膝骨關(guān)節(jié)炎特異性自身抗體的表達(dá)對淋巴細(xì)胞凋亡的影響

張強(qiáng)，張敏，黃志榮，王高，胡中立，章智華

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院，江西 南昌 330006

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是于老年人群中高發(fā)的慢性疾病之一，退行性病理改變是KOA 的發(fā)病基礎(chǔ)，膝關(guān)節(jié)腫痛、彈響以及坐立走行膝關(guān)節(jié)都活動不便為患者的一般癥狀表現(xiàn)，KOA 病情嚴(yán)重會發(fā)展成膝關(guān)節(jié)的嚴(yán)重障礙甚至是畸變，嚴(yán)重影響患者身心健康、自理能力以及加重家庭負(fù)擔(dān)［1-3］。臨床認(rèn)為，肥胖所致膝關(guān)節(jié)壓力過大及磨損、膝骨外傷以及機(jī)體過勞都是導(dǎo)致KOA 疾病的主要原因［4］。如今，人口肥胖率升高，KOA 患病率也升高，所以，加強(qiáng)KOA 的防治措施，對于患者以及社會都有著十分積極的意義［5］。而目前醫(yī)學(xué)界對于該病診斷治療尚且沒有特異性和有效率都較高的辦法，通過減輕關(guān)節(jié)磨損緩解病情是臨床的主要應(yīng)對措施［6］。為了提高患者的治療體驗(yàn)及效果，無創(chuàng)生化指標(biāo)來測評KOA 病情以及預(yù)后逐漸成為學(xué)術(shù)界爭相研究的一大熱點(diǎn)［7］。相關(guān)研究顯示，角蛋白（AKA）、核周因子（APF）以及瓜氨酸（anti-CCP）抗體等三種特異性自身抗體在KOA 患者空腹血中的表達(dá)較正常人出現(xiàn)異常，而臨床研究表明KOA疾病的發(fā)生發(fā)展與淋巴細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常存在關(guān)系［8］。因此本研究旨在研究AKA、APF 以及anti-CCP 抗體等三種特異性自身抗體對KOA 細(xì)胞凋亡影響,為KOA 患者提供診斷和治療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年3 月至2019年10 月期間江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬洪都中醫(yī)院收治的82 例KOA 患者為研究組，招募82 例健康志愿者為對照組。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，詳見表1。參試者及近親屬簽署了試驗(yàn)知情同意書，本研究符合醫(yī)學(xué)倫理原則要求。

表1 研究組和對照組一般資料比較

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）研究組患者符合KOA 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）對照組無關(guān)節(jié)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并腫瘤；（2）類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及除KOA 以外的其他關(guān)節(jié)性疾?。唬?）免疫系統(tǒng)及其他內(nèi)科疾病患者；（4）精神病患者。

1.3 KOA 嚴(yán)重程度分組標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)Kellgren-Law-rence（K-L）標(biāo)準(zhǔn)分級，膝關(guān)節(jié)檢測正常為0 級；膝關(guān)節(jié)有微小骨質(zhì)增生現(xiàn)象為Ⅰ級；膝關(guān)節(jié)間隙窄，輕度骨贅為Ⅱ級；膝關(guān)節(jié)骨贅變多骨質(zhì)硬化為Ⅲ級；膝關(guān)節(jié)骨贅大量增多、骨質(zhì)嚴(yán)重硬化畸變，伴隨關(guān)節(jié)的不同程度脫位為Ⅳ級。將KOA 患者分為KOA 輕、中、重度三個(gè)亞組，0～Ⅰ級為輕度組；Ⅱ級為中度組；Ⅲ～Ⅳ級為重度組。

1.4 檢測特異性自身抗體

IIF 法:抽取患者清晨空腹靜脈血，離心分離取上清，經(jīng)過稀釋后若所測抗體呈陽性，繼續(xù)稀釋，直到測定最終稀釋度，測定過程按IIF 試劑盒說明嚴(yán)格操作。ELISA 法：首先對各組血清進(jìn)行稀釋，全程反應(yīng)60 min，待反應(yīng)結(jié)束后讀取吸光度值，采用直線回歸計(jì)算樣本濃度，陽性標(biāo)準(zhǔn)為100 U/mL及以上，試劑盒均來自北京博爾邁生物科技有限公司，過程按相應(yīng)的試劑盒操作說明書。

1.5 檢測淋巴細(xì)胞凋亡率

抽取的各組靜脈血首先采用肝素抗凝血，然后分離T、B 淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞于FCM 管低溫PBS 液洗滌、離心、棄上清，再加入緩沖液，血細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再使用搖床混勻，PI 染料進(jìn)行避光染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，并記錄凋亡細(xì)胞占所有細(xì)胞的比率，具體數(shù)值以百分?jǐn)?shù)形式表示。所涉及的儀器來自美國貝克曼公司。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各亞組分組情況及資料

如表2，根據(jù)K-L 分級標(biāo)準(zhǔn)將研究組KOA 患者 分 為KOA 輕 度 組27 例，KOA 中 度 組36 例，KOA 重度組19 例。四組在男女比例、年齡以及BMI 水平均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各亞組分組情況及資料

2.2 各組特異性自身抗體的表達(dá)比較

如下圖1，通過對比對照組和研究組KOA 患者血清中特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP的表達(dá)：研究組中三者的表達(dá)較對照組顯著上調(diào)（P<0.05）。不同嚴(yán)重程度分組比較：與輕度組比較，中、重度組患者血清中AKA、APF、anti-CCP 的相對表達(dá)顯著升高（P<0.05）。，見表3。

表3 對照組及KOA病情不同嚴(yán)重程度亞組中的表達(dá)比較（）

表3 對照組及KOA病情不同嚴(yán)重程度亞組中的表達(dá)比較（）

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與KOA輕度組比較，P<0.05；c表示與KOA中度組比較，P<0.05。

圖1 對照組及研究組血清中特異性自身抗體的表達(dá)

2.3 各組T、B 淋巴細(xì)胞凋亡率結(jié)果比較

與對照組比較，KOA 輕度組患者的T、B 淋巴細(xì)胞凋亡率較對照組有降低的趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；KOA 中、重度組患者T、B 淋巴細(xì)胞凋亡率較輕度組顯著降低（P<0.05），見圖2和表4。

圖2 T、B淋巴細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

表4 對照組及KOA病情不同嚴(yán)重程度亞組淋巴細(xì)胞凋亡率比較（%，）

表4 對照組及KOA病情不同嚴(yán)重程度亞組淋巴細(xì)胞凋亡率比較（%，）

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與KOA輕度組比較，P<0.05；c表示與KOA中度組比較，P<0.05。

2.4 特異性自身抗體對KOA 的診斷價(jià)值

如表5、圖3 所示，ROC 曲線分析的結(jié)果顯示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 對KOA均具有良好的診斷價(jià)值。

表5 特異性自身抗體與KOA病情程度ROC曲線分析結(jié)果

圖3 特異性自身抗體與KOA病情程度ROC曲線分析

2.5 影響因素分析

logistic 回歸分析結(jié)果：血清特異性自身抗體AKA、APF、anti-CCP 均是影響KOA 患者病情程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。，見表6。

表6 影響KOA病情的Logistic回歸分析

2.6 特異性自身抗體與淋巴細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 與淋巴細(xì)胞凋亡率均呈負(fù)相關(guān)（R<0，P<0.05）。其中AKA 與B、T 淋巴細(xì)胞負(fù)相關(guān)（R=-0.633，-0.498，P<0.05）；APF 與B、T 淋巴細(xì)胞負(fù)相關(guān)（R=-0.478，-0.654，P<0.05）；anti-CCP 與B、T 淋巴細(xì)胞負(fù)相關(guān)（R=-0.553，-0.378，P<0.05）。見圖4。

圖4 特異性自身抗體與淋巴細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性分析

3 討論

KOA 又被稱作膝關(guān)節(jié)增生性關(guān)節(jié)炎，該病不但發(fā)病率高，且預(yù)后效果不佳病情遷延難愈，因此該病的臨床關(guān)注度高［9］。對該病治療會根據(jù)患者病情的輕重程度針對性進(jìn)行，對于病情較輕患者，康復(fù)鍛煉以維持膝關(guān)節(jié)能力；對于病情較重者，采用向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物治療；而對于膝關(guān)節(jié)以及產(chǎn)生嚴(yán)重畸變，關(guān)節(jié)基本功能喪失則需要進(jìn)行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)及相關(guān)手術(shù)治療，而且痊愈的可能性很低［10］。因此，尋找在疾病早期準(zhǔn)確檢測治療的方法十分重要［11］。醫(yī)學(xué)研究表示：外來抗原使機(jī)體自身產(chǎn)生免疫抵抗，該抗原將HLA-DR 分子呈遞給吞噬細(xì)胞加工，從而激活機(jī)體的T 淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致KOA。特異性自身抗體是指抗自身抗原的一類免疫球蛋白［12］。相關(guān)臨床問診和病歷分析AKA、APF、anti-CCP 與KOA 患者關(guān)節(jié)壓痛數(shù)以及晨僵時(shí)間等疾病相關(guān)指標(biāo)有關(guān)，說明其與KOA 病情程度和活動性相關(guān)，而臨床研究表明KOA 疾病的發(fā)生發(fā)展與淋巴細(xì)胞凋亡出現(xiàn)異常存在關(guān)系［13-15］。機(jī)體淋巴細(xì)胞的凋亡關(guān)系到機(jī)體免疫系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)以及能否發(fā)揮正常生物學(xué)作用［16］，因此探究KOA 患者特異性自身抗體的表達(dá)對機(jī)體淋巴細(xì)胞凋亡的影響有著十分重要的臨床意義。

本研究通過IIF 法聯(lián)合ELISA 法測定AKA、APF、anti-CCP 等特異性自身抗體在KOA 不同病情患者中的表達(dá)，分析KOA 特異性自身抗體與T、B 淋巴細(xì)胞凋亡率的相關(guān)性。KOA 患者中AKA、APF、anti-CCP 表達(dá)較健康者顯著上調(diào)（P<0.05）。與KOA 輕度組比較，KOA 中度患者血清中三種特異性自身抗體表達(dá)顯著升高（P<0.05），KOA 重度患者極顯著升高（P<0.05）。結(jié)果提示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 的相對表達(dá)隨著KOA 患者病情嚴(yán)重程度的加重呈梯度依賴性上升。KOA 中度組患者較KOA 輕度患者的T、B 淋巴細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），KOA 重度組患者極顯著降低（P<0.05）。推測KOA 患者的病情程度加重與機(jī)體淋巴細(xì)胞的正常凋亡受到阻滯存在相關(guān)。ROC 診斷曲線結(jié)果表明，特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 對于KOA 均具有良好的診斷價(jià)值。Logistic 分析顯示：血清特異性自身抗體AKA、APF、anti-CCP 均是影響KOA 患者病情程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。相關(guān)性分析的結(jié)果表明，特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 與T、B淋巴細(xì)胞凋亡率均呈負(fù)相關(guān)。其中AKA 與B、T 淋巴細(xì)胞負(fù)相關(guān)；APF 與B、T 淋巴細(xì)胞負(fù)相關(guān)；anti-CCP 與B、T 淋巴細(xì)胞負(fù)相關(guān)。KOA 患者血清特異性自身抗體的表達(dá)越高，淋巴細(xì)胞的凋亡率就越低。本研究對于結(jié)果的論述進(jìn)行了多層次的對比以及相關(guān)數(shù)據(jù)的處理。然而，依然存在其不足之處：由于試驗(yàn)時(shí)間的關(guān)系，納入的患者樣本容量不夠大，可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。后續(xù)研究可擴(kuò)充樣本繼續(xù)分析。

綜上所述，KOA 患者血清特異性自身抗體的表達(dá)越高，淋巴細(xì)胞的凋亡率越低，血清特異性抗體水平與KOA 的發(fā)生密切相關(guān)，參與了KOA 的發(fā)病過程，反映了KOA 病情輕重及關(guān)節(jié)損傷程度，所以KOA 患者血清特異性表達(dá)對于KOA 的疾病診斷及病情提示都有一定的臨床價(jià)值。