàn)為低阻抗的電容性短路狀態(tài)，故高頻段血液電阻抗頻譜代表細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的電阻抗特性。也就是說，血液電阻抗頻譜能夠反映血液內(nèi)部紅細(xì)胞不同部位（細(xì)胞外、細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)）的阻抗和容抗特性隨電場(chǎng)頻率的變化規(guī)律。

在模擬失重條件下，血液電阻抗譜向低阻方向移動(dòng)，使SUS組全血阻抗降低，包括：細(xì)胞外血漿電阻Ro、細(xì)胞膜電阻Rm、細(xì)胞膜電容Cm、細(xì)胞內(nèi)電阻Ri、細(xì)胞內(nèi)電容Ci均低于對(duì)照組，表明尾部懸吊后大鼠血液電阻抗降低，其導(dǎo)電性能增加。其可能原因在于長(zhǎng)期模擬失重（60 d）后，機(jī)體抗氧化物質(zhì)消耗增加，抗氧化能力降低；同時(shí)伴有血液循環(huán)障礙，導(dǎo)致組織缺氧，自由基產(chǎn)生增多［12］，引起紅細(xì)胞膜不穩(wěn)定［13］，紅細(xì)胞膜通透性增加［14］，引起細(xì)胞膜導(dǎo)電率增加，電阻率減低；還由于紅細(xì)胞膜不穩(wěn)定，產(chǎn)生一部分紅細(xì)胞溶解［15］，再加上促紅細(xì)胞生成素減少［16］，引起紅細(xì)胞數(shù)量和質(zhì)量下降［15］，紅細(xì)胞比容（Hct）降低，導(dǎo)致全血導(dǎo)電率增加，電阻率降低。另外，在模擬失重條件下，細(xì)胞內(nèi)電容Ci和細(xì)胞膜電容Cm減小的原因可能與紅細(xì)胞異型性［17］以及紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和變形能力下降有關(guān)［13］。

本研究主要貢獻(xiàn)在于：利用血液等效電路模型分析了血液細(xì)胞外血漿、紅細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白的電導(dǎo)率和電容的降低，引起的模擬失重后血液電特性變化的電生理機(jī)制。

本研究表明，模擬失重使大鼠血液的紅細(xì)胞比容（Hct）明顯降低，紅細(xì)胞膜電阻率顯著降低，導(dǎo)致細(xì)胞外液和全血阻抗降低，導(dǎo)電性增加，阻抗譜向低阻方向移動(dòng)。

血液等效電路模型對(duì)模擬失重大鼠血液電阻抗譜進(jìn)行的擬合分析在低頻段（f＜0.1 MHz）和中頻段（f=0.1～10 MHz）擬合情況較好。在高頻段，由于紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白存在δ弛豫［18］，使得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與等效電路模型擬合效果不如Cole-Cole數(shù)學(xué)模型擬合效果理想［19］。但與家兔血液［20］及小鼠血液［21］相關(guān)特性相比，三者的曲線走勢(shì)基本一致。經(jīng)過曲線擬合建立的模擬失重后大鼠血液等效電路模型電阻抗參數(shù)，能夠反映失重血液對(duì)交變電場(chǎng)阻抗響應(yīng)的規(guī)律和血液頻域電生理學(xué)數(shù)據(jù)特征，具有重要的生理意義，為失重血液生理學(xué)提供一種新的研究手段和電特性指標(biāo)。為等效電路模型應(yīng)用在模擬失重后其他生物細(xì)胞建模也有重要的參考價(jià)值。

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