氣滯血瘀型肝癌用藥規(guī)律分析及核心藥對作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

梁子成，龍依萍，張?jiān)?，黃曉蒂，陳泓秀，文 璐，田雪飛，田 莎

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率居世界前列，且預(yù)后普遍較差[1]。目前肝癌的首選治療方法是化學(xué)療法與免疫治療，但仍存在不可忽視的缺陷[2]。因此，尋求安全有效的抗肝癌藥物極為迫切。肝癌在中醫(yī)學(xué)歸屬于“伏梁”“積聚”范疇，其可因外邪入侵、飲食內(nèi)傷、情志因素所致，與氣血津液代謝密切相關(guān)[3]。中醫(yī)藥治療肝癌具有療效顯著、不良反應(yīng)小等優(yōu)勢[4]。中醫(yī)將肝癌分為5個(gè)證型，其中氣滯血瘀證是最主要的證型，通常貫穿肝癌全病程[5]。氣滯血瘀既是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，也是影響肝癌病程進(jìn)展的病理因素。氣為血之帥，能生血、能行血，故氣滯可致使血瘀；且肝主疏泄，氣滯可致使肝郁，肝郁可加重肝病程度。血為氣之母，能載氣、養(yǎng)氣，故血瘀可致使氣機(jī)循環(huán)失暢；血可濡養(yǎng)臟器筋脈，血瘀可致使肝臟失濡養(yǎng)，故血瘀可加重肝病。中醫(yī)對于氣滯血瘀證與肝癌的關(guān)系尤為重視，因而治療氣滯血瘀型肝癌方藥及報(bào)道諸多，然對于治療氣滯血瘀型肝癌的用藥規(guī)律尚不統(tǒng)一。本研究采用數(shù)據(jù)挖掘的方法對收集到的治療氣滯血瘀型肝癌的用藥處方進(jìn)行分析，探討中醫(yī)治療氣滯血瘀型肝癌的用藥規(guī)律，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討關(guān)鍵藥物組合治療肝癌的潛在機(jī)制，以期為臨床治療和理論研究提供可靠參考。

1 資料與方法

1.1 中藥處方來源中藥處方通過在中國知網(wǎng)、維普、萬方數(shù)據(jù)庫輸入“肝癌氣滯血瘀”“氣滯血瘀證”“肝癌”“中藥”“中藥治療”“中醫(yī)治療”等關(guān)鍵詞聯(lián)合檢索獲得。通過題名和摘要瀏覽進(jìn)行初篩，全文瀏覽進(jìn)一步精篩獲得初步數(shù)據(jù)，后根據(jù)資料納入與剔除標(biāo)準(zhǔn)獲得符合要求方劑95首。

1.2 資料篩選

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）公開發(fā)表的包含中藥治療氣滯血瘀型肝癌的文獻(xiàn)報(bào)道；（2）報(bào)道處方完整，有明確中藥組成，確切劑量，處方藥物組成符合氣滯血瘀型肝癌證候治療需求；（3）報(bào)道療效確切。

1.2.2 剔除標(biāo)準(zhǔn)（1）排除綜述、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、理論探討所得方劑；（2）排除采用單味藥方劑、單用或合并中成藥治療報(bào)道，如斑蝥膠囊等；（3）排除聯(lián)合中醫(yī)其他治法的報(bào)道，如艾灸、針刺等；（4）排除服藥方式非內(nèi)服報(bào)道，如敷貼等；（5）重復(fù)發(fā)表取其一，同藥物組成且同劑量而異名的處方取其一。

1.3 處方藥物名稱規(guī)范為排除因藥物別名、炮制方法、藥物劑型等對后續(xù)分析產(chǎn)生干擾，根據(jù)《中華人民共和國藥典》[6]（2015版）、《中藥學(xué)》[7]對處方藥物的名稱進(jìn)行規(guī)范化處理，如洋火葉、仙靈脾、淫羊藿統(tǒng)一為淫羊藿，姜半夏、法半夏、半夏統(tǒng)一為半夏，附片、附子統(tǒng)一為附子。

1.4 資料錄入核對與分析將“1.2”及“1.3”處理后的方劑錄入中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5），為確保信息準(zhǔn)確完整錄入，由兩人對輸入前文件進(jìn)行反復(fù)檢查，輸入過程中交替進(jìn)行并兩人監(jiān)督。錄入完成后請第三人對錄入結(jié)果進(jìn)行檢查。數(shù)據(jù)錄入完成后，運(yùn)用“數(shù)據(jù)分析”“統(tǒng)計(jì)報(bào)表”系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 關(guān)鍵藥物組合治療肝癌的機(jī)制分析從TCMSP數(shù)據(jù)庫、TCMID數(shù)據(jù)庫以O(shè)B≥30%、DL≥0.18獲取藥物成分，聯(lián)合Pubchem數(shù)據(jù)庫和SwissTargetprediction數(shù)據(jù)庫獲得新處方作用靶點(diǎn)（https://tcmspw.com/tcmsp.php、http://www.megabionet.org/tcmid/、https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.swisstarget prediction.ch/）。關(guān)鍵藥物組合作用靶點(diǎn)與GEO數(shù)據(jù)庫GSSE121248芯片的差異基因取交集獲得治療肝癌的潛在靶點(diǎn)。利用STRING平臺（https://string-db.org/）進(jìn)行蛋白互作分析，借助DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析，使用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2 結(jié) 果

2.1 用藥頻數(shù)≥15的中藥對過濾后的95首方劑進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì)分析，獲得頻數(shù)≥15的中藥29味。（見表1）四氣以寒[37.79%（506/1 339）]、溫[34.21%（458/1 339）]、平[24.50%（328/1 339）]為主，五味以苦[35.61%（745/2 092）]、甘[30.98%（648/2 092）]、辛[24.33%（509/2 092）]為主，歸經(jīng)以肝[20.26%（743/3 668）]、脾[19.22%（705/3 668）]、胃[13.55%（497/3 668）]為主。（見圖1）

表1 用藥頻數(shù)≥15的中藥

圖1 藥物的性味歸經(jīng)分析結(jié)果

2.2 處方規(guī)律分析應(yīng)用平臺進(jìn)行處方規(guī)律分析，獲得用藥頻數(shù)≥18的藥物組合23個(gè)（見表2），提取置信度≥0.6的組合關(guān)聯(lián)規(guī)則信息（見表3），并將關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)可視化（見圖2）。結(jié)合表2～3分析結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，“紅花-桃仁”組合頻數(shù)居前列且置信度最高，故將“紅花-桃仁”組合定義為關(guān)鍵藥物組合。

表2 用藥頻數(shù)≥18的藥物組合

表3 處方中藥物組合的關(guān)聯(lián)規(guī)則（置信度≥0.6）

圖2 關(guān)聯(lián)規(guī)則網(wǎng)絡(luò)可視化

2.3 基于復(fù)雜熵聚類的核心組合分析復(fù)雜系統(tǒng)熵聚類[8]（相關(guān)系數(shù)=5，懲罰系數(shù)=2）分析獲得，核心組合共計(jì)13個(gè)。（見表4）

表4 核心組合的復(fù)雜熵聚類分析結(jié)果

2.4 新處方的無監(jiān)督的熵層次聚類分析提取“2.3”結(jié)果，通過無監(jiān)督的熵層次聚類分析獲得新方相關(guān)核心組合8個(gè)，新處方4個(gè)。（見表5～6）

表5 新處方聚類核心組合

表6 治療氣滯血瘀型肝癌的新處方

2.5 “紅花-桃仁”治療肝癌的機(jī)制分析

2.5.1 肝癌的差異基因表達(dá)及“紅花-桃仁”治療肝癌的潛在靶點(diǎn)蛋白互作分析 從GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE121248芯片分析獲得差異基因（見圖3A），與“紅花-桃仁”作用靶點(diǎn)取交集獲得“紅花-桃仁”組合治療肝癌的潛在靶點(diǎn)（見圖3B）。經(jīng)STRING平臺蛋白互作分析后利用Cytoscape 3.8.0軟件CytoNCA插件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示靶點(diǎn)CDK1、CCNA2、AURKA、TOP2A、AURKB、KIF11、CDC25C、CHEK1、TTK、WEE1居前十位。（見圖3C）

圖3 “紅花-桃仁”治療肝癌的潛在靶點(diǎn)獲取及蛋白互作分析

2.5.2 潛在靶點(diǎn)的富集分析結(jié)果 利用DAVID 6.8對治療潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能與KEGG通路富集分析。（見圖4）GO靶點(diǎn)功能分析包括生物過程（BP）、細(xì)胞定位（CC）與分子功能（MF）。GO功能分析結(jié)果顯示潛在靶點(diǎn)的生物過程富集結(jié)果主要在類固醇代謝過程（steroid metabolic process）、氧化還原過程（oxidation-reduction process）、對藥反應(yīng)（response to drug）等；細(xì)胞定位富集結(jié)果主要在胞質(zhì)溶膠（cytosol）、核質(zhì)（nucleoplasm）、細(xì)胞器膜（organelle membrane）等；分子功能富集結(jié)果主要與藥物結(jié)合（drug binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）等相關(guān)。KEGG通路富集結(jié)果顯示潛在靶點(diǎn)主要參與HIF-1信號通路、p53信號通路、PPAR信號通路、TNF信號通路等。

圖4 潛在靶點(diǎn)的富集結(jié)果

2.5.3 “紅花-桃仁”治療肝癌的“藥物-成分-靶點(diǎn)-通路”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape軟件構(gòu)建“紅花-桃仁”治療肝癌的前20條通路的多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)包含130個(gè)節(jié)點(diǎn)與499條邊，其中成分33個(gè)，前20條通路相關(guān)潛在靶點(diǎn)75個(gè)。（見圖5）

圖5 藥物-成分-靶點(diǎn)-通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討 論

肝癌是指發(fā)生在肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的惡性腫瘤，其發(fā)生多伴隨有結(jié)節(jié)、腫塊等病理產(chǎn)物，與中醫(yī)“癌腫”“癥瘕”相合[9-10]。氣滯血瘀證是肝癌的常見證型，在肝癌發(fā)生的全過程都可出現(xiàn)[5]。氣滯血瘀的發(fā)生可導(dǎo)致一系列臨床癥狀的出現(xiàn)，氣滯可阻滯血絡(luò)，則瘀血內(nèi)生，又可逆阻痰氣，致使痰瘀互結(jié)，聚于脅下，日久呈積；肝主疏泄，氣機(jī)阻滯，肝氣不疏，木橫侮土，脾失健運(yùn)，痰濕內(nèi)生。瘀血可因氣滯而成，又可加重氣滯，瘀血內(nèi)阻可化熱內(nèi)灼，耗氣傷陰，敗血痰濕煎灼可生內(nèi)毒，熱毒熏灼膽汁可致發(fā)黃；瘀血堵絡(luò)，津液代謝失運(yùn)，瘀血水濕互結(jié)可致鼓脹[11-12]。由此可見，氣滯血瘀可致氣血水濕互結(jié)，毒熱內(nèi)灼，加重患者病情，故對肝癌的氣滯血瘀證的合理施治尤為重要。

本研究篩選獲得治療氣滯血瘀型肝癌的方劑95首，共227味中藥，其中使用頻數(shù)≥15的中藥29味，即補(bǔ)氣藥：白術(shù)、甘草、黃芪、黨參；理氣藥：枳殼、香附、陳皮、枳實(shí)；活血藥：桃仁、丹參、莪術(shù)、郁金、紅花、川芎、穿山甲、延胡索、三棱；補(bǔ)血藥：當(dāng)歸、白芍；清熱藥：白花蛇舌草、赤芍、牡丹皮、半枝蓮；補(bǔ)陰藥：鱉甲；消食藥：雞內(nèi)金；利水滲濕藥：茯苓、茵陳、薏苡仁；解表藥：柴胡。以上藥物分類體現(xiàn)了氣滯血瘀型肝癌用藥的重點(diǎn)在于調(diào)理氣血，其治法在于“理氣活血以化瘀、補(bǔ)益氣血以生新”。95首方劑中227味中藥的性味歸經(jīng)分析結(jié)果顯示，藥物以寒性、溫性、平性藥物為主，苦味、甘味、辛味藥物居多，入肝經(jīng)、脾經(jīng)、胃經(jīng)藥物占比較大?？嗪⒏蕼乜汕鍩?、除熱，氣滯血瘀型肝癌瘀血內(nèi)阻，熱毒內(nèi)盛，清熱除熱可減少氣陰耗損、內(nèi)息毒熱；熱毒損耗氣陰，而甘寒可養(yǎng)陰，使氣血化生有源；辛味可助發(fā)散、行氣、行血，利于氣滯血瘀證的治療，由此可見性味分析用藥結(jié)果的合理性。中藥多入肝經(jīng)、脾經(jīng)、胃經(jīng)，病在肝體，久病必然折損肝體，入肝經(jīng)之藥既可補(bǔ)益肝體，又可助肝之疏泄等功能恢復(fù)。入脾胃經(jīng)利于健脾益氣、運(yùn)化痰濕，可針對性地治療氣血水互結(jié)病機(jī)。因而高頻組合與核心組合多以苦寒、入肝經(jīng)藥物組成，其亦是中醫(yī)治療氣滯血瘀型肝癌的清熱化瘀、補(bǔ)肝體治法思想體現(xiàn)。新處方（4）尤為體現(xiàn)這一思想，其主要藥物與《醫(yī)林改錯(cuò)》的血府逐瘀湯極為相似。以生地黃清熱涼血，牛膝引瘀血下行，桔梗行氣載藥，桃仁、紅花活血祛瘀，白術(shù)益氣化痰飲水濕，然牛膝又可補(bǔ)肝腎，生地黃可滋陰養(yǎng)血[13]。這與古代中醫(yī)名家治療思想相合，故所得新處方可對當(dāng)代臨床用藥提供較良好參考。

針對“紅花-桃仁”組合治療肝癌的機(jī)制探索發(fā)現(xiàn)位居前十的潛在靶點(diǎn)分別為CDK1、CCNA2、AURKA、TOP2A、AURKB、KIF11、CDC25C、CHEK1、TTK、WEE1。LIU H M等[14]通過運(yùn)用miR-1271-5p靶向CDK1可抑制細(xì)胞增殖、改變細(xì)胞周期分布并增強(qiáng)肝癌細(xì)胞系的放射敏感性。JIN X H等[15]研究發(fā)現(xiàn)抑制AURKA-mTOR-eIF4E軸、降低AURKA表達(dá)可在肝癌細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用。CAI H等[16]通過分析腫瘤組織與癌旁組織發(fā)現(xiàn)TOP2A在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示TOP2A的表達(dá)水平與肝癌病程進(jìn)展與不良預(yù)后相關(guān)。其余部分靶點(diǎn)亦存在與肝癌相關(guān)的報(bào)道。潛在靶點(diǎn)的通路富集主要與HIF-1信號通路、p53信號通路、PPAR信號通路、TNF信號通路等相關(guān)?，F(xiàn)有的研究表明HIF-1信號通路、p53信號通路、PPAR信號通路、TNF信號通路與肝癌細(xì)胞凋亡、腫瘤代謝、腫瘤炎癥免疫及疾病預(yù)后密切相關(guān)，針對性地干預(yù)相關(guān)通路可有效阻斷疾病進(jìn)程[17-21]。

綜上所述，本課題組通過檢索各大數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的臨床研究報(bào)道，建立了中醫(yī)藥治療氣滯血瘀型肝癌的處方數(shù)據(jù)庫，借助中醫(yī)傳承輔助平臺進(jìn)行分析總結(jié)其用藥規(guī)律，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探索關(guān)鍵藥物組合治療肝癌的潛在機(jī)制。