CNV-Seq技術(shù)在產(chǎn)前診斷胎兒Williams-Beuren綜合征中的應(yīng)用

紀(jì)藝珍 許亞松

廈門大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院廈門市婦幼保健院產(chǎn)前診斷科 363100

Williams-Beuren綜合征（WBS）的患病率估計(jì)在1/20 000～1/7 500之間。是一種罕見的由7q11.23微缺失引起的遺傳性疾?。?］。主要臨床表現(xiàn)為生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、輕中度智力低下（IQ 20～106不等）；行為上常表現(xiàn)為較高的社交能力、個(gè)性友善、焦慮、認(rèn)知能力障礙、空間視覺構(gòu)建能力缺陷；絕大多數(shù)患者伴有心血管異常，多為早期高血壓，先天性主動(dòng)脈瓣上狹窄；特殊面容（包括頭型度長(zhǎng)、眼距增寬、內(nèi)眥贅皮、長(zhǎng)人中、鼻孔朝前、嘴唇突出、眶周豐滿）；內(nèi)分泌異常，包括糖耐量受損、糖尿病，1/3的患者伴有甲狀腺功能和結(jié)構(gòu)異常；偶有患者伴有聲帶麻痹、高鈣血癥。廈門市婦幼保健院近年產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)2例胎兒WBS，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 病例資料

1.1 臨床資料（1）例1，孕婦，29歲，孕1產(chǎn)0，孕婦平素月經(jīng)規(guī)則，孕期順利，無特殊不適。無放射線、毒物、藥物接觸史，無抽煙、嗜酒史，無胎兒畸形家族史。否認(rèn)近親結(jié)婚，否認(rèn)輔助生殖。早孕期彩超提示胎兒頸項(xiàng)透明層（NT）1.3 mm，行胎兒染色體非整倍體檢測(cè)提示低風(fēng)險(xiǎn)。孕26周彩超提示胎兒雙頂徑、腹圍小于同孕周2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，估計(jì)胎兒體質(zhì)量560 g，小于同孕周第10百分位數(shù)；要求產(chǎn)前診斷就診本科。（2）例2，孕婦，30歲，孕3產(chǎn)1，生育過一個(gè)健康足月兒，人工流產(chǎn)1次。孕婦平素月經(jīng)規(guī)則，孕期順利，無特殊不適。無放射線、毒物、藥物接觸史，無抽煙、嗜酒史，無胎兒畸形家族史。否認(rèn)近親結(jié)婚，否認(rèn)輔助生殖。早孕期彩超提示胎兒NT 1.36 mm，行產(chǎn)前血清學(xué)篩查低風(fēng)險(xiǎn)。孕26+1周彩超提示胎兒局部腸管回聲增強(qiáng)，胎兒永存左上腔靜脈，主動(dòng)脈弓偏細(xì)（內(nèi)徑約0.16 cm），左心偏小（左、右房室大小不對(duì)稱，左心房?jī)?nèi)徑0.9 cm，右心房?jī)?nèi)徑1.4 cm，左心室內(nèi)徑0.6 cm，右心室內(nèi)徑0.9 cm）；要求產(chǎn)前診斷就診本科。

1.2 檢測(cè)方法（1）G顯帶核型分析。超聲下進(jìn)行臍血管穿刺術(shù)抽取臍血3 ml，取2 ml標(biāo)本進(jìn)行臍血細(xì)胞培養(yǎng)，按常規(guī)方法制片，G顯帶分析。同時(shí)采集胎兒父母的外周血進(jìn)行常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)和G顯帶分析。顯微鏡下計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相，分析5個(gè)細(xì)胞核型，對(duì)異常核型增加分析數(shù)，根據(jù)人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際（ISCN2016）命名體制描述染色體異常核型。（2）高通量低深度全基因組測(cè)序（CNV-seq）提取臍血及其父母外周血的基因組DNA，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建；通過片段化-連接、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）前純化、PCR擴(kuò)增、PCR后純化一系列過程，利用Next Seq CN500高通量測(cè)序平臺(tái)行CNV-seq檢測(cè)，并進(jìn)行測(cè)序分析，常規(guī)進(jìn)行STR連鎖分析進(jìn)行母血污染鑒定，測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)的CNVs與國(guó)際基因組CNVs多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)DGV、表型數(shù)據(jù)庫(kù)和人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)UCSC進(jìn)行比對(duì)及結(jié)果致病性分析及描述診斷。

1.3 檢測(cè)結(jié)果 染色體G顯帶結(jié)果顯示核型結(jié)果均為46，XN，核型無明顯異常。CNV-seq結(jié)果提示，病例1胎兒seq［GRch37］del（7q11.23 q11.23）chr7：g.72650120-74209678del，檢 出7q11.23q11.23區(qū)域約1.5Mb的缺失。病例2胎兒seq［GRch37］del（7q11.23 q11.23）chr7：g.72535448-74310510del；檢 出7q11.23q11.23區(qū)域約1.78 Mb的缺失。見圖1、2。

圖1 病例1胎兒低深度全基因組測(cè)序（CNV-seq）結(jié)果

2 討 論

WBS（OMIM 194050）是一種多系統(tǒng)性神經(jīng)發(fā)育障礙，由跨越28個(gè)基因的7q11.23染色體上的1.5～1.8 Mb半合子缺失引起。其發(fā)病機(jī)制是由于在配子形成過程中的細(xì)胞分裂期，在細(xì)胞分裂的過程中染色體不能準(zhǔn)確排列，染色體配對(duì)成分不能正常交叉重組。若父母為染色體平衡易位攜帶者，在減數(shù)分裂期間可因不平衡分離而形成染色體部分缺失的配子，在與另一正常配子受精后即形成雜合性缺失的合子［1-2］。99%的WBS為新發(fā)缺失變異，1%的病例由于父母其中一方的染色體平衡易位引發(fā)。7q11.23缺失區(qū)域內(nèi)包含致病基因彈性蛋白基因（ELN）、LIM激酶1（LIMK1）、含GTF2I重復(fù)域1（GTF2IRD1）、普通轉(zhuǎn)錄因子2I（GTF2I）等25～27個(gè)基因的雜合性缺失，導(dǎo)致相應(yīng)的臨床表型［3］。ELN基因的單倍型不足被證明是造成瓣膜主動(dòng)脈狹窄和全身性動(dòng)脈病等心血管疾病的原因，少數(shù)較大或較小缺失的病例報(bào)道跨越著絲?；蚨肆^(qū)域，其中多數(shù)包括ELN基因。而LIMK1，細(xì)胞質(zhì)連接蛋白2（CLIP2），GTF2IRD1和GTF2I基因則被認(rèn)為與特定的認(rèn)知特征和顱面特征有關(guān)。Ferrero等［4］報(bào)道了1例智商正常的非典型7q11.23缺失患者。該病例在WBS基因組間隔中缺失約1 Mb。通過熒光原位雜交法（FISH）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（qPCR）進(jìn)行缺失定位，發(fā)現(xiàn)該患者在著絲粒和端粒兩側(cè)的重排都比經(jīng)典的缺失短。細(xì)胞遺傳學(xué)和分子分析表明，先證者的缺失不包含了基因復(fù)制因子C2（RFC2），CLIP2，GTF2IRD1和GTF2I。而著絲粒斷裂點(diǎn)位于鎮(zhèn)靜域鄰接鋅指域1B（BAZ1B）基因的內(nèi)含子3和4之間。Ashe等［5］發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎發(fā)生過程中，BAZ1B在顱神經(jīng)衍生的間充質(zhì)中強(qiáng)烈表達(dá)，從而驅(qū)動(dòng)面部形態(tài)發(fā)生。編碼的蛋白質(zhì)水平降低是一系列顱面特征的來源，類似于典型的WBS患者所顯示的特征，例如鼻梁上翹，鼻梁平坦，微乳頭畸形（或下頜骨發(fā)育不全），錯(cuò)牙合畸形，顳葉狹窄和突出前額。GTF2IRD1基因的半合子性與WBS的面部特征和空間視覺構(gòu)建能力（VSC）缺陷有關(guān)，而GTF2I基因的半合子性在WBS社交行為的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。并且GTF2IRD1和GTF2I基因?qū)τ赪BS認(rèn)知功能至關(guān)重要。GTF2I，GTF2IRD1和GTF2IRD2屬于TFII-I基因轉(zhuǎn)錄因子家族。它們與多種蛋白質(zhì)和DNA相互作用，因此可能影響廣泛的神經(jīng)生理和發(fā)育過程。GTF2I充當(dāng)基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子，與各種啟動(dòng)子的啟動(dòng)子元件結(jié)合，并響應(yīng)上游信號(hào)事件，通過增強(qiáng)子處的E-box元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。GTF2IRD1可以結(jié)合與組織發(fā)育和分化有關(guān)的基因上游的調(diào)節(jié)元件。Enkhmandakh等［6］在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)GTF2IRD1和GTF2I基因的完全敲除表明，這些基因雜合的小鼠通常生長(zhǎng)遲緩，下頜骨發(fā)育不全，以及其他顱面缺陷，從側(cè)面反映了GTF2IRD1和GTF2I基因與WBS個(gè)體的特征性面部外觀和牙齒問題的相關(guān)性。Kopp等［7］研究發(fā)現(xiàn)在妊娠中期小鼠大腦中，GTF2IRD1結(jié)合的靶點(diǎn)富含轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑和泛素介導(dǎo)物，而GTF2I結(jié)合的靶點(diǎn)富含信號(hào)傳導(dǎo)蛋白，包括磷酸化和WNT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)劑。同時(shí)這些靶點(diǎn)富含突觸蛋白和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，其中包含大量已知的自閉癥系譜障礙基因的染色質(zhì)修飾劑。Chen等［8］研究發(fā)現(xiàn)紋狀體，海馬和杏仁核是胎兒發(fā)育早期和晚期7q11.23區(qū)段基因編碼蛋白與其相關(guān)因子之間相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。此外該研究還發(fā)現(xiàn)GTF2I通過與DNA依賴性蛋白激酶催化亞基（PRKDC）和乳腺癌1型易感性蛋白（BRCA1）相互作用，在動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Zhang等［1］通過產(chǎn)前診斷SNP陣列分析了18例7q11.21區(qū)段從517 kb到605 kb的7q11.21微缺失的相似患者，并得出結(jié)論認(rèn)為7q11.21缺失（chr7：64543313-65196780）可能是良性的，并且與人類疾病無關(guān)［1］。研究中該區(qū)域內(nèi)包括ZNF92其余基因是假基因INTS4L1，INTS4L2和RSL24D1P3。所有胎兒均未顯示與ZNF92、INTS4L1、INTS4L2或RSL24D1P3相關(guān)的異常表型。

圖2 病例2胎兒低深度全基因組測(cè)序（CNV-seq）結(jié)果

目前檢測(cè)基因片段缺失的技術(shù)包括FISH、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)、qPCR、染色體微陣列分析（CMA）、CNV-seq等［9-10］。與其他技術(shù)相比，CNV-seq檢測(cè)可以更加精確地在全基因組范圍內(nèi)掃描檢測(cè)染色體的微缺失和微重復(fù)，分辨率高達(dá)30 kb。WBS患者的染色體缺失片段＜2 Mb，傳統(tǒng)的染色體G顯帶核型分析難以檢出，故診斷率較低，因此，國(guó)內(nèi)關(guān)于此病的報(bào)道也較少。隨著CNV-seq檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的廣泛應(yīng)用，越來越多的WBS患兒在產(chǎn)前可以明確診斷。產(chǎn)前超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常是進(jìn)行CNV-seq檢查的適應(yīng)證［2］，應(yīng)在胎兒染色體核型分析正常的基礎(chǔ)上進(jìn)一步行CNV-seq檢測(cè)。吳東等［11］通過對(duì)7例WBS的研究發(fā)現(xiàn)最常見的超聲特征是宮內(nèi)發(fā)育遲緩（82.35%）和先天性心血管異常（58.82%）。心血管缺陷的表現(xiàn)主要包括：瓣上主動(dòng)脈瓣狹窄、室間隔缺損、主動(dòng)脈縮窄和周圍肺動(dòng)脈狹窄。因此在產(chǎn)前檢查中同樣需要提高對(duì)產(chǎn)前超聲檢查結(jié)果的認(rèn)識(shí)和警惕性，關(guān)注WBS相關(guān)的超聲指標(biāo)異常，作為進(jìn)一步檢查確診WBS的重要線索和依據(jù)。

2例患兒父母染色體及CNV-Seq均正常，因而患兒屬于新發(fā)的微缺失。WBS為常染色體顯性遺傳性疾病，但幾乎所有患者的染色體變異是父親或母親生殖細(xì)胞形成、減數(shù)分裂中的新發(fā)突變，多為散發(fā)［12］。本病雖然發(fā)病率不高，但患兒可能會(huì)給家庭帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)與精神的雙重打擊，也給社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，因此對(duì)此類胎兒一定要引起充分重視。對(duì)于既往此類不良孕史患者再次妊娠時(shí)建議做產(chǎn)前診斷，且采用分辨率達(dá)到能夠檢測(cè)該微缺失水平的檢測(cè)手段。本報(bào)道病例通過用CNV-seq技術(shù)在產(chǎn)前明確診斷出WBS，也進(jìn)一步證實(shí)了CNV-seq技術(shù)作為一線技術(shù)應(yīng)用在臨床的效果，真實(shí)有效地評(píng)價(jià)了該技術(shù)的診斷水平。