基于藥物基因位點檢測的華法林、氯吡格雷、阿司匹林用藥分析*

徐建東，易娟娟，吳婉靜，宋海林，陳亞珠，張曉燕，陶曉琰，李國文△

（1.上海市虹口區(qū)江灣醫(yī)院藥劑科，上海 200434； 2.上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院藥劑科，上海 200434）

阿司匹林、氯吡格雷為常用抗血小板藥物，而華法林為常用抗凝藥物，根據病情需要單獨應用其中1種，二聯(lián)甚至三聯(lián)療法的治療方案常見[1]。多數(shù)患者在抗栓治療過程中獲益，但由于藥物反應個體差異、臨床療效差異大、不良反應頻發(fā)、病情反復等原因，給醫(yī)務人員和患者帶來嚴重困擾。研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性影響華法林的劑量和療效[2]。2010年，美國食品藥物管理局（FDA）發(fā)布了關于氯吡格雷藥物包裝上的盒裝警告，要求檢測藥物基因型以明確患者氯吡格雷的代謝變化、不良反應風險、基因多態(tài)性對氯吡格雷的代謝及臨床影響。阿司匹林抵抗發(fā)生率存在明顯的種族差異，基因多態(tài)性在阿司匹林抵抗中起著重要作用，主要集中在血小板表面糖蛋白Ⅲa（GPⅢa）、血小板內皮聚集受體1（PEAR1）、前列腺素內過氧化物合酶1（PTGS1）等[3]。在此，通過分析群體藥物相關單核苷酸的多態(tài)性，為臨床醫(yī)師的抗凝用藥提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇上海市中西醫(yī)結合醫(yī)院心內科2017年1月至2018年12月使用硫酸氫氯吡格雷片（賽諾菲制藥有限公司，國藥準字J20130083）、阿司匹林腸溶片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，國藥準字J20130087）、華法林鈉片（上海上藥信誼藥廠有限公司，國藥準字H31022123）治療并進行相關基因檢測的住院患者169例。于醫(yī)院信息管理系統(tǒng)中收集患者的性別、年齡、民族、用藥情況等相關信息。

1.2 方法

采用熒光染色原位雜交檢測法對患者血樣的藥物相關基因位點進行檢驗，儀器為Fluotec 48E型微量熒光檢測儀（西安天隆科技有限公司）。

熒光分子雜交測序：1）EDTA抗凝管采集到的臨床全血樣本，上下顛倒混勻。取若干1.5 mL離心管，并在管蓋上編寫序號，與抗凝管上的編號一致。2）采用H1620-W型水平轉子離心機（湖南湘儀公司），于1.5 mL離心管中加入1.2 mL 1×NH4Cl預處理液。3）取150μL混勻的臨床全血，加入對應編號的1×NH4Cl預處理液離心管中。4）上下顛倒10次，室溫靜置5 min，此時1×NH4Cl裂解紅細胞。血樣與1×NH4Cl混勻，液體顏色會逐漸變?yōu)槌吻宓募t色。5）室溫700 g離心5 min，將上層透明紅色液體吸干凈，注意避免吸走管底白細胞。6）加入1mL1×NH4Cl徹底重懸白細胞，室溫700 g離心5min，將上層液體吸干凈，注意避免吸走管底白細胞。7）向富集有白細胞的離心管中加入50μL核酸純化保存液，反復吹打混勻。8）上機檢測時加入1.5μL處理液，處理后樣本置測序反應通用試劑盒中選擇相應溫度檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 一般資料

169例患者的平均年齡（77.82±10.57）歲；男67例（39.64%），女102例（60.36%）；均為漢族；使用華法林56例，氯吡格雷125例，阿司匹林83例。

2.2 基因型與表現(xiàn)型

2.2.1 華法林

VKORC1分型：GG2例，GA 11例，AA 43例，A等位基因頻率為86.61%；CYP2C9分型：AA 49例，AC 7例，C等位基因頻率為6.25%。詳見表1。

表1 3種抗凝藥物基因型頻率分布[例（%）]Tab.1 The genotype frequency distribution of three anticoagulant drugs[case（%）]

2.2.2 氯吡格雷

PON1分型：GG 48例，AG 59例，AA 18例，G等位基因頻率為62.00%；CYP2C19*2分型：GG48例，GA51例，AA 26例，A等位基因頻率為41.20%；CYP2C19*3分型：GG 113例，GA 12例，A等位基因頻率為4.80%；CYP2C19*17分型：CC 123例，CT 2例，T等位基因頻率為0.80%；ABCB1分型：TC 58例，CC 51例，TT 16例，C等位基因頻率為64.00%。CYP2C19*2，CYP2C19*3，CYP2C19*17等位基因可導致人群出現(xiàn)慢代謝型、中間代謝型、快代謝型和超快代謝型4種表型。詳見表1和表2。

表2 服用氯吡格雷患者的CYP2C19基因型及表現(xiàn)型分布（n=125）Tab.2 CYP2C19 genotype and phenotype distribution of patients treated with clopidogrel（n=125）

2.2.3 阿司匹林

GPⅢa PLA2分型：TT 80例，TC 3例，C等位基因頻率為1.81%；PEAR1分型：GG32例，GA 37例，AA 14例，A等位基因頻率為39.16%；PTGS1分型：AA 83例，G等位基因頻率為0；GP1BA分型：CC 75例，CT 7例，TT 1例，T等位基因頻率為5.42%；谷胱甘肽巰基轉移酶P1（GSTP1）分型：AA 49例，AG 26例，GG 8例，G等位基因頻率為25.30%。PTGS1基因多態(tài)性的G等位基因頻率為0，因此，無法計算χ2值，其余基因型的頻率未顯著偏離Hardy-Weinberg均衡。詳見表1。

3 討論

3.1 華法林用藥相關基因檢測

華法林通過抑制維生素K依賴性凝血因子（Ⅱ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅹ）的活化來介導抗凝作用[4]。不同個體之間維持劑量存在較大差異，主要與VKORC1和CYP2C9有關。VKORC1為華法林的作用靶點，是維生素K代謝過程中的限速酶，決定了維生素K環(huán)氧還原酶的活性[5]，控制維生素K依賴性凝血因子生成。突變AA型患者的VKORC1酶表達水平下降，維生素K循環(huán)受限。由表1可知，華法林VKORC1-1639 AA型患者43例（76.79%）需使用小劑量，GA型11例（19.64%）需減少劑量。華法林經CYP2C9代謝失活，CYP2C9具有高度多態(tài)性，CYP2C9*3在亞洲人中更普遍[6]，CYP2C9基因突變導致華法林在體內蓄積，應減量，VKORC1和CYP2C9基因檢測結果用于起始劑量和維持劑量的計算。文獻[7-8]顯示，華法林的維持劑量存在民族差異。華法林的維持劑量隨著VKORC1的變異而降低，純合子VKORC 1變異攜帶者在白種人、西班牙人和亞洲人中分別為15%，15%，79%。因此，華法林用量白種人最高，亞洲人最低。國際華法林遺傳藥理學協(xié)會（IWPC）根據不同種族人群的大量數(shù)據提煉遺傳藥理學的劑量計算法則，應用于華法林劑量的調整[9]。VKORC1-1639 AA型在中國人群中占多數(shù)，可能是中國人華法林應用劑量偏低的原因。2007年，PDA已把遺傳藥理學的信息增加到華法林產品標簽中[10]。

3.2 氯吡格雷用藥相關基因檢測

氯吡格雷作為一種前體藥物，經口服后在小腸中的吸收受到ABCB1基因編碼的P-糖蛋白調控，85%在血液中轉化為非活性的氯吡格雷酸并被代謝掉，余下15%在肝臟中通過細胞色素P450酶、PON1酶等催化轉化為活性代謝物，選擇性地、不可逆地與血小板中的P2Y12受體結合，抑制血小板聚集[11]。在氯吡格雷轉化為活性代謝物的過程中，細胞色素P450酶系起著非常重要的作用。細胞色素P450在單加氧酶家族中屬高度多態(tài)性酶系，基因多態(tài)性與酶的活性緊密相關。其中主要以CYP2C19*2在基因介導的氯吡格雷反應中占主導作用。CYP2C19的表型多態(tài)性具有明顯的種族差異，白種人慢代謝型發(fā)生率僅為3%，津巴布韋黑種人慢代謝型發(fā)生率僅為4%，中國人慢代謝型發(fā)生率僅為15%～17%[12]。本研究中，對125例服用氯吡格雷的患者進行CYP2C19*2，CYP2C19*3和CYP2C19*17等位基因檢測，其中超快代謝型為0，快代謝為32.80%，中間代謝為43.20%，慢代謝為24.00%。對于中間代謝型和慢代謝型患者在使用氯吡格雷時應注意氯吡格雷抵抗。2015年實行的《藥物代謝酶和藥物作用靶點基因檢測技術指南（試行）概要》[13]建議CYP2C19*1/*1基因型個體應用氯吡格雷有效，可常規(guī)使用；CYP2C19*2/*3基因型個體對氯吡格雷療效降低，建議更換為普拉格雷或替卡格雷；CYP2C19*2/*3突變型純合子個體應用氯吡格雷效果差，建議換用普拉格雷或替卡格雷。同時，CYP2C19的活性受多種藥物影響，質子泵抑制劑（PPI）作為該酶的底物可競爭性地抑制氯吡格雷的代謝。國家藥品監(jiān)督管理局藥品不良反應信息通報（第55期）《警惕質子泵抑制劑的骨折、低鎂血癥風險以及與氯吡格雷的相互作用》及文獻[14-15]顯示，某些PPI會降低氯吡格雷的療效，患者血栓不良事件增加。其中，奧美拉唑對CYP2C19具有高度親和力，大大降低氯吡格雷療效，因而抗血小板作用影響最強，泮托拉唑具有獨特的Ⅱ相代謝途徑，所以對氯吡格雷影響最弱。

3.3 阿司匹林用藥相關基因檢測

3.3.1 阿司匹林抵抗相關基因

阿司匹林抵抗通常是指阿司匹林不能發(fā)揮預期的生物學作用或不能預防栓塞性疾病，發(fā)生率為5.5%～60.0%[16]?；蚨鄳B(tài)性在阿司匹林抵抗中起著重要作用，主要集中在GPⅢa，PEAR1，PTGS1等。

GPⅡb/Ⅲa是血小板表面的受體蛋白，與vWF和纖維蛋白原均可引發(fā)血小板的聚集，是血小板激活的最后環(huán)節(jié)。其中，GpⅢa是一種多型蛋白，最常見的等位基因亞型是PLA1和PLA2。PLA2位點的外顯子2位置的T突變?yōu)镃，導致GPⅢa蛋白的第33個位點從脯氨酸變?yōu)榱涟彼?。體外研究表明，PLA2基因突變可增加血小板表面的GPⅡb/Ⅲa對纖維蛋白原的反應，增加血小板聚集，這是導致阿司匹林抵抗的主要原因[17]。

PEAR1是參與血小板激活途徑的一種橫跨細胞膜的分子，磷酸化作用可促進血小板聚集。研究證明，中國人群中PEAR1的野生G基因的基因頻率為0.61%，突變A基因的基因頻率為0.39%[18]。突變基因型AA或AG的患者使用阿司匹林（或結合氯吡格雷）時的心肌梗死發(fā)生率和死亡率會增高。

阿司匹林主要通過抑制環(huán)氧合酶1（COX-1）和環(huán)氧合酶2（COX-2）發(fā)揮藥理作用，可使COX-1位點甲基化而使該酶失活，阻斷血小板聚集反應。阿司匹林對COX-2的抑制作用遠低于COX-1，且有研究表明主要是編碼COX-1的PTGS1基因多態(tài)性與發(fā)生阿司匹林抵抗相關。LEP?NTALO等[19]以血小板聚集率為標準定義阿司匹林抵抗，發(fā)現(xiàn)60%的阿司匹林抵抗患者均攜帶突變位點G，而無阿司匹林抵抗者僅有17%攜帶突變基因。

由表1可知，阿司匹林PTGS1基因無患者攜帶突變位點G，均為AA野生型。GPⅢa PLA2等位基因由T突變?yōu)镃有3例，突變頻率為3.61%。PEAR1基因AA型14例，突變頻率為16.87%；GA型37例，突變頻率為44.58%。應注意患者發(fā)生阿司匹林抵抗的風險。

3.3.2 其他相關基因

MATSUBARA等[20]首次發(fā)現(xiàn)，GP1BA基因145Thr突變?yōu)镸et（即5792 C＞T）會增強患者對阿司匹林抗血小板的敏感性。SHIOTANI等[21]研究發(fā)現(xiàn)，GSTP1基因的G位點可能與腸道出血的風險增加有關，GG型和AG型使用阿司匹林消化道出血風險增加。本研究結果顯示，GP1BA基因CT型7例，突變頻率為8.43%，對阿司匹林抗血小板的敏感性增強。提示用藥過程中應關注患者的出血風險。GSTP1基因GG型8例，突變頻率為9.64%；AG型26例，突變頻率為31.33%?？梢姡嘶蝾愋突颊咴谑褂冒⑺酒チ謺r應密切關注消化道出血風險。

3.4 小結

華法林的出血風險，氯吡格雷和阿司匹林的抵抗，均會導致患者心血管不良事件的發(fā)生率大大增加。除了疾病和依從性因素外，相關基因突變是造成藥物出血或抵抗的重要因素?；蛐蜋z測可為臨床提供患者藥物相關的遺傳信息，結合臨床實際和相關實驗室檢查結果，對實行個體化治療具有重要意義。