19個X-STR熒光復(fù)合擴增體系的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評估

林添春?楊幸怡?熊晨?李奧成?孫宏鈺?劉超

【摘要】目的 評估含有19 個X染色體-短串聯(lián)重復(fù)序列（X-STR）的復(fù)合擴增體系在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用效果。方法 參照DNA分析方法科學(xué)工作組（SWGDAM）的驗證指南，評估了含有19 個X-STR的復(fù)合擴增體系的種屬特異性、靈敏度、抗抑制劑、精確性、可重復(fù)性、一致性、在混合樣本與陳舊樣本中的檢測效果及stutter峰和群體多態(tài)性。結(jié)果 DNA 模板量在0.25～1.00 ng 時，各基因座分型結(jié)果清晰準確，均衡性好、特異性強，混合、陳舊樣本均能獲得正確的分型結(jié)果;檢測中國南方漢族共196份無關(guān)個體血樣，19個X-STR遺傳標(biāo)記共檢出151個等位基因，基因頻率為0.0037 ～ 0.8439，其中多態(tài)性信息量最為豐富的基因座是DXS10135（多肽性信息含量= 0.9173），個體識別能力在男、女性群體中分別為0.9124、0.9894;累積個體識別能力在男性群體中大于0.999 999 999 874，在女性群體中大于0.999 999 999 999;在三聯(lián)體案件中的累積平均排除概率大于0.999 999 999 298，在二聯(lián)體中的累積平均排除概率大于0.999 999 500 495。結(jié)論 含有19 個X-STR的復(fù)合擴增體系分型準確、穩(wěn)定，滿足法醫(yī)學(xué)實踐的要求，獲得的基因頻率等參數(shù)可為X-STR檢驗提供數(shù)據(jù)支撐。

【關(guān)鍵詞】X染色體-短串聯(lián)重復(fù)序列;熒光復(fù)合擴增;法醫(yī)遺傳學(xué);驗證

Forensic evaluation of 19 X-STR fluorescent multiplex amplification system systems Lin Tianchun， Yang Xingyi， Xiong Chen， Li Aocheng， Sun Hongyu， Liu Chao. Department of Forensic Medicine， Zhongshan Medical College， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510089， China Corresponding author， Sun Hongyu， E-mail： sunhongyu2002@163.com; Liu Chao， E-mail： liuchaogzf@163.com

【Abstract】Objective To evaluate the forensic performance of 19 X-STR fluorescent amplification system. Method Referring to the Scientific Working Group on DNA Analysis Methods （SWGDAM）， the detection effect of the specificity， sensitivity， inhibitor resistance， repeatability， compatible consistency， stutter and population polymorphism of the system in the mixed and degraded samples was evaluated. Results When the DNA template was between 0.25 and 1.00 ng， the typing results of each locus were distinctly accurate， well balanced and with strong specificity. Correct typing results could be obtained in both mixed and degraded samples. Blood samples of 196 unrelated Han nationality individuals from southern China were collected， and 151 allele profiles were detected from 19 X-STR loci. The gene frequency was detected between 0.0037 and 0.8439. DXS10135 （PIC = 0.9173） was the most polymorphic locus， with discrimination power （DP） of 0.9124 and 0.9894 for the male and female; The total discrimination power （TDP） was greater than 0.999 999 999 874 in the male. and greater than 0.999 999 999 999 in the female; The mean exclusion chance （MEC） in the DNA triplet was higher than 0.999 999 999 298， and greater than 0.999 999 500 495 in the duo cases. Conclusions The 19 X-STR fluorescent amplification system is distinctly accurate and stable， which can fulfill the requirement of forensic application. The gene frequency and other parameters can be provide data support for X-STR testing.

【Key words】X-Chromosome Short Tandem Repeat; Fluorescent multiplex amplification;Forensic genetics; Validation

常染色體及Y染色體-短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）已經(jīng)常規(guī)用于司法鑒定，但是X染色體-STR（X-STR）基因座的應(yīng)用研究相對較少[1]。X染色體具有獨特的遺傳特性：母親可以傳遞給子女，而父親僅傳遞給女兒且該染色體來自女兒的祖母，可作為常染色體多態(tài)性分析的重要補充，在復(fù)雜親緣鑒定、男女混合樣本檢測以及部分倫理犯罪中有特殊的應(yīng)用價值[2]。本研究選擇的MicroreaderTM 19 X-STR復(fù)合擴增體系（MRX19），遺傳標(biāo)記均分布在非連鎖簇內(nèi)，遺傳標(biāo)記間的遺傳距離相距較遠，符合獨立遺傳，但該復(fù)合擴增體系群體多態(tài)性報道少，尚未見法醫(yī)應(yīng)用評估報道。為此，研究收集了196份無關(guān)個體血樣，檢測了19個X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）及性別基因座，評估了該熒光復(fù)合擴增體系的種屬特異性、靈敏度、抗抑制劑、精確性、可重復(fù)性、一致性與在混合樣本、陳舊檢材中應(yīng)用效果及影子峰（Stutter峰）和群體多態(tài)性，并優(yōu)化了擴增條件，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、樣 本

種屬特異性實驗：選取倉鼠、狗、猴子、雞、龍貓、貓、牛、猩猩、鴨、羊非人源DNA各0.5 ng，均來源于廣州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所的科研積累。

抗抑制劑實驗：將不同濃度的法醫(yī)實踐常見的抑制劑[血紅素、靛藍、腐殖酸、乙二胺四乙酸（EDTA）]加入到0.5 ng的9947A中。血紅素的濃度梯度為0、75、125、150 μmol/L;靛藍的濃度梯度為0、750、1500、2000 μmol/L;腐殖酸的濃度梯度為0、5、10、20 ng/μL;EDTA的濃度梯度為0、0.8、1.0、1.2 mmol/L。

男/女混合樣本：通過混合標(biāo)準品2800M和標(biāo)準品9947A來實現(xiàn)的。分別按照1∶1、1∶4、1∶9、1∶19、19∶1、9∶1、4∶1 和1∶1的比例混合，每份混合樣本的DNA總量均為1 ng。

分型一致性、陳舊檢材實驗的樣本：來源于日常檢案積累。

群體樣本：根據(jù)知情同意原則，收集來自廣東、廣西、湖南及江西省的196份（男性樣本123份，女性樣本73份）中國南方漢族無關(guān)個體的血樣。本實驗涉及到生物實驗等有關(guān)設(shè)計、實施方案及受試者征集過程符合中山醫(yī)學(xué)院倫理原則（倫理批件號：中山醫(yī)醫(yī)倫[2020]第044號）。

二、主要試劑和儀器

主要試劑包括MicroreaderTM 19 X ID 熒光檢測試劑盒及相應(yīng)的QD550內(nèi)標(biāo)（購自閱微公司）、AGCUX19 STR熒光檢測試劑盒及相應(yīng)的SIZ-500內(nèi)標(biāo)（購自中德美聯(lián)公司）和BK-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（購自博坤生物科技有限公司）[3]。主要儀器包括BK-TQ-001E 博坤全自動DNA提取工作站、Qubit?2.0 Fluorometer定量儀、ABI 9700型擴增儀、ABI 3500全自動遺傳分析儀、ABI 3500XL全自動遺傳分析儀和ABI 3130XL全自動遺傳分析儀。

三、方 法

1. DNA提取

前述所有樣本采用BK-超微量磁珠法DNA提取試劑盒通過BK-TQ-001E全自動工作站提取基因組DNA，模板DNA均使用Qubit?2.0 Fluorometer定量儀進行濃度測定[4]。

2. DNA擴增

參照DNA分析方法科學(xué)工作組（SWGDAM）的驗證指南，評估MRX19的種屬特異性、靈敏度、抗抑制劑性、精確性、可重復(fù)性、一致性與在混合樣本、陳舊樣本中的檢測效果及stutter峰和群體多態(tài)性[5]。其中特異性、靈敏度、分型一致性、混合樣本、陳舊檢材實驗均使用25.0 μl體系：PCR反應(yīng)液10.0 μL，引物混合液5.0 μL，MicroreaderTM Tap DNA PolymeraseⅡ 0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，擴增水8.5 μL。PCR擴增使用ABI 9700型擴增儀，擴增循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：變性95℃ 2 min，熱循環(huán)94℃5 s，60℃ 70 s，29個循環(huán)，終延伸60℃30 min，4℃保溫。

3. 電泳與分型

通過ABI 3130XL遺傳分析儀進行毛細管電泳檢測，樣品制備：1.0 μL擴增產(chǎn)物與9.0 μL上樣緩沖液混合。上樣緩沖液包含8.5 μL Hi-Di甲酰胺以及0.5 μL內(nèi)標(biāo)。X-STR基因分型通過GeneMapperID-X軟件完成，包括19個X-STR基因座（DXS6795、DXS6803、DXS6807、DXS9907、DXS7423、GATA172D05、DXS101、DXS9902、DXS7133、DXS6810、GATA31E08、DXS6800、DXS981、DXS10162、DXS6809、GATA165B12、DXS10079、DXS10135、HPRTB）。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 25.0對男、女群體之間各基因座的等位基因頻率分布差異進行χ2檢驗。應(yīng)用Arlequin 3.5對女性樣本分型數(shù)據(jù)進行Hardy-Weinberg（H-W）平衡檢驗和各基因座間進行連鎖不平衡檢驗。使用在線X-STR數(shù)據(jù)庫（http：//www.chrx-str.org/）計算該19個X-STR的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)。通過收集19個X-STR熒光檢測體系A(chǔ)llelic Ladder電泳的16個通道的電泳數(shù)據(jù)計算每個等位基因片段的電泳遷移率。Stutter比率為Stutter峰高與相應(yīng)等位基因峰高的比值。α = 0.05，多重比較采用Bonferroni法。

結(jié)果

一、種屬特異性驗證

檢測猩猩、猴子、牛、羊、狗、雞、鴨、龍貓、貓和倉鼠的樣本，除猩猩的樣本檢測到非特異性擴增片段之外，其它物種均未發(fā)現(xiàn)擴增片段。

二、靈敏度實驗

使用9947A梯度稀釋模板量分別為1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.0312 50 ng進行擴增檢測。19個X-STR完整分型的最低模板量為0.25 ng。

三、抗抑制劑實驗

血紅素、靛藍、腐殖酸和EDTA 4種抑制劑對該檢測系統(tǒng)檢出完整等位基因分型干擾濃度分別為125 μmol/L、750 μmol/L、5 ng/μL、0.8 mmol/L。

四、精確性實驗

通過使用3500XL遺傳分析儀（容忍范圍0.50 bp）上電泳24份等位基因分型標(biāo)準物并統(tǒng)計片段遷移率，雖然基因座DXS7423和HPRTB表現(xiàn)出較大遷移率，但是兩者的遷移率均在0.20 bp之內(nèi)，沒有超出遺傳分析儀的容忍范圍，見圖1。

五、可重復(fù)性實驗

不同組織男、女樣本各1份，分別使用3臺不同儀器（3500、3500XL、3130XL）進行電泳檢測，每組重復(fù)3次，均得到一致結(jié)果，峰高均在1500 rfu以上。

六、一致性實驗

196份群體樣本中與AGCU 19X STR試劑盒共有的7個基因座（DSX10079、DXS101、DXS10135、DXS10162、DXS6809、DXS7423、HPRTB）均得出相同的基因分型。

七、混合樣本實驗

通過混合標(biāo)準品2800M和標(biāo)準品9947A進行檢驗，在1∶1混合的樣本中檢出完整基因分型，但小于或等于1∶4時，DNA含量低的樣本出現(xiàn)遺傳標(biāo)記丟失，丟失的片段主要為長片段。

八、陳舊檢材實驗

選取12份陳舊血樣，同步使用MRX19與AGCU X19試劑盒進行檢驗。12份樣本所有基因座全部得到完整分型，表明MRX19檢出效能較高，并與AGCU X19熒光檢測試劑盒進行比較，分型結(jié)果一致。

九、PCR優(yōu)化

1. 循環(huán)數(shù)梯度

使用25 μL體系對0.5 ng 9947A進行擴增，設(shè)置5個循環(huán)數(shù)目梯度，分別為27、28、29、30 和31。熒光峰值隨著循環(huán)數(shù)的增加而升高，循環(huán)數(shù)為27時可以得到完整基因分型，樣本在29個擴增循環(huán)數(shù)時，各基因座擴增的熒光均衡性更好，而當(dāng)循環(huán)數(shù)超過30時由于熒光峰值過高，個別基因座出現(xiàn)熒光滲透現(xiàn)象，影響相同片段大小的其他等位基因的分型。

2. 退火溫度梯度

以56、58、60、62、64 ℃的5個溫度梯度對體系的退火溫度耐受性進行測試，均能得到完整的基因分型，且60 ℃時產(chǎn)物片段熒光峰值和特異性最好，除64 ℃時DXS6807基因座雜合子峰高比為0.207，其余溫度時該體系14個基因座的雜合子峰高比均在0.6～1.0，均衡性較好，見圖2。

3. 終延伸時間梯度

取0、15、30、45、60 min 5個時間梯度進行擴增。當(dāng)延伸時間高于15 min時，目的峰沒有減A峰出現(xiàn)，高于30 min時處于穩(wěn)定，因此該體系最佳延伸時間設(shè)置為30 min。

十、Stutter峰研究

統(tǒng)計了50個南方漢族無關(guān)個體的樣本數(shù)據(jù)從而得出每個基因座的Stutter范圍并進一步加權(quán)分析后算出Stutter峰值，結(jié)果顯示19個X-STR基因座的Stutter峰平均比率均低于15%。

十一、群體多態(tài)性檢測

檢測196份無關(guān)個體19個X-STR基因座均符合H-W平衡（P > 0.05/19），且19個X-STR基因座相互之間未出現(xiàn)連鎖不平衡狀態(tài)（P > 0.05/171）。雜合度觀察值（Ho）為0.3151～0.9178，雜合度期望值（He）為0.2927～0.9249，多態(tài)性信息含量（PIC）為0.2633～0.9173，其中PIC最為豐富的基因座為DXS10135。此外，DXS10135、DXS10079、DXS6809、DXS10162、DXS981、GATA31E08、DXS101等7個基因座的PIC均大于0.7。另外，男性群體中的累積個體識別能力（TDP）大于0.999 999 999 874，女性群體中的TDP大于0.999 999 999 999。累積平均排除概率（MEC）在三聯(lián)體案件中大于0.999 999 999 298，在二聯(lián)體案件中大于0.999 999 500 495。共檢出151個等位基因，基因頻率分布在0.0037～0.8439之間。等位基因數(shù)目最多的DXS10135檢出21個等位基因，等位基因數(shù)目最少的DXS7423僅有4個等位基因被檢出，見表1。

討論

本研究參照SWGDAM的驗證指南，對MRX19進行法醫(yī)學(xué)應(yīng)用評估。種屬特性實驗結(jié)果顯示，僅來源于猩猩DNA的樣本出現(xiàn)了非特異擴增片段，而其他樣本均未出現(xiàn)擴增片段，表明該體系具有較好的種屬特異性。該體系在模板量大于等于0.025 ng可獲得完整分型，顯示靈敏度高。12份陳舊、微量檢材全部得到完整基因分型，顯示該體系可用于案件檢材。在抗抑制試驗中，加入法醫(yī)實踐中常見的抑制物血紅素、靛藍、EDTA等，結(jié)果顯示該體系對抑制劑有較好的耐受性。

PCR循環(huán)數(shù)優(yōu)化實驗結(jié)果表明，該體系在循環(huán)數(shù)為27的PCR體系中可以得到完整基因分型，循環(huán)數(shù)為29時各基因座擴增均衡性最佳，而當(dāng)循環(huán)數(shù)超過30時會產(chǎn)生熒光滲透現(xiàn)象。退火溫度優(yōu)化實驗中，該體系在56～64℃均能得到完整的基因分型， 60℃時PCR效率最高，即產(chǎn)物片段熒光峰值和特異性最好。本實驗數(shù)據(jù)為該擴增體系在實際應(yīng)用中進一步優(yōu)化提供了借鑒。

在法醫(yī)學(xué)實踐中，由于X-STR特有的遺傳特征，常被作為重要的技術(shù)手段應(yīng)用于復(fù)雜親權(quán)鑒定及男女混合樣本檢測。然而目前應(yīng)用的X-STR檢測試劑盒主要為德國Qiagen公司基于國外人群數(shù)據(jù)開發(fā)的試劑盒，可檢出12個X-STR遺傳標(biāo)記，遺傳標(biāo)記數(shù)目少，集中在4個連鎖簇內(nèi)，除了價格較高以外該試劑盒檢測中國人群基因多態(tài)性的靈敏度較低[6]。因此，研發(fā)基于中國人群基因多態(tài)性的新型X-STR試劑盒有非常重要的意義。中德美聯(lián)的AGCU X19熒光檢測體系能檢測19個X-STR，優(yōu)勢為位點較多，經(jīng)過應(yīng)用驗證并獲得較多中國群體法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)，能比較清晰了解其中的連鎖重組關(guān)系，基因座主要分布在7個連鎖簇內(nèi)，計算復(fù)雜親緣關(guān)系時可以更精準地計算似然率值[7-8]。本次研究的196份樣本中，MRX19與AGCU X19熒光檢測體系在共有的7個基因座獲得相同的基因分型，提示MRX19分型準確性高。MRX19的優(yōu)勢是X-STR基因座間遺傳距離較遠，基本認為獨立遺傳，在本次實驗中使用女性樣本的分型數(shù)據(jù)進行連鎖不平衡檢驗，結(jié)果顯示所有基因座的組合均未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡狀態(tài)（P均 > 0.05/171），表明該群體在此19個X-STR基因座的等位基因頻率及基因型頻率處于遺傳平衡狀態(tài)，內(nèi)部各基因座的遺傳是相互獨立的。

另外，MRX19體系全部19個X-STR基因座的男、女性等位基因分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，故將男女性進行合并計算。女性樣本的所有基因座均符合H-W平衡。該體系的累積個體識別能力在男性群體中大于0.999 999 999 874，在女性群體中大于0.999 999 999 999;在三聯(lián)體案件中的累積平均排除概率大于0.999 999 999 298，在二聯(lián)體中的累積平均排除概率大于0.999 999 500 495，結(jié)果表明該檢測體系具有良好的多態(tài)性，單獨使用這套遺傳標(biāo)記可以獲得較高的個體識別率;配合連鎖簇內(nèi)的X-STR遺傳標(biāo)記使用，在計算復(fù)雜親緣關(guān)系時可獲得更高的準確性，該體系適用于法醫(yī)個體識別及補充復(fù)雜親緣關(guān)系的鑒定。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-02-20）

（本文編輯：林燕薇）