鮑群麗 萬淑瓊 黃耿 汪宏良 柯俊 尚小玲鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)檢驗(yàn)科 45000;鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)婦科 45000;鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院(湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院)泌尿外科 45000
宮頸癌是世界上女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一,復(fù)發(fā)率高且較易轉(zhuǎn)移,嚴(yán)重威脅女性健康[1]。研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制,為宮頸癌治療提供有效的分子靶點(diǎn)是目前臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類非編碼單鏈RNA,長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸[2]。lncRNA在肺癌、膀胱癌、宮頸癌、黑色素瘤等各種腫瘤中表達(dá)上調(diào)或下調(diào),與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖、侵襲等行為有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn),SNHG15-210是一種由953個(gè)核苷酸組成的lncRNA,其在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌因子作用[4]。SNHG15-210對(duì)宮頸癌細(xì)胞的作用尚未明了。本研究主要研究SNHG15-210對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)制,以期為宮頸癌的靶向治療提供新的方向。
1.1 細(xì)胞與主要試劑 宮頸癌細(xì)胞SIHA購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù);CCK-8試劑盒購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司;pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210質(zhì)粒購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司;Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine 3000購(gòu)于美國(guó)Life Technologies公司;結(jié)晶紫購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記的免疫球蛋白G(IgG)二抗購(gòu)于美國(guó)CST公司。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將SIHA細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SIHA細(xì)胞接種于24孔板,根據(jù)Lipofectamine 3000試劑說明書將pcDNA-NC、pcDNA-SNHG15-210質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SIHA細(xì)胞,分別記為NC組和SNHG15-210組,轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。
1.3 qRT-PCR檢測(cè)SNHG15-210、細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑1A(CDKN1A)信使RNA(mRNA)表達(dá) 采用TRIzol試劑提取SIHA細(xì)胞RNA,合成cDNA后按照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行反應(yīng),引物序列如下。CDKN1A引物正向序列:5’-TGTCCGTCAGAACCCATGC-3’,反 向 序 列:5’-AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC-3’;GAPDH引物正向序列:5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,反 向 序 列:5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’;SNHG15-210引物正向序列:5’-GGGACCTGACCTGAGAGAAGAT-3’,反向序列:5’-GGTGCCAAGGCTTGCATTCA-3’。以GAPDH為SNHG15-210和CDKN1A mRNA的內(nèi)參基因,按照2-ΔΔCt法計(jì)算SNHG15-210、CDKN1A mRNA的表達(dá)。
1.4 CCK-8法檢測(cè)SIHA細(xì)胞增殖情況 將處理后的SIHA細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按照每孔3×103個(gè)接種至96孔板,每孔加入25μl CCK-8試劑,培養(yǎng)4 h,于酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm處的吸光度(OD)值。每組采用4個(gè)復(fù)孔,分別在第1天、第2天、第3天、第4天進(jìn)行CCK-8法檢測(cè),實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。
1.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SIHA細(xì)胞增殖能力 將處理后的SIHA細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按照每孔3×103個(gè)接種至6孔板,培養(yǎng)10 d后,用甲醇溶液固定細(xì)胞,用0.1%結(jié)晶紫溶液染色,用流水洗去殘余染液,觀察并計(jì)數(shù)集落形成數(shù)。每組采用4個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。
1.6 Western blot檢測(cè)CDKN1A蛋白的表達(dá) 向處理后的SIHA細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液,提取總蛋白,取50μg蛋白樣品上樣,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂牛奶封閉3 h,分別加入稀釋后的一抗孵育過夜,加入IgG二抗孵育2 h,加入ECL顯影液顯影、拍照。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料符合正態(tài)分布,均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 各組SIHA細(xì)胞中SNHG15-210的表達(dá) 如圖1,SIHA細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,NC組和SNHG15-210組SIHA細(xì)胞中SNHG15-210的表達(dá)分別為(1.14±0.37)和(11.69±2.62),SNHG15-210組相比NC組上調(diào)了10.25倍(t=3.99,P<0.01)。
圖1 NC組和SNHG15-210組中SNHG15-210的表達(dá)
2.2 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞增殖活性的影響 與NC組相比,SNHG15-210組SIHA細(xì)胞在第2、3、4天時(shí)增殖活性均有下降趨勢(shì)(均P<0.05),表明SNHG15-210過表達(dá)抑制宮頸癌SIHA細(xì)胞增殖活性(圖2)。
圖2 高表達(dá)SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞增殖能力的影響
2.3 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞集落形成能力的影響 NC組和SNHG15-210組集落形成數(shù)分別為(162.30±14.92)個(gè)和(61.55±12.31)個(gè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.21,P<0.01),提示SNHG15-210過表達(dá)可抑制宮頸癌SIHA細(xì)胞的集落形成(圖3)。
圖3 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞集落形成的影響
2.4 SNHG15-210對(duì)CDKN1A mRNA表達(dá)的影響 如圖4,NC組和SNHG15-210組SIHA細(xì)胞中CDKN1A mRNA的 表 達(dá) 分 別 為(1.02±0.11)和(6.23±1.16),表 明SNHG15-210可升高CDKN1A mRNA的表達(dá)(t=4.50,P<0.01)。
圖4 SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞CDKN1A mRNA表達(dá)的影響
2.5 SNHG15-210對(duì)CDKN1A蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果(圖5)表明,與NC組相比,SNHG15-210組SIHA細(xì)胞CDKN1A蛋白表達(dá)增加,細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表達(dá)降低。
圖5 高表達(dá)SNHG15-210對(duì)SIHA細(xì)胞CDKN1A蛋白表達(dá)的影響
研究發(fā)現(xiàn),lncRNA異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5]。lncRNA如PTCSC3[6]、PTENP1[7]可通過上調(diào)抑癌基因的表達(dá),降低宮頸癌的增殖、遷移和侵襲能力。lncRNA如SOX2OT[8]、EWSAT1[9]可通過上調(diào)癌基因的表達(dá),促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。Liu等[4]研究顯示,SNHG15-210在甲狀腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),與患者臨床分期、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān),SNHG15-210過表達(dá)可抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,SNHG15-210在甲狀腺癌中起腫瘤抑制作用。SNHG15-210在宮頸癌細(xì)胞中的作用尚不明了。本研究顯示,過表達(dá)SNHG15-210可明顯抑制宮頸癌SIHA細(xì)胞的增殖能力,SNHG15-210在宮頸癌細(xì)胞中表現(xiàn)為抑癌因子作用。
CDKN1A蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑,通過與細(xì)胞周期蛋白依賴蛋白激酶相結(jié)合,負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)展[10]。CDKN1A蛋白在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)、凋亡、衰老等發(fā)明發(fā)揮重要作用[11]。CDKN1A蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織,上調(diào)CDKN1A基因表達(dá)可明顯抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖[12]。本研究顯示,過表達(dá)SNHG15-210后SIHA細(xì)胞中CDKN1A基因表達(dá)顯著增加,提示SNHG15-210可促進(jìn)CDKN1A的表達(dá)。本研究顯示,SNHG15-210促進(jìn)CDKN1A表達(dá)后,SIHA細(xì)胞中細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1和Cyclin D2表達(dá)降低,表明SIHA細(xì)胞的增殖活性降低。
綜上所述,SNHG15-210可能通過促進(jìn)CDKN1A基因表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖活性,提示SNHG15-210有望成為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。
利益沖突:作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。
國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)2021年22期