鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)2BS細(xì)胞早期衰老的保護(hù)作用

李 娜，馬玉潔，劉 楠，王珊珊，周德慶

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 山東青島 266071）

魚(yú)鰾，又名花膠或魚(yú)肚，以其膠原蛋白含量極高而著稱(chēng)，自古以來(lái)因各種功效顯著而受到頗多消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-2]。相關(guān)研究報(bào)道，通過(guò)酶解魚(yú)鰾制備的多肽具有較高的抗氧化活性[3-4]。對(duì)氧化與衰老的關(guān)系，有研究表明，提高機(jī)體抗氧化能力是延緩衰老的最佳途徑之一[5]。與傳統(tǒng)抗氧化劑相比，來(lái)自海洋生物的新型肽，因具有高抗氧化活性，更好的生物相容性和更低的毒性而受到越來(lái)越多的關(guān)注[6-7]。對(duì)多肽與延緩機(jī)體衰老的關(guān)系探討成為近年的研究熱點(diǎn)。

生物體的衰老發(fā)生在機(jī)體的每一個(gè)層面，包括從細(xì)胞、組織到器官。細(xì)胞是生命的基本組成單位，細(xì)胞衰老被認(rèn)為是人類(lèi)衰老的基礎(chǔ)。細(xì)胞衰老分為早期衰老與復(fù)制性衰老兩種。復(fù)制性衰老即細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生端?？s短的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞分裂能力減弱。早期衰老是當(dāng)細(xì)胞遭受外界干擾發(fā)生永久不可逆的增殖停滯現(xiàn)象。在衰老相關(guān)模型的研究中，人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞往往被選為模式細(xì)胞種類(lèi)，而且通過(guò)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞建立早期衰老細(xì)胞模型更易于體外模擬衰老進(jìn)程的研究[8-9]。本研究通過(guò)建立H2O2誘導(dǎo)的2BS 細(xì)胞早期衰老細(xì)胞模型，檢測(cè)細(xì)胞的增殖率、細(xì)胞凋亡情況與β-半乳糖苷酶含量等衰老相關(guān)指標(biāo)，探討鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)早熟性細(xì)胞衰老進(jìn)程的影響。同時(shí)檢測(cè)ROS 活性氧水平與抗氧化酶含量等，探討其可能通過(guò)對(duì)抗氧化系統(tǒng)的保護(hù)作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞早期衰老進(jìn)程的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱈魚(yú)鰾（凍鮮品），平均質(zhì)量10.44 g/只，由青島海洋兄弟食品有限公司提供。人胚胎肺二倍體成纖維細(xì)胞（2BS 細(xì)胞），江蘇凱基生物科技股份有限公司。

復(fù)合蛋白酶、ROS 活性氧試劑盒、Hoechst 染色試劑盒、β-半乳糖苷酶試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；SOD、CAT、MDA 試劑盒，南京建成生物公司。

可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多（上海）有限公司；倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；智能活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)，美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鱈魚(yú)鰾膠原肽的制備 將鱈魚(yú)鰾原料解凍后洗凈，剪成0.5 cm×0.5 cm 的小塊，加入10 倍體積0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液，于4 ℃條件下攪拌溶脹48 h 后，除去非膠原成分的雜蛋白。洗凈后加入10 倍體積蒸餾水勻漿，將pH 值調(diào)至中性，按100 U/mL 比例加入復(fù)合蛋白酶，于55 ℃水浴條件下酶解4 h，于100 ℃水浴加熱10 min 滅酶活，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到鱈魚(yú)鰾膠原肽，命名為SWP[10]。

1.2.2 2BS 細(xì)胞的培養(yǎng) 使用含有10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的MEMNEAA 培養(yǎng)基培養(yǎng)2BS 細(xì)胞，于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，傳代。調(diào)整細(xì)胞含量至2×104/mL，取90 μL，加入96 孔板中制成2×103/孔的細(xì)胞懸液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)96 孔板單孔中細(xì)胞密度達(dá)到50%時(shí)，加入不同質(zhì)量濃度的SWP（800，400，200，100，50，10 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后采用cck-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，評(píng)價(jià)SWP 的細(xì)胞毒性篩選適宜的給藥濃度[11]。

細(xì)胞增殖率（%） =（OD藥物-OD藥物對(duì)照）/（OD空白-OD空白對(duì)照）×100

1.2.3 H2O2誘導(dǎo)2BS 細(xì)胞早期衰老細(xì)胞模型的建立 細(xì)胞培養(yǎng)方法同上。使用不同濃度的H2O2誘導(dǎo)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期2BS 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后，檢測(cè)不同濃度鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)細(xì)胞增殖率的影響，細(xì)胞增殖率計(jì)算方法同上。

1.2.4 ROS 活性氧水平測(cè)定 本試驗(yàn)共分6 組，空白對(duì)照組（無(wú)H2O2，不給藥）、氧化誘導(dǎo)模型組（含H2O2，不給藥）和藥物干預(yù)組（含H2O2，給藥）。以10 μmol/L 白藜蘆醇（Res）為陽(yáng)性對(duì)照。誘導(dǎo)完成后藥物干預(yù)組各加入10 μL 不同濃度的藥物，對(duì)經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中原位裝載探針的方法將10 μL 稀釋1 000 倍的DCFH-DA 探針加入處理過(guò)的細(xì)胞中，于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min 后，用不含胎牛血清的MEM-NEAA 培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，加入100 μL PBS，用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)每組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為525 nm，同時(shí)使用智能活細(xì)胞成像分析系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞狀態(tài)進(jìn)行熒光拍照[12]。

1.2.5 Hoechst 33258 染色 試驗(yàn)分組同上。采用6 孔板培養(yǎng)2BS 細(xì)胞。將H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入固定液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，洗去固定液，加入預(yù)先用PBS 稀釋的Hoechst 33258 染色液。置室溫3～5 min 后洗去染色液，用顯微鏡觀(guān)察。激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm[13]。

1.2.6 β-半乳糖苷酶含量測(cè)定 試驗(yàn)分組及細(xì)胞處理方式同上。將H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，加入固定液，室溫固定15 min。用PBS 洗滌細(xì)胞，按比例加入染色工作液，6孔板四周用parafilm 膜封好，于37 ℃恒溫箱中過(guò)夜。24 h 后吸出染色液，加入PBS，用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，細(xì)胞中有藍(lán)色物質(zhì)生成的為表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞，隨機(jī)抽取5 個(gè)區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)[14]。

1.2.7 過(guò)氧化物酶含量測(cè)定 試驗(yàn)分組同上。采用25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)2BS 細(xì)胞。處理后的細(xì)胞用胰酶消化，超聲破碎，收集細(xì)胞液，檢測(cè)蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)SOD、CAT 以及MDA含量[15]。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 安全性評(píng)價(jià)結(jié)果

細(xì)胞增殖試驗(yàn)可反應(yīng)受試物的細(xì)胞毒性，可通過(guò)該試驗(yàn)對(duì)鱈魚(yú)鰾膠原肽的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。已知細(xì)胞毒性的評(píng)判等級(jí)可分為5 級(jí)：0 級(jí)：增殖率≥100%；I 級(jí)：增殖率75%～99%；II 級(jí)：增殖率50%～74%；III 級(jí)：增殖率25%～49%；IIII 級(jí)：增殖率1%～24%；V 級(jí)：0。結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度10～800 μg/mL 鱈魚(yú)鰾膠原肽的細(xì)胞增值率均超過(guò)100%，說(shuō)明鱈魚(yú)鰾膠原肽無(wú)細(xì)胞毒性，在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)2BS 細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

圖1 鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)2BS 細(xì)胞增殖率的影響Fig.1 Cell viability of 2BS cells treated with SWP

2.2 H2O2 濃度的選擇

有研究表明，一定濃度的H2O2可使人二倍體成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老退行性改變，且不表現(xiàn)細(xì)胞死亡，該狀態(tài)的細(xì)胞適宜用于早期衰老細(xì)胞模型研究[16]。為選擇適合的H2O2誘導(dǎo)濃度，檢測(cè)加入不同濃度H2O2后細(xì)胞的增殖率。由圖2可以看出，與空白組細(xì)胞相比，加入0.1 mmol/L H2O2的細(xì)胞增殖率超過(guò)100%，隨著濃度的進(jìn)一步增大，細(xì)胞增殖率逐漸降低，當(dāng)H2O2濃度為0.2 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞增殖率為80.1%；當(dāng)H2O2濃度為5 mmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖率僅1.3%。上述結(jié)果表明H2O2對(duì)細(xì)胞的增殖具有雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度促進(jìn)細(xì)胞增殖，高濃度抑制細(xì)胞增殖。王昌等[17]在試驗(yàn)中觀(guān)察到類(lèi)似的現(xiàn)象，他指出H2O2對(duì)細(xì)胞的影響取決于細(xì)胞類(lèi)型和誘導(dǎo)劑量。細(xì)胞增殖率過(guò)低不利于藥效的發(fā)揮，影響后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。本試驗(yàn)采用0.2 mmol/L H2O2建立早期衰老模型。

圖2 不同濃度H2O2 誘導(dǎo)2BS 細(xì)胞的增殖率（±s，n=4）Fig.2 Cell viability of H2O2-induced 2BS cells （±s，n=4）

2.3 SWP 對(duì)2BS 細(xì)胞存活率的影響

由圖3可看出，與模型組細(xì)胞相比，H2O2誘導(dǎo)的2BS 細(xì)胞經(jīng)SWP 或白藜蘆醇處理后細(xì)胞增殖率提高，且呈一定的劑量依賴(lài)。當(dāng)SWP 質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞增殖率為79.8%，具有顯著性差異（P＜0.01）。這表明一定濃度的鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)的2BS 細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用。

圖3 鱈魚(yú)鰾膠原肽分離純化組分對(duì)H2O2 誘導(dǎo)2BS細(xì)胞增殖率的影響（±s，n =4）Fig.3 Effects of SWP on cell viability of H2O2-induced 2BS cells（±s，n=4）

2.4 ROS 活性氧

1956年，Harman 首次提出自由基致衰老學(xué)說(shuō)，最早闡釋了氧自由基與衰老之間的關(guān)聯(lián)[18]。當(dāng)體內(nèi)多余的ROS 活性氧自由基不能被及時(shí)清除時(shí)，會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的傷害。采用DCFH-DA 探針標(biāo)記細(xì)胞，非熒光的DCFH 被自由基氧化后形成熒光DCF，通過(guò)熒光強(qiáng)度檢測(cè)可反映細(xì)胞中活性氧自由基含量變化[19]。本試驗(yàn)結(jié)果如圖4b 所示，用H2O2處理后，2BS 細(xì)胞的ROS 生成明顯增加（P＜0.01）。從圖4a 的細(xì)胞形態(tài)也可以看出，模型組細(xì)胞中被熒光染料染色的細(xì)胞數(shù)量多，熒光強(qiáng)度大。與模型組細(xì)胞相比，經(jīng)SWP 與白藜蘆醇處理的細(xì)胞中ROS 活性氧含量顯著下降（P＜0.01），且SWP 濃度越大，下降越顯著。以上結(jié)果顯示鱈魚(yú)鰾膠原肽能夠清除H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS 活性氧自由基，對(duì)早衰細(xì)胞起到保護(hù)作用。

圖4 鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)H2O2 誘導(dǎo)2BS 細(xì)胞ROS 活性氧的影響（±s，n =4）Fig.4 Effects of SWP on H2O2-induced ROS generation of 2BS cells（ xˉ±s，n=4）

2.5 Hoechst 33258 染色

Hoechst 33258 作為一種可穿透細(xì)胞膜的具有熒光特性的核酸染料，常被用于DNA 染色，觀(guān)察細(xì)胞凋亡情況[20]。染色結(jié)果如圖5所示，未經(jīng)處理的空白組中細(xì)胞形態(tài)規(guī)則且呈均勻的藍(lán)色熒光。經(jīng)H2O2誘導(dǎo)處理后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞大小不均一且細(xì)胞核濃染數(shù)量較多，顏色發(fā)白、發(fā)亮，可見(jiàn)細(xì)胞核固縮或碎裂為小核等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征。與模型組細(xì)胞相比，陽(yáng)性藥組與SWP 處理組細(xì)胞數(shù)量有一定程度的增加，濃染細(xì)胞數(shù)減少，且高濃度SWP 對(duì)早衰2BS 細(xì)胞的保護(hù)作用更顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)H2O2誘導(dǎo)2BS 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡具有較好的抑制作用。

圖5 鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)H2O2 誘導(dǎo)2BS 細(xì)胞Hoechst 33258 染色的影響Fig.5 Effects of SWP on Hoechst 33258 staining of H2O2-induced 2BS cells

2.6 β-半乳糖苷酶

β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是一種存在于動(dòng)物中的常用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞衰老水平的生物標(biāo)志物[21]。本試驗(yàn)采用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-Gal）染料，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶催化后生成藍(lán)色產(chǎn)物，在光學(xué)顯微鏡下很容易被觀(guān)察到。通過(guò)對(duì)染色細(xì)胞計(jì)數(shù)可以檢測(cè)和量化衰老細(xì)胞。隨機(jī)抽取5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)染色細(xì)胞，計(jì)算染色細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例。細(xì)胞形態(tài)與統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖6?？梢钥闯觯?jīng)H2O2誘導(dǎo)處理的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，SA-β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P＜0.01），達(dá)到細(xì)胞總數(shù)的54.8%。與模型組細(xì)胞相比，陽(yáng)性藥組與SWP 處理組細(xì)胞中SA-β-gal 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P＜0.01），且呈現(xiàn)良好的劑量依賴(lài)關(guān)系。400 μg/mL SWP 組細(xì)胞中染色陽(yáng)性率與白藜蘆醇組相近，為33.8%。該結(jié)果顯示鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞中β-半乳糖苷酶升高具有顯著的抑制作用。

圖6 鱈魚(yú)鰾膠原肽對(duì)H2O2 誘導(dǎo)2BS 細(xì)胞β-半乳糖苷酶含量染色的影響（±s，n = 5）Fig.6 Effects of SWP on SA-β-gal staining of H2O2-induced 2BS cells （±s，n=5）

2.7 抗氧化酶活力

人體內(nèi)存在復(fù)雜的抗氧化防御網(wǎng)絡(luò)，主要通過(guò)內(nèi)源性酶和非酶抗氧化劑來(lái)調(diào)節(jié)。這些分子共同作用，將體內(nèi)多余的自由基轉(zhuǎn)化成為穩(wěn)定的無(wú)害化合物，使機(jī)體的氧化-還原狀態(tài)維持在較為平穩(wěn)的狀態(tài)[22]。過(guò)氧化物酶，如超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）等構(gòu)成人體抗氧化防御體系的第一道防御系統(tǒng)。丙二醛（MDA）是自由基與脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，具有明顯的細(xì)胞毒性，可反映機(jī)體因自由基而導(dǎo)致的氧化損傷。細(xì)胞中SOD、CAT 活力及MDA 含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。與空白組細(xì)胞相比，模型組細(xì)胞中SOD與CAT 活力顯著降低（P<0.01），MDA 含量顯著升高（P<0.01）。與模型組細(xì)胞相比，陽(yáng)性藥組與SWP處理組細(xì)胞中SOD 與CAT 活力不同程度地增大，MDA 含量有降低趨勢(shì)，其中400 μg/mL SWP 組對(duì)提高氧化損傷細(xì)胞中SOD 與CAT 活力的效果最顯著（P<0.01），200 μg/mL SWP 組對(duì)降低氧化損傷細(xì)胞中MDA 含量的效果最顯著（P<0.01）。以上結(jié)果顯示，鱈魚(yú)鰾膠原肽通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活力并降低脂質(zhì)過(guò)氧化物含量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)早期衰老細(xì)胞的保護(hù)作用。

表1 過(guò)氧化物酶含量變化Table 1 The changes of peroxidase content

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的早期衰老的2BS 細(xì)胞，用鱈魚(yú)鰾膠原肽處理后能夠提高細(xì)胞增殖率，降低細(xì)胞ROS 活性氧水平與β-半乳糖苷酶含量，減少細(xì)胞凋亡率，提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力并降低脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，說(shuō)明鱈魚(yú)鰾膠原肽能延緩衰老，是因其具有抗氧化活性及抑制細(xì)胞凋亡作用。