低氘水聯(lián)合富血小板血漿對糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及TGF-β1表達(dá)的影響

趙超然 王湘琦 熊愛兵

[摘要]目的：觀察低氘水（Deuterium-depleted water，DDW）聯(lián)合富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）對糖尿病大鼠胰島細(xì)胞保護(hù)作用及TGF-β1表達(dá)的影響，初步探討其對保護(hù)糖尿病大鼠胰島細(xì)胞、促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合的可能機(jī)制。方法：通過高糖高脂飼料喂養(yǎng)配合腹腔注射鏈脲菌素（STZ）+背部皮膚全層切除建立糖尿病大鼠潰瘍模型。成模后按隨機(jī)數(shù)字法分為糖尿病模型組、低氘水組（DDW）、富血小板血漿組（PRP）和低氘水聯(lián)合富血小板血漿組（DDW+PRP）。空白對照組采用腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液+背部皮膚全層切除建模。各組大鼠分別于治療后3d、7d、14d檢測隨機(jī)血糖，創(chuàng)面愈合率。胰腺組織HE染色后觀察其病理學(xué)改變，酶聯(lián)免疫吸附法檢測創(chuàng)面組織TGF-β1表達(dá)情況。結(jié)果：DDW組、DDW+PRP組干預(yù)14d后隨機(jī)血糖較干預(yù)前降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。DDW組、PRP組、DDW+PRP組在干預(yù)7d、14d后創(chuàng)面愈合率高于糖尿病模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;DDW+PRP組在干預(yù)14d時(shí)創(chuàng)面愈合率高于DDW組、PRP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。胰島組織學(xué)觀察隨干預(yù)時(shí)間延長，DDW組、DDW+PRP組較前相比，胰島細(xì)胞在形態(tài)、數(shù)量、排列方式、染色顆粒分布情況均有明顯改觀。DDW+PRP組干預(yù)后7d、14d后TGF-β1含量高于DDW組、PRP組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而DDW組、PRP組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：低氘水聯(lián)合富血小板血漿對2型糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面的愈合有顯著促進(jìn)作用，且低氘水對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞具有一定保護(hù)和修復(fù)作用。促進(jìn)創(chuàng)面愈合機(jī)制可能與降低糖尿病大鼠隨機(jī)血糖，改善胰島細(xì)胞功能，提高創(chuàng)面組織中TGF-β1含量有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]低氘水;富血小板血漿;糖尿病;胰島細(xì)胞;潰瘍創(chuàng)面;轉(zhuǎn)化生長因子β1

[中圖分類號(hào)]R587.1? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）06-0101-06

Effects of Deuterium-depleted Water Combined with Platelet-rich Plasma on Islet Cell Protection and TGF-β1 Expression in Diabetic Rats

ZHAO Chao-ran，WANG Xiang-qi，XIONG Ai-bing

（Department of Plastic and Burn Surgery，Affiliated Hospital of Southwest Medical University，National Key Clinical Construction Specialty，Luzhou 646000，Sichuan，China）

Abstract： Objective? To observe the effect of deuterium-depleted water （DDW） combined with platelet-rich plasma （PRP） on the islet cell protection and TGF-β1 expression in diabetic rats， and explore its possible mechanism to protect islet cells of diabetic rats and promote the healing of diabetic ulcer. Methods? The ulcer model of diabetic rats were established by feeding high-sugar and high-fat feed combined with intraperitoneal injection of streptozotocin （STZ）+full-thickness resection of back skin. After modeling， they were divided into diabetes model group， deuterium-depleted water group （DDW）， platelet-rich plasma group （PRP） and deuterium-depleted water combined with platelet-rich plasma group （DDW+PRP） according to random numbers. The blank control group was modeled by intraperitoneal injection of citric acid-sodium citrate buffer+full-thickness resection of the back skin.Rats in each group were tested for random blood glucose and wound healing rate 3d， 7d， 14d after treatment. The pathological changes were observed after HE staining of pancreatic tissue.Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression of TGF-β1 in wound tissue. The pathological changes were observed. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the expression of TGF-β1 in wound tissue. Results? The random blood glucose in the DDW group and DDW+PRP group after 14 days of intervention was lower than before， the difference was statistically significant （P<0.05）. The wound healing rate of the DDW group， PRP group， and DDW+PRP group was higher than the diabetes model group after 7d and 14d intervention （P<0.05）. The wound healing rate of the DDW+PRP group was higher than DDW group and PRP group （P<0.05）， and compared with the blank control group， the difference was not statistically significant （P>0.05）. With the extension of the intervention time， compared with the previous groups， the islet cells in the DDW group and DDW+PRP group were significantly improved in their morphology， number， arrangement， and distribution of stained particles. The content of TGF-β1 in the DDW+PRP group was higher than the DDW group and PRP groups at 7d and 14d after intervention （P<0.05）， but there were no significant difference between the DDW and PRP groups （P>0.05）. Conclusion? Deuterium-depleted water combined with PRP can significantly promote the healing of ulcer wounds in type 2 diabetic rats， and deuterium-depleted water can protect and repair the islet cells of type 2 diabetic rats. The mechanism of promoting wound healing may be related to reducing the random blood glucose of diabetic rats， improving the function of islet cells， and increasing the content of TGF-β1 in the wound tissue.

Key words： deuterium-depleted water; platelet-rich plasma（PRP）; diabetes; islet cells; ulcer wounds;? transforming growth factor-β1

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，目前全球約4.22億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2045年將達(dá)到6.93億[1]。糖尿病患者在病程中可能會(huì)發(fā)展成糖尿病足潰瘍，較小的皮膚傷口可引起慢性難愈性潰瘍，并最終導(dǎo)致感染、壞疽甚至截肢[2]，產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。糖尿病潰瘍創(chuàng)面血管生成受損，生長因子水平下降，募集炎性細(xì)胞到創(chuàng)面的趨化能力降低，創(chuàng)面血管化不良和慢性炎癥狀態(tài)限制了糖尿病足潰瘍的愈合能力[4]。目前治療主要目標(biāo)是閉合傷口。在大多數(shù)情況下，換藥和清創(chuàng)術(shù)在內(nèi)的常規(guī)療法無法獲得令人滿意的結(jié)果，目前迫切需要促進(jìn)糖尿病足潰瘍愈合的新策略[5]。天然水中氘和氫的比例（D/H）約1：6 600，即氘的體積分?jǐn)?shù)為0.015%，通常氘濃度低于0.015%的水稱低氘水（Deuterium-depleted water，DDW）[6]，其抗氧化、抗抑郁、抗腫瘤、降低血糖等生物學(xué)效應(yīng)可用于治療相關(guān)疾病[7-8]。前期學(xué)者報(bào)道低氘水對糖尿病大鼠損傷的胰島β細(xì)胞具有減輕和修復(fù)作用[9]。富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）是全血經(jīng)離心提取出的富含高濃度血小板、白細(xì)胞、纖維蛋白等血小板濃縮物。相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PRP對糖尿病慢性潰瘍創(chuàng)面的愈合有獨(dú)特優(yōu)勢，能顯著促進(jìn)愈合[10]。所以本次實(shí)驗(yàn)擬觀察低氘水聯(lián)合富血小板血漿對2型糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及對潰瘍組織愈合影響。

1? 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康清潔級雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量（180±10）g，由遼寧長生生物股份有限公司提供，許可編號(hào)SCXK（遼）2015-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫20℃～25℃，相對濕度50%～70%條件下。本次研究經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核同意，倫理編號(hào)：2020376。

1.2 主要試劑和儀器：鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）、水合氯醛、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸三鈉（北京索萊寶公司）;大鼠TGF-β1 Elisa試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）;大鼠普通飼料（成都達(dá)碩生物科技有限公司）;大鼠高糖高脂飼料（北京科奧協(xié)力有限公司）;羅試血糖儀+試紙（活力型）;高速冷凍離心機(jī)（eppendorf 德國）;移液器（Finnpipette，20～200μl 上海金瑞科學(xué)儀器有限公司）;電熱恒溫箱（武漢-恒蘇凈科學(xué)儀器有限公司，37℃）;酶標(biāo)儀（Rayto，RT-6100，450nm）;ZMX-998B型酶標(biāo)洗板機(jī);低氘水由瀘州哈羅德健康科技有限公司提供;Image Pro Plus 6.0專業(yè)圖像分析軟件（Media Cybernetics美國）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備：健康清潔級雄性SD大鼠120只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)數(shù)字法分為空白對照組20只，糖尿病組80只，取血組20只（不參與造模及分組）。分別稱取各組大鼠體重，檢測每組大鼠尾靜脈血糖?？瞻讓φ战M大鼠普通飼料喂養(yǎng)4周，糖尿病組大鼠高糖高脂飼料（67%維持飼料+10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+2.5%膽酸鈉）喂養(yǎng)4周。造模前各組大鼠禁食12h，不禁飲。

空白對照組大鼠腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（與糖尿病組等體積），7d后采取斷尾取血法測大鼠隨機(jī)血糖。以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，麻醉后大鼠固定于大鼠固定架，備皮、消毒，背部標(biāo)記后制作面積大小為3cm×3cm創(chuàng)面，創(chuàng)面組織深達(dá)筋膜層，造模成功后隨機(jī)選取18只空白對照組大鼠。數(shù)碼相機(jī)拍照后無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，膠布固定。

糖尿病組大鼠予以單次腹腔注射30mg/kg的1%鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）溶液（0.1mmol/L pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，低溫、避光、臨用前配制），注射后繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)7d。7d后采取斷尾取血法測大鼠隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L標(biāo)志2型糖尿病大鼠模型建立成功。血糖不達(dá)標(biāo)者3d后再次腹腔注射10mg/kg的1%鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）溶液，7d后再次檢測血糖，隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L標(biāo)志造模成功[11]。模型鼠予以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，麻醉后大鼠固定于大鼠固定架，備皮、消毒，背部標(biāo)記后制作面積大小為3cm×3cm創(chuàng)面，創(chuàng)面組織深達(dá)筋膜層。數(shù)碼相機(jī)拍照后無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，膠布固定。將造模成功的72只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為糖尿病模型組、DDW組、PRP組及DDW+PRP組，每組各18只。

1.3.2 富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）的制備：每次從取血組取3～4只SD大鼠，稱重后以7%水合氯醛腹腔注射（0.5ml/100g）麻醉，每只大鼠在直視下從腹主動(dòng)脈取血約10ml，用預(yù)先裝有ACD抗凝劑（1ml檸檬酸葡萄糖溶液）的真空離心管及一次性取血針提取全血，充分搖勻，取1ml全血做血小板計(jì)數(shù)為628×109。采用改良Landesberg法制作富血小板血漿，第1次離心在4℃和200g離心15min，離心后離心管血液分為3層，上層為上清液，中間層富含血小板，下層為紅細(xì)胞層。在富含血小板層與紅細(xì)胞層下方2mm處標(biāo)記，用移液器提取標(biāo)記線上全部液體，轉(zhuǎn)移到另一空白離心管中后搖勻。第2次離心在4℃和500g離心10min，離心后液體分為兩層，上層為貧血小板血漿（Platelet-poor plasma，PPP），下層為含有大量血小板、血漿和少量紅細(xì)胞的混合物即PRP，用移液器移除貧血小板血漿層，剩余即為PRP。經(jīng)全血細(xì)胞計(jì)數(shù)測得血小板計(jì)數(shù)4 163×109。

1.3.3 干預(yù)方法：空白對照組，0.9%氯化鈉溶液灌胃，飲用普通水，潰瘍局部消毒后0.9%氯化鈉溶液紗布包扎;糖尿病模型組，0.9%氯化鈉溶液灌胃，飲用普通水，潰瘍局部消毒后0.9%氯化鈉溶液紗布包扎;DDW組，低氘水灌胃，飲用低氘水，潰瘍局部消毒后0.9%氯化鈉溶液紗布包扎;PRP組，0.9%氯化鈉溶液灌胃，飲用普通水，潰瘍局部消毒后涂抹PRP再用無菌紗布包扎;DDW+PRP組，低氘水灌胃，飲用低氘水，潰瘍局部消毒后涂抹PRP再用無菌紗布包扎。大鼠灌胃劑量均為0.01ml/g/d。各組大鼠均單只單籠飼養(yǎng)，潰瘍創(chuàng)面換藥1次/天，PRP隔日涂抹于潰瘍創(chuàng)面（劑量為100μl每個(gè)創(chuàng)面），更換清潔墊料1次/天。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 隨機(jī)血糖：各組大鼠造模成功后，分別在未干預(yù)，干預(yù)后3d、7d、14d采用斷尾取血法檢測隨機(jī)血糖水平。

1.4.2 創(chuàng)面愈合率：分別于造潰瘍創(chuàng)面后（未干預(yù)），干預(yù)后3d、7d、14d對創(chuàng)面采取圖像，使用Image Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析軟件測量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=（干預(yù)前創(chuàng)面面積-干預(yù)后創(chuàng)面面積）/干預(yù)前創(chuàng)面面積×100%。

1.4.3 胰腺組織觀察：分別于造潰瘍創(chuàng)面后3d、7d、14d，各組抽簽法隨機(jī)選取6只大鼠，麻醉后迅速摘取完整胰腺組織，4%甲醛固定、脫水、石蠟包埋切片、蘇木精-伊紅染色、封固，普通光學(xué)顯微鏡下觀察胰島組織病理學(xué)改變。

1.4.4 潰瘍創(chuàng)面組織TGF-β1的檢測：分別于造潰瘍創(chuàng)面后3d、7d、14d，各組隨機(jī)選取6只大鼠，測隨機(jī)血糖后麻醉，取潰瘍創(chuàng)面及創(chuàng)周5mm組織2～3塊。立即置入液氮降溫，放入-80℃冷凍保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測潰瘍創(chuàng)面組織中TGF-β1表達(dá)量，過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況及體質(zhì)量變化：空白對照組大鼠反應(yīng)靈敏，精神好，毛發(fā)光澤，皮脂厚，體重增長快。與空白對照組相比，糖尿病模型鼠毛發(fā)粗糙，光澤度下降，色黃，易脫落，出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)度差，抓起時(shí)排便反射明顯，體重增長慢。

2.2 各組大鼠血糖水平變化：空白對照組、糖尿病模型組、PRP組大鼠隨機(jī)血糖在干預(yù)3d、7d、14d與干預(yù)前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;DDW組、DDW+PRP組大鼠在低氘水干預(yù)后隨機(jī)血糖開始緩慢下降，干預(yù)14d時(shí)與干預(yù)前相比隨機(jī)血糖降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3 各組創(chuàng)面大體情況及創(chuàng)面愈合率比較：干預(yù)3d，各組大鼠大體觀察創(chuàng)面無明顯縮小，部分大鼠創(chuàng)面可見散在皮島，創(chuàng)緣見不同程度滲出、水腫及少量出血，糖尿病模型組大鼠部分創(chuàng)緣間隙下可見少許膿性分泌物;干預(yù)7d，各組大鼠創(chuàng)面縮小肉眼可見，部分創(chuàng)面覆蓋薄層痂殼，創(chuàng)面可見少許肉芽組織，滲出、水腫較前相比均有不同程度改觀，皮島數(shù)量較前增多，空白對照組程度最高，糖尿病模型組最低，隨著時(shí)間推移各組大鼠創(chuàng)面均在逐步愈合;干預(yù)14d，空白對照組、DDW組、PRP組、DDW+PRP各組創(chuàng)面顯著縮小，創(chuàng)面滲出、水腫明顯消退，部分創(chuàng)面干燥結(jié)痂，愈合良好。糖尿病模型組大鼠創(chuàng)面明顯縮小，創(chuàng)面仍有少量滲出，創(chuàng)面水腫較前減輕，愈合程度低于其他各組。見圖1。

干預(yù)3d時(shí)，糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP各組創(chuàng)面愈合率均明顯低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;DDW+PRP組創(chuàng)面愈合率高于糖尿病模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;糖尿病模型組、DDW組、PRP組兩兩比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組愈合順序?yàn)榭瞻讓φ战M>DDW+PRP組>PRP組>DDW組>糖尿病模型組。

干預(yù)7d時(shí)空白對照組創(chuàng)面愈合率高于糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;糖尿病模型組創(chuàng)面愈合率低于DDW組、PRP組、DDW+PRP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;DDW組、PRP組、DDW+PRP組兩兩比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組愈合順序?yàn)榭瞻讓φ战M>DDW+PRP組>PRP組>DDW組>糖尿病模型組。

干預(yù)14d時(shí)空白對照組創(chuàng)面愈合率高于糖尿病模型組、DDW組、PRP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;糖尿病模型組創(chuàng)面愈合率低于DDW組、PRP組、DDW+PRP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;DDW+PRP組創(chuàng)面愈合率高于DDW組、PRP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;DDW+PRP組創(chuàng)面愈合率雖低于空白對照組，但兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），此時(shí)創(chuàng)面愈合率達(dá)到高峰。各組愈合順序?yàn)榭瞻讓φ战M>DDW+PRP組>PRP組>DDW組>糖尿病模型組。見表2、圖2。

2.4 各組大鼠胰島組織學(xué)改變：大鼠胰腺組織HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察，空白對照組大鼠胰島數(shù)量多，未見胰島破壞，胰島細(xì)胞數(shù)量多，且排列均勻緊密，細(xì)胞之間界限清楚，細(xì)胞質(zhì)均勻淡染，胞核清晰呈橢圓形，核仁可見。干預(yù)后3d，糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP組與空白對照組相比，胰島數(shù)量減少，體積變小，邊界不清，部分可見毛細(xì)血管基膜下玻璃樣變物質(zhì)沉著，島內(nèi)細(xì)胞排列稀疏，胞漿空泡樣變增多，細(xì)胞質(zhì)著色淺，胞核固縮，部分細(xì)胞核脫失，染色質(zhì)分布不均、邊集。

干預(yù)后7d，DDW組、DDW+PRP組較前干預(yù)前相比，胰島細(xì)胞數(shù)量稍增加，體積縮小，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)較干預(yù)前有所改觀，細(xì)胞間邊界較前清晰，胞漿空泡樣變減少，染色顆粒分布稍有改觀，胰島周圍淋巴細(xì)胞浸潤減少。

干預(yù)后14d，DDW組、DDW+PRP組較前干預(yù)前相比，胰島細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞排列均勻，邊界清晰可見，胞漿空泡樣變明顯減少，胞質(zhì)均勻淡染，胞核清晰，染色質(zhì)分布均勻，胰島周圍淋巴細(xì)胞浸潤減少。隨干預(yù)時(shí)間延長，胰島細(xì)胞在形態(tài)、數(shù)量、排列方式、染色顆粒分布情況均有明顯改觀。

干預(yù)后3d、7d、14d，糖尿病模型組、PRP組大鼠胰島組織受損較重、胰島細(xì)胞體積增大，細(xì)胞間排列明顯紊亂、邊界不清，多數(shù)胞漿呈空泡樣變或疏松網(wǎng)狀，染色顆粒分布不均，部分細(xì)胞核固縮、脫失，胰島周圍淋巴細(xì)胞浸潤較多，較前相比均無明顯改觀。見圖3～4。

2.5 對各組大鼠創(chuàng)面組織TGF-β1的影響：糖尿病模型組、DDW組、PRP組、DDW+PRP組大鼠創(chuàng)面組織中TGF-β1含量在3d、7d、14d均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而DDW組、PRP組及DDW+PRP組大鼠在干預(yù)后3d、7d、14d含量較糖尿病模型組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PRP組在干預(yù)后3d與DDW組相比含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在干預(yù)后7d、14d兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DDW+PRP組在干預(yù)后3d與PRP組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;DDW+PRP組在干預(yù)后7d、14d創(chuàng)面組織中TGF-β1含量較DDW組、PRP組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3，圖5。

3? 討論

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程，包括初期損傷及快速止血期、炎癥期、增殖期、成熟期等階段，在正常機(jī)體協(xié)調(diào)下愈合過程呈高度有序性及完整性[12]。糖尿病創(chuàng)面延遲愈合與神經(jīng)血管病變及多種生長因子低表達(dá)相關(guān)，胰島素抵抗及高血糖狀態(tài)進(jìn)一步延遲愈合。PRP是全血經(jīng)離心提取出的富含高濃度血小板、白細(xì)胞、纖維蛋白等血小板濃縮物?；罨蟮难“寤罨擃w粒釋放TGF-β、PDGF、IGF、EGF、VEGF等多種生長因子，其相互協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化，加速血管生成及組織修復(fù)[13]。近期研究證實(shí)在創(chuàng)面愈合受損的組織中TGF-β1表達(dá)下降[1]，與這些觀察結(jié)果一致，本次觀察到糖尿病模型組大鼠創(chuàng)面組織TGF-β1的低表達(dá)，PRP組、DDW組糖尿病大鼠TGF-β1蛋白表達(dá)水平升高，與同期糖尿病模型組相比，創(chuàng)面肉芽組織生成增多，滲出、水腫消退較快，創(chuàng)面愈合率顯著提升。且DDW+PRP聯(lián)合干預(yù)組大鼠與單一干預(yù)組相比，TGF-β1表達(dá)量、創(chuàng)面愈合率屬同期最高。目前已發(fā)現(xiàn)TGF-β1參與了創(chuàng)傷愈合的各個(gè)過程，如細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的合成、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)和成纖維細(xì)胞的分化。在皮膚損傷后活性TGF-β1能刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，其特點(diǎn)是與受損前相比α-SMA的高表達(dá)[14]。此外，TGF-β1協(xié)同促進(jìn)成纖維細(xì)胞對膠原的收縮，從而加速傷口愈合[15]。Tsai等[16]報(bào)道激活后的PRP內(nèi)含大量纖維蛋白，相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成生物支架，牽拉創(chuàng)緣向創(chuàng)面中心移動(dòng)，使修復(fù)過程快速而有效。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氘水干預(yù)后的大鼠，TGF-β1蛋白水平、創(chuàng)面愈合率均升高，與富血小板血漿干預(yù)組相比兩者差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

低氘水具有抗氧化，抗抑郁，抗腫瘤，降低血糖等一系列生物學(xué)效應(yīng)，可用于治療相關(guān)疾病[7-8]。Zlatska等[17]發(fā)現(xiàn)DDW對離體人真皮成纖維細(xì)胞的增殖能力具有刺激作用，具有更高的增殖潛能。研究表明[7]DDW能提高12周齡Wistar-Kyoto大鼠胰島素水平并降低血液中甘油三酯、膽固醇水平。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)飲用DDW的大鼠血漿中糖蛋白總量及其糖基化程度均顯著降低[18]。周振宇等[9]發(fā)現(xiàn)低氘白酒能降低糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高空腹血清胰島素水平;組織學(xué)觀察顯示低氘白酒具有減輕及修復(fù)損傷的胰島β細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)低氘水干預(yù)的糖尿病大鼠TGF-β1蛋白水平上升，創(chuàng)面愈合率與糖尿病模型組相比升高，愈合速度加快，在14d時(shí)隨機(jī)血糖下降明顯。推測可能與減輕胰島素抵抗、增加胰島素分泌有關(guān)。胰腺組織HE染色顯示，隨干預(yù)時(shí)間的推進(jìn)，胰島細(xì)胞在形態(tài)、數(shù)量、排列方式、染色顆粒分布情況均有不同程度改觀。說明低氘水具有保護(hù)及修復(fù)受損胰島細(xì)胞，降低糖尿病大鼠隨機(jī)血糖水平，加速糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合。本次實(shí)驗(yàn)DDW組、PRP組在TGF-β1蛋白水平、創(chuàng)面愈合率，兩者差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而DDW+PRP組在TGF-β1蛋白表達(dá)上提升最明顯，在干預(yù)14d時(shí)與DDW組、PRP組相比創(chuàng)面愈合程度最高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上，低氘水聯(lián)合富血小板血漿能降低2型糖尿病大鼠隨機(jī)血糖水平，對胰島細(xì)胞具有一定保護(hù)和修復(fù)作用，能顯著促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面的愈合，可能與提高創(chuàng)面組織中TGF-β1蛋白含量有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

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[收稿日期]2020-11-05

本文引用格式：趙超然，王湘琦，熊愛兵.低氘水聯(lián)合富血小板血漿對糖尿病大鼠胰島細(xì)胞的保護(hù)作用及TGF-β1表達(dá)的影響[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（6）：101-106.