脫氧熊果苷和氫醌對人黑素小體結(jié)構(gòu)完整性及Pmel17蛋白表達(dá)影響的差異研究

史贏?蘇夢云?江珊

【摘要】目的 探討脫氧熊果苷和氫醌對人黑素小體結(jié)構(gòu)完整性和前黑素小體蛋白17（Pmel17）表達(dá)影響的差異。方法 體外分離并純化黑素瘤細(xì)胞系MNT1中黑素小體，實驗分3組，對照組、氫醌組、脫氧熊果苷組分別加入磷酸鹽緩沖液（PBS）、10 μmol/L氫醌、100 μmol/L脫氧熊果苷，37℃孵育30 min，通過透射電鏡觀察各組黑素小體超微結(jié)構(gòu)的改變。體外培養(yǎng)MNT1細(xì)胞，實驗分3組，對照組、氫醌組、脫氧熊果苷組分別加入PBS、10 μmol/L氫醌、100 μmol/L脫氧熊果苷， 37℃孵育24 h，蛋白免疫印跡法檢測各組Pmel17蛋白的表達(dá)水平。 采用單因素方差分析和Bonferroni法比較組間差異。結(jié)果 對照組黑素小體超微結(jié)構(gòu)完整，黑素小體破壞率為（14.80±3.70）%，Pmel17蛋白相對表達(dá)量為0.84±0.04;氫醌組黑素小體膜結(jié)構(gòu)破壞，黑素小體裂解，黑素小體破壞率為（54.40±3.65）%，Pmel17相對表達(dá)量為0.61±0.03;脫氧熊果苷組黑素小體膜結(jié)構(gòu)也遭破壞，部分黑素小體裂解，黑素小體破壞率僅為（27.60±3.65）%，Pmel17蛋白相對表達(dá)量為0.49±0.03。氫醌組與對照組、脫氧熊果苷組與對照組、脫氧熊果苷組與氫醌組在黑素小體結(jié)構(gòu)完整性和Pmel17蛋白表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均 < 0.05）。結(jié)論 在體外實驗中，與氫醌相比，脫氧熊果苷僅輕度破壞黑素小體超微結(jié)構(gòu)，但更明顯抑制了Pmel17蛋白的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】脫氧熊果苷;氫醌;黑素小體;超微結(jié)構(gòu);前黑素小體蛋白17

Comparison of effects of deoxy-arbutin and hydroquinone on structural integrity of melanosomes and expression of Pmel17 in human melanocyte Shi Ying， Su Mengyun， Jiang Shan. Department of Dermatology， Renmin Hospital of Wuhan University， Wuhan 430060， China Corresponding author， Jiang Shan， E-mail： ShanJiang@whu.edu.cn

【Abstract】Objective To compare the effects between deoxy-arbutin and hydroquinone on the structural integrity and the expression of Pmel 17 protein of human melanosome. Methods Melanosomes were isolated and purified in vitro from melanoma cell line MNT1 and divided into the control， hydroquinone and deoxy-arbutin groups. In each group， PBS， 10 μmol/L hydroquinone and 100 μmol/L deoxy-arbutin were supplemented and incubated at 37℃ for 30 min. The ultrastructure of melanosomes in each group was observed by transmission electron microscopy. MNT1 cells were cultured in vitro and divided into three groups： control group， hydroquinone group and deoxy-arbutin group supplemented with PBS， 10 μmol/L hydroquinone and 100 μmol/L deoxy-arbutin， respectively. The cells were incubated at 37℃ for 24 h. The expression level of?Pmel17 protein in each group was detected by Western blot. One-way ANOVA analysis and Bonferronis multiple comparisons test were used for comparison among different groups. Results In the control group， the ultrastructure of melanosomes was intact， the destruction rate of melanosomes was （14.80±3.70）%， and the relative expression level of Pmel17 protein was 0.84±0.04. In the hydroquinone treatment group， the membrane structure of melanosomes was destroyed and melanosomes were disrupted. The destruction rate of melanosomes was （54.40±3.65）%， and the relative expression level of Pmel17 protein was 0.61±0.03. In the deoxy-arbutin treatment group， the membrane structure of melanosomes was also destroyed， and some melanosomes were disrupted. The destruction rate of melanosomes was only （27.60±3.65）%， and the relative expression level of Pmel17 protein was 0.49±0.03. There was significant difference in melanosome structural integrity and Pmel17 protein expression between any two groups （all P < 0.05）. Conclusions Compared with hydroquinone， deoxy-arbutin can cause less damage to the ultrastructure of melanosomes， but more significantly down-regulate the expression level of Pmel17 protein in vitro.

【Key words】Deoxy-arbutin; Hydroquinone; Melanosome; Ultrastructure; Pmel17 protein

黑素小體是黑素細(xì)胞內(nèi)的特異性細(xì)胞器，是黑素生物合成的重要場所，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性對維持正常膚色至關(guān)重要[1]。多種皮膚增白劑通過抑制黑素生物合成酶（主要是酪氨酸酶）活性或抑制黑素小體向角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)運而減輕皮膚色素沉著，但影響黑素小體完整性的增白劑研究罕見[2]。前黑素小體蛋白17（Pmel17，也稱為gp100或Silver）是涉及人黑素生物合成所必需的一種蛋白質(zhì)，Pmel17淀粉樣蛋白在黑素小體腔內(nèi)呈絲狀排列，作為支架，對黑素小體內(nèi)真黑素的沉積至關(guān)重要[3]。研究顯示，調(diào)節(jié)Pmel17纖維的形成可影響黑素生成[4]。本研究旨在體外觀察氫醌及其糖酐衍生物——脫氧熊果苷對純化人表皮黑素小體完整性和Pmel17蛋白表達(dá)的影響，評估兩者作為皮膚增白劑的有效性及安全性，并為新型皮膚增白劑的開發(fā)提供一種思路。

材料與方法

一、材料與方法

1.人黑素瘤細(xì)胞MNT1培養(yǎng)

MNT1細(xì)胞是高度色素化黑素瘤細(xì)胞株，采自美國國立衛(wèi)生院癌癥研究所Dr. Vincent Jr. Hearing，用含20% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.分離純化黑素小體

本實驗室根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]所建立方法，常規(guī)消化MNT1細(xì)胞并計數(shù)，獲取細(xì)胞團(tuán)塊。按每2×106細(xì)胞加入1 mL的比例加入黑素小體裂解液（1 mol/L Tris·HCl，pH7.5 1 mL，Igepal CA-630 0.1 mL，0.1% SDS 1 mL，ddH2O 7.9 mL），吹打混勻。4℃放置10 min。顛倒混勻后繼續(xù)在4℃放置10 min。分裝至1.5 mL Ep管中，每管1 mL。1000 ×g離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至一新Ep管內(nèi)，1000×g離心5 min，再將上清轉(zhuǎn)移至一新Ep管內(nèi)，17 000×g離心5 min，棄上清，D-PBS輕輕洗滌離心團(tuán)塊2次。17 000×g離心5 min。棄上清，每管加入100 μL D-PBS，-20℃保存?zhèn)溆?，?00 μL相當(dāng)于6 μg黑素。

3.氫醌、脫氧熊果苷分別與黑素小體共孵育

氫醌購自美國Sigma公司，溶解于二甲基亞砜（DMSO）中制備儲液，保存于-20℃?zhèn)溆谩＿x取本課題組前期實驗所探索的最適濃度[5]。臨用前，用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋儲液至20 μmol/L，

200 μL化合物與等量純化黑素小體混合，氫醌終濃度為10 μmol/L;脫氧熊果苷為本實驗室配制，溶解于DMSO中制備儲液，保存于-20℃?zhèn)溆茫?00 μL濃度為200 μmol/L化合物與等量所純化黑素小體混合，脫氧熊果苷終濃度為100 μmol/L;用含相同濃度DMSO的PBS與純化黑素小體混合作為對照，37℃孵育30 min后離心、PBS洗滌去除處理藥物。

4.黑素小體超微結(jié)構(gòu)觀察

收集上述孵育后的純化黑素小體，用2.5%戊二醛PBS前固定黑素小體團(tuán)塊24 h，1%四氧化餓后固定，乙醇及丙酮脫水后，Epon包埋固化制備超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色后于FEI Tecnai G2 20 TWIN透射電子顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)改變。從每個黑素小體樣本中隨機(jī)獲取至少5張透射電鏡圖像，計算損壞的黑素小體的百分比，以黑素小體破壞率（%）表示，代表黑素小體降解程度。

5.氫醌、脫氧熊果苷分別與MNT1細(xì)胞共孵育

待MNT1細(xì)胞的密度長至70% ～ 80%后，棄去陳舊培養(yǎng)基，用1 ～ 2 mL D-PBS液漂洗1 ～ 2遍，加入約1 mL 0.05%的胰酶消化 2 ～ 3 mL，待細(xì)胞形態(tài)改變后，加入等體積的10%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基中和，以1000轉(zhuǎn)/分離心5 min，棄去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基混懸，加入6孔板中，每孔約2 mL，放入37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度長至70%左右，棄去陳舊培養(yǎng)基，用D-PBS清洗1次，分別加入含 PBS、10 μmol/L氫醌、100 μmol/L脫氧熊果苷的新鮮培養(yǎng)基2 mL，用錫箔紙避光遮蓋，共孵育24 h。

6.蛋白免疫印跡法檢測黑素小體結(jié)構(gòu)蛋白Pmel17表達(dá)

用D-PBS緩沖液潤洗貼壁細(xì)胞2 ～ 3次，最后一次盡量吸干殘留液。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑（使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑）于培養(yǎng)板/瓶內(nèi)裂解3 ～ 5 min。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板/瓶，使試劑與細(xì)胞充分接觸。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下，收集到1.5 mL離心管中。冰浴30 min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。4℃，13 000×g離心5 min，收集上清，即為總蛋白溶液。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，清洗后置于5%脫脂奶粉液中室溫封閉。加一抗4℃過夜后加二抗，避光條件下?lián)u床振蕩1 h，清洗后應(yīng)用UVP凝膠成像分析系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件分析灰度，以GAPDH作為內(nèi)參，計算目的條帶與內(nèi)參灰度比值作為最終結(jié)果。

二、統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism軟件包。計量資料以? 表示，進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni法，α= 0.05。

結(jié)果

一、氫醌、熊果苷對純化黑素小體超微結(jié)構(gòu)的影響

對照組黑素小體結(jié)構(gòu)完整，可見明顯的膜結(jié)構(gòu)，少部分黑素小體超微結(jié)構(gòu)破壞;10 μmol/L氫醌、100 μmol/L脫氧熊果苷與純化黑素小體在37℃條件下孵育30 min，均可見黑素小體膜結(jié)構(gòu)破壞，其中氫醌組黑素小體結(jié)構(gòu)破壞更明顯，見圖1。對照組、氫醌組、脫氧熊果苷組黑素小體破壞率分別為（14.80±3.70）%、（54.40±3.65）%、（27.60±3.65）%（F = 152.0，P < 0.001），多重比較組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.001）。

二、氫醌、脫氧熊果苷對MNT1細(xì)胞Pmel17蛋白表達(dá)的影響

PBS、10 μmol/L氫醌、100μmol/L脫氧熊果苷與MNT1細(xì)胞37℃共孵育24 h后，提取蛋行蛋白免疫印跡法檢測Pmel17蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，對照組、氫醌組和脫氧熊果苷組Pmel17蛋白相對表達(dá)量分別為0.84±0.04、0.61±0.03和0.49±0.03（F = 116.4，P < 0.001），多重比較組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.001），見圖2。

討論

氫醌（對苯二酚）作為一種有效的皮膚脫色劑被用于臨床治療表皮色素增加性皮膚病如黃褐斑、炎癥后色素沉著斑等已長達(dá)60年[6-7]。無論是體內(nèi)研究還是體外研究均顯示，氫醌是一種有效抑制黑色素生成的化合物，并長期作為評價新型皮膚脫色劑藥效的金標(biāo)準(zhǔn)[8-9]。

氫醌引起皮膚脫色的具體作用機(jī)制涉及對酪氨酸酶活性的抑制，但也呈現(xiàn)專一的黑素細(xì)胞毒性。臨床發(fā)現(xiàn)，長期使用含氫醌的外用制劑有導(dǎo)致外源性褐黃病、人工白癜風(fēng)，甚至皮膚癌等風(fēng)險[10]?；跉漉陌踩裕現(xiàn)DA于2006年頒布法令禁止非處方藥物中使用氫醌[11]。因此，亟待尋找可以替代氫醌的高效安全皮膚脫色劑，以滿足制備脫色外用制劑或皮膚美白化妝品的需要。

熊果苷是從天然熊果中成功分離到的一種活性氫醌糖苷衍生物。既往的研究表明熊果苷能有效抑制酪氨酸酶活性，阻斷黑色素的生成，且細(xì)胞毒性較小[5]。本研究組通過移去熊果苷分子糖苷側(cè)鏈上的羥基，合成得到脫氧熊果苷，發(fā)現(xiàn)脫氧熊果苷也能有效抑制酪氨酸酶活性并具有一定的抗氧化活性和較小的黑素細(xì)胞毒性[12]。本研究結(jié)果也表明，脫氧熊果苷對體外純化黑素小體超微結(jié)構(gòu)的完整性破壞要小于氫醌，體現(xiàn)出良好的安全性。

作為一種黑素細(xì)胞特異性糖蛋白，Pmel17在前黑素小體腔內(nèi)富集，組成成分不明的特征性纖維橫嵴，隨后合成的黑色素沉積在纖維橫嵴上[13]。利用針對其腔內(nèi)段的單克隆抗體，Pmel17蛋白很容易在早期黑素小體內(nèi)檢測到，但隨著黑色素在纖維橫嵴上的不斷沉積，晚期黑素小體內(nèi)的Pmel17蛋白則不容易被檢測到。抑制Pmel17蛋白的表達(dá)被認(rèn)為是抑制黑素生成的機(jī)制之一[14]。本研究結(jié)果顯示，氫醌、脫氧熊果苷均可抑制Pmel17的表達(dá)，且后者作用更強，這一發(fā)現(xiàn)為氫醌及其衍生物的脫色作用闡明了新的可能機(jī)制。

既往對皮膚增白劑的研究主要采用體外細(xì)胞培養(yǎng)、臨床試驗以及動物實驗，缺乏對黑素小體直接作用的研究，同時對結(jié)構(gòu)蛋白Pmel17表達(dá)的影響也少有報道。本研究在比較觀察了氫醌和脫氧熊果苷對體外分離純化的人黑素細(xì)胞黑素小體超微結(jié)構(gòu)影響，并觀察上述物質(zhì)對Pmel17結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的影響，希望能為皮膚增白劑脫色機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)。

（致謝：感謝雷鐵池教授提供MNT1細(xì)胞、脫氧熊果苷等實驗材料及對本實驗的指導(dǎo)）

參? 考? 文? 獻(xiàn)

[1] DAlba L， Shawkey M D. Melanosomes： biogenesis， properties， and evolution of an ancient organelle. Physiol Rev，2019，99（1）：1-19.

[2] Lee E J， Kim J， Jeong M K， Lee Y M， Chung Y J， Kim E M. Whitening effect of novel peptide mixture by regulating melanosome biogenesis， transfer and degradation. Korean J Physiol Pharmacol，2021，25（1）：15-26.

[3] McGlinchey R P， Shewmaker F， McPhie P， Monterroso B， Thurber K， Wickner R B. The repeat domain of the melanosome fibril protein Pmel17 forms the amyloid core promoting melanin synthesis. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106（33）：13731-13736.

[4] Kawaguchi M， Hozumi Y， Suzuki T. ADAM protease inhibitors reduce melanogenesis by regulating PMEL17 processing in human melanocytes. J Dermatol Sci，2015，78（2）：133-142.

[5] Ando H， Niki Y， Ito M， Akiyama K， Matsui M S， Yarosh D B， Ichihashi M. Melanosomes are transferred from melanocytes to keratinocytes through the processes of packaging， release， uptake， and dispersion. J Invest Dermatol，2012，132（4）：1222-1229.

[6] Draelos Z D. Skin lightening preparations and the hydroquinone controversy. Dermatol Ther，2007，20（5）：308-313.

[7] Hu Z M， Zhou Q， Lei T C， Ding S F， Xu S Z. Effects of hydroquinone and its glucoside derivatives on melanogenesis and antioxidation： biosafety as skin whitening agents. J Dermatol Sci，2009，55（3）：179-184.

[8] Parvez S， Kang M， Chung H S， Cho C， Hong M C， Shin M K， Bae H. Survey and mechanism of skin depigmenting and lightening agents. Phytother Res，2006，20（11）：921-934.

[9] Makino E T， Herndon J H， Sigler M L， Gotz V， Garruto J， Mehta R C. Clinical efficacy and safety of a multimodality skin brightener composition compared with 4% hydroquinone. J Drugs Dermatol，2012，11（12）：1478-1482.

[10] Westerhof W， Kooyers T J. Hydroquinone and its analogues in dermatology - a potential health risk. J Cosmet Dermatol，2005，4（2）：55-59.

[11] Levitt J. The safety of hydroquinone： a dermatologists response to the 2006 Federal Register. J Am Acad Dermatol，2007，57（5）：854-872.

[12] Miao F， Shi Y， Fan Z F， Jiang S， Xu S Z， Lei T C. Deoxyarbutin possesses a potent skin-lightening capacity with no discernible cytotoxicity against melanosomes. PLoS One，2016，11（10）：e0165338.

[13] Pedersen J N， Jiang Z， Christiansen G， Lee J C， Pedersen J S， Otzen D E. Lysophospholipids induce fibrillation of the repeat domain of Pmel17 through intermediate core-shell structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom，2019，1867（5）：519-528.

[14] Liu Y J， Lyu J L， Kuo Y H， Chiu C Y， Wen K C， Chiang H M. The anti-melanogenesis effect of 3，4-Dihydroxybenzalacetone through downregulation of melanosome maturation and transportation in B16F10 and human epidermal melanocytes. Int J Mol Sci，2021，22（6）：2823.

（收稿日期：2021-06-25）

（本文編輯：楊江瑜）