白藜蘆醇調(diào)控LINC00460/TWIST1抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲遷移的研究*

蔡 皞，歐陽(yáng)佳，王 磊，任年軍

（1.湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013；2.吐魯番市人民醫(yī)院，新疆 吐魯番 838000）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤又被稱為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），是成人最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，約占原發(fā)性腦腫瘤的17%[1]。GBM細(xì)胞往往易于浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，并侵襲周?chē)恼ＤX組織，因此被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的類(lèi)型[2]。這種侵襲性表型是導(dǎo)致GBM治療失敗和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要原因[3]。因此，進(jìn)一步解析GBM這種高侵襲性表型的潛在機(jī)制，針對(duì)性開(kāi)發(fā)新的治療方法將有望使患者生存獲益。

白藜蘆醇（resveratrol）是存在于葡萄、漿果、花生和葡萄酒中的一種具有丁苯結(jié)構(gòu)的天然多酚[4]。同時(shí)，白藜蘆醇也是多種中藥材的有效成分，如虎杖、買(mǎi)麻藤、甘松等。多項(xiàng)研究證實(shí)，白藜蘆醇具有心血管保護(hù)、抗炎、抗衰老等生物活性[5-6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)多種類(lèi)型的癌癥顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤活性。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一個(gè)動(dòng)態(tài)的細(xì)胞生物過(guò)程，以細(xì)胞失去上皮樣特性轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型為基本特征，在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合和組織重塑等過(guò)程中起到了關(guān)鍵調(diào)控作用[7]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明[8]EMT參與到腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，與腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移密切相關(guān)。這提示EMT可能與GBM細(xì)胞的高侵襲性存在關(guān)聯(lián)。研究表明[9-11]，白藜蘆醇可對(duì)EMT的發(fā)生起調(diào)節(jié)作用，但具體調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明。LINC00460是在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA基因[12]。有研究顯示LINC00460能調(diào)控EMT影響非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移[13]。我們發(fā)現(xiàn)LINC00460的表達(dá)可被白藜蘆醇抑制。因此，本研究以高侵襲轉(zhuǎn)移能力的U87MG-trans為細(xì)胞模型，探討白藜蘆醇對(duì)GBM細(xì)胞表型的影響，并考察其具體分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器GBM細(xì)胞系U87MG購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，批號(hào)：3131C0001000700138。U87MGtrans為課題組前期通過(guò)Transwell侵襲小室構(gòu)建的高侵襲轉(zhuǎn)移能力的U87MG亞群[14]。胎牛血清（批號(hào)：16000044）、DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：12800017）、胰酶（批號(hào)：25200056）（Gibco公司）；TRIzol（Invitrogen公司，批號(hào)：15596026）；PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，批號(hào)：RR047A）；SYBRRPremix Dimer－EraserTM試劑（TaKaRa公司，批號(hào)：RR091Q）；Matrigel（BD公司，批號(hào)：356234）；ECL化學(xué)發(fā)光液（Thermo公司，批號(hào)：34094）。Forma 371型CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司）；HCB-900V型超凈工作臺(tái)（海爾）；ST16R型離心機(jī)（Thermo公司）；K3型酶標(biāo)儀（Thermo公司）；PowerPac型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（Bio-rad公司）；IX73型顯微鏡（奧林巴斯）；LightCycler 480 II Real-Time PCR系統(tǒng)（Roche公司）。

1.2 在線數(shù)據(jù)分析 利用GEPIA2.0在線數(shù)據(jù)庫(kù)的生存分析模塊分析TCGA-GBM數(shù)據(jù)集中候選基因的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。通過(guò)PEARSON相關(guān)分析模塊，分析TCGA-GBM表達(dá)數(shù)據(jù)集中目標(biāo)分子間的表達(dá)相關(guān)性。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清（FBS）DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)體系中添加1%的青霉素-鏈霉素，培養(yǎng)條件為恒溫37℃的含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90%匯合時(shí)采用胰酶消化，以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至50%匯合時(shí)，采用濃度為0、20、40 μmol/L的白藜蘆醇孵育細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MTT實(shí)驗(yàn) 采用MTT測(cè)定細(xì)胞活力。接種細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，使用白藜蘆醇孵育細(xì)胞36h。將20μL MTT（5mg/mL）加入到每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔中孵育4 h。棄去上清液后加入DMSO，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度。

1.5 RNA提取和實(shí)時(shí)定量qPCR實(shí)驗(yàn) 使用TRIzol法裂解細(xì)胞并提取總RNA。根據(jù)PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBRRPremix DimerEraserTM試劑盒在LightCycler 480ⅡReal-Time PCR系統(tǒng)上檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平，相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。引物序列為GAPDH-F：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；GAPDH-R：5’-TATCGGACGCCTGGTTAC-3’；LINC00460-F：5’-ACATC GGAGGTACCCAGACA-3’，LINC00460-R：5’-GAAAGCTGCAACATGCTCCC-3’。

1.6 Transwell及劃痕實(shí)驗(yàn) 將含有2×103個(gè)細(xì)胞的懸浮液接至涂有包被了Matrigel（以1∶7稀釋?zhuān)┑腡ranswell小室中。底部小室內(nèi)加入600 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。孵育48 h后，將Transwell小室在4%多聚甲醛中固定20 h，用結(jié)晶紫染色20 h，并使用顯微鏡計(jì)數(shù)穿透小室的細(xì)胞數(shù)量。在每個(gè)樣品隨機(jī)選擇5個(gè)區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量。

提前1 d將細(xì)胞接種于6孔板，待其生長(zhǎng)至100%匯合。用槍頭垂直于細(xì)胞平面，沿著直尺進(jìn)行劃痕，PBS清洗掉從細(xì)胞板上脫落的細(xì)胞后，更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基。開(kāi)始記時(shí)，分別于0、24 h在顯微鏡下觀察并測(cè)量劃痕的寬度，并拍照。

1.7 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)樣品取20 μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。使用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，TBST清洗10 min×3次。一抗（1∶1 000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBST）于4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗10 min×3次。二抗（1∶1 000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBST）室溫孵育1 h，TBST清洗10 min×3次。使用ECL化學(xué)發(fā)光液與膜孵育3 min，進(jìn)行曝光拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 7進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示。兩組之間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LINC00460在高侵襲性GBM細(xì)胞中高表達(dá) 我們首先檢測(cè)了不同亞群細(xì)胞里L(fēng)INC00460的表達(dá)水平（見(jiàn)圖1），LINC00460在高侵襲轉(zhuǎn)移能力GBM細(xì)胞亞群U87MG-trans中高表達(dá)，提示該lncRNA可能與GBM細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有關(guān)。通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析發(fā)現(xiàn)，LINC00460高表達(dá)的GBM患者總生存期較短（見(jiàn)圖2）。

圖1 LINC00460在高侵襲轉(zhuǎn)移的GBM細(xì)胞中高表達(dá)s，n=3）

圖2 LINC00460高表達(dá)與GBM患者預(yù)后不良相關(guān)分析

2.2 白藜蘆醇抑制U87MG-trans細(xì)胞的侵襲遷移MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)使用白藜蘆醇處理細(xì)胞時(shí)，U87MG-trans細(xì)胞存活率與U87MG細(xì)胞比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)圖3）Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇濃度的增加，細(xì)胞侵襲和遷移的能力均被抑制，且呈劑量依賴性。（見(jiàn)圖4）

圖3 白藜蘆醇對(duì)GBM細(xì)胞增殖的影響s，n=3）

圖4 白藜蘆醇對(duì)GBM細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響s，n=3）

2.3 白藜蘆醇抑制LINC00460的表達(dá)并阻止EMT發(fā)生 我們檢測(cè)了白藜蘆醇作用下LINC00460的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，白藜蘆醇孵育可導(dǎo)致LINC00460表達(dá)降低。（見(jiàn)圖5）通過(guò)在線數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，LINC00460與EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TWIST1的表達(dá)在TCGA-GBM表達(dá)數(shù)據(jù)集中顯著正相關(guān)（見(jiàn)圖6，相關(guān)系數(shù)R=0.48，P=1.3e-10）。進(jìn)一步通過(guò)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可抑制LINC00460表達(dá)，過(guò)表達(dá)抑制的增加，TWIST1和間充質(zhì)樣標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)顯著下調(diào)，上皮樣標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)顯著上調(diào)。（見(jiàn)圖7）

圖5 白藜蘆醇抑制GBM細(xì)胞中LINC00460的表達(dá)s，n=3）

圖6 在TCGA-GBM數(shù)據(jù)集中LINC00460與TWIST的表達(dá)顯著正相關(guān)

圖7 白藜蘆醇對(duì)EMT相關(guān)蛋白的影響

2.4 過(guò)表達(dá)LINC00460可部分恢復(fù)白藜蘆醇對(duì)GBM細(xì)胞的抑制作用 在GBM細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LINC00460過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LINC00460上調(diào)了5.7倍。（見(jiàn)圖8A）進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在白藜蘆醇處理的細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LINC00460過(guò)表達(dá)質(zhì)?？刹糠只謴?fù)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力（見(jiàn)圖8B、8C），提示白藜蘆醇通過(guò)抑制LINC00460的表達(dá)阻止EMT發(fā)生，進(jìn)而影響GBM細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖8 過(guò)表達(dá)LINC00460逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇（40 μmol/L）對(duì)GBM細(xì)胞侵襲遷移的抑制作用

3 討 論

高侵襲性生長(zhǎng)是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的重要特征，也由此使得GBM患者的預(yù)后較差。因此，必須找到針對(duì)GBM細(xì)胞這種特性的合適藥物。與常規(guī)化療藥物相比，中藥處方往往副作用較少[15]。中藥在腫瘤輔助治療中也展示了一定的治療效果[16]。此外，多種抗腫瘤藥物為提取自植物中天然活性成分。例如從長(zhǎng)春花葉中提取的長(zhǎng)春新堿，治療急性淋巴細(xì)胞白血病、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤非常有效[17]。紫杉醇是從紅豆杉中直接提取出來(lái)的一種具有抗癌活性的二萜生物堿類(lèi)化合物，廣泛應(yīng)用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等的治療[18-19]。然而，中醫(yī)藥及其活性提取物是否能應(yīng)用于GBM的治療仍研究較少。

EMT通常在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中被激活，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。HUANG P等[20]研究表明，GBM細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能會(huì)經(jīng)歷EMT過(guò)程，從而獲得更好的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性。白藜蘆醇被證明能夠抑制GBM細(xì)胞增殖并增加細(xì)胞死亡率[21-22]。近期有研究證明，白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的EMT抑制胰腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移[11,23]。但是，白藜蘆醇是否可以抑制GBM細(xì)胞中的EMT，從而降低其侵襲遷移能力尚未完全明確。在本研究中，我們的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠抑制GBM細(xì)胞的侵襲遷移，且在此過(guò)程中伴隨著間充質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin的下調(diào)和上皮樣細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的上調(diào)，提示白藜蘆醇對(duì)EMT的調(diào)控影響了細(xì)胞的侵襲、遷移能力。為了進(jìn)一步考察白藜蘆醇抑制GBM侵襲遷移的分子機(jī)制，我們進(jìn)行了分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn)，LINC00460在高侵襲轉(zhuǎn)移能力的GBM細(xì)胞亞群中顯著上調(diào)，且其表達(dá)可被白藜蘆醇顯著抑制。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，EMT關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TWIST在GBM中的表達(dá)與LINC00460的表達(dá)顯著正相關(guān)，推測(cè)TWIST是LINC00460的下游基因。結(jié)合蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)白藜蘆醇可通過(guò)抑制LINC00460表達(dá)，下調(diào)TWIST從而抑制EMT，最終降低GBM細(xì)胞的侵襲、遷移能力。為證明這一推測(cè)，我們繼續(xù)進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，上調(diào)LINC00460表達(dá)可部分恢復(fù)白藜蘆醇對(duì)GBM細(xì)胞侵襲遷移能力的抑制作用，這與預(yù)期一致。本研究并未闡明白藜蘆醇抑制LINC00460表達(dá)的具體分子機(jī)制。目前已知白藜蘆醇的直接作用靶點(diǎn)包括PTGS1、CSNK2A1、NQO2、PTGS2等，其對(duì)LINC00460的抑制作用是通過(guò)這些直接靶點(diǎn)來(lái)間接調(diào)控，抑或是LINC00460能夠直接與白藜蘆醇藥物分子發(fā)生直接作用，仍需進(jìn)一步研究。另外，TWIST1是EMT發(fā)生的重要轉(zhuǎn)錄因子，我們的結(jié)果推測(cè)它是LINC00460的下游基因，其具體分子機(jī)制也需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明。

綜上所述，白藜蘆醇可抑制GBM細(xì)胞的侵襲、遷移能力。白藜蘆醇的這一作用是通過(guò)抑制LINC00460表達(dá)，從而下調(diào)TWIST介導(dǎo)的EMT來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果可為白藜蘆醇運(yùn)用于GBM的治療提供理論基礎(chǔ)。