白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化功能和Nrf2通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

張成,王馳,王孝成,趙菲,耿照玉

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽 合肥 230036)

高溫是制約畜禽生產(chǎn)的關(guān)鍵有害環(huán)境因子之一。家禽沒(méi)有汗腺,全身被羽毛覆蓋,不易散熱,更容易受到環(huán)境高溫的影響。環(huán)境高溫導(dǎo)致家禽內(nèi)分泌和免疫功能紊亂[1-2],進(jìn)而導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育受阻,死亡率升高,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1,3]。如何緩解熱應(yīng)激及其作用機(jī)制成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)之一。研究表明,營(yíng)養(yǎng)調(diào)控是緩解熱應(yīng)激的有效手段。白藜蘆醇作為一種廣泛存在于虎杖、花生等多種植物中的天然多酚類(lèi)化合物,具有抗炎、調(diào)節(jié)能量代謝等多種生物學(xué)功能[4-6]。白藜蘆醇可以調(diào)節(jié)血液中物質(zhì)代謝,維持動(dòng)物體內(nèi)穩(wěn)態(tài),減緩熱應(yīng)激的負(fù)面影響[7-8]。在大鼠上的研究表明,在機(jī)體物質(zhì)代謝、免疫及解毒等方面均發(fā)揮重要作用的肝臟易遭受熱應(yīng)激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,而白藜蘆醇對(duì)其具有緩解作用[9]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究表明,飼糧中添加白藜蘆醇可顯著緩解熱應(yīng)激對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能和抗氧化能力的負(fù)面作用[6,8],但其分子機(jī)制有待探究。核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作為抗氧化系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化能力具有至關(guān)重要的作用[10-11]。白藜蘆醇可提高Nrf2表達(dá),從而激活其下游抗氧化基因的表達(dá),進(jìn)而提高機(jī)體抗氧化能力,清除自由基,緩解氧化應(yīng)激損傷[12]。據(jù)此,我們推測(cè)白藜蘆醇是通過(guò)調(diào)控?zé)釕?yīng)激肉雞Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)而提高抗氧化能力,從而發(fā)揮其緩解熱應(yīng)激負(fù)面作用的功能。因此,本試驗(yàn)探究飼糧添加白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)、血清生化指標(biāo)的影響,重點(diǎn)考察其對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化能力及Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的調(diào)控模式,為白藜蘆醇作為功能性飼料添加劑在家禽生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼糧

試驗(yàn)選取1日齡愛(ài)拔益加(Arbor Acres,AA)雄性肉仔雞300羽,常規(guī)飼養(yǎng)及免疫。21日齡時(shí),選取體重相近的肉雞54羽,隨機(jī)分為3組:對(duì)照組、熱應(yīng)激組和熱應(yīng)激+白藜蘆醇組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù) 6羽。對(duì)照組和熱應(yīng)激組飼喂基礎(chǔ)飼糧,熱應(yīng)激+白藜蘆醇組在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg·kg-1白藜蘆醇[13]。試驗(yàn)期間自由采食飲水。對(duì)照組室溫控制為(22±1)℃;每日08:00至18:00,熱應(yīng)激組和熱應(yīng)激+白藜蘆醇組室溫控制(33±1)℃,其余時(shí)段溫度與對(duì)照組一致(升、降溫均在15 min內(nèi)完成)。環(huán)境相對(duì)濕度約為70%(利用加濕器控制室內(nèi)濕度)。試驗(yàn)期21 d。白藜蘆醇(Celex Laboratories Inc.)純度大于98%?；A(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1[14-16]。

表1 基礎(chǔ)飼糧原料組成及營(yíng)養(yǎng)組成水平Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diets(air-dry basis) %

1.2 樣品采集與處理

試驗(yàn)結(jié)束前12 h停止喂料,試驗(yàn)結(jié)束時(shí)試驗(yàn)雞稱(chēng)重,每個(gè)重復(fù)選取接近平均體重的試驗(yàn)雞2羽,翅靜脈采血3 mL,3 000 r·min-1離心15 min,分離血清,置于-20 ℃保存待測(cè)。試驗(yàn)雞采血后屠宰,采取肝臟樣品,裝入滅菌凍存管中,液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

分別于試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí),稱(chēng)取肉雞空腹初始體重和終末體重,統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間總采食量,計(jì)算試驗(yàn)肉雞平均日增重(average daily gain,ADG)、平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)和料重比(F/G)。

1.4 器官指數(shù)測(cè)定

摘取肝臟、脾臟、法氏囊和胸腺,稱(chēng)重,按以下公式計(jì)算器官指數(shù)。

器官指數(shù)(g·kg-1)=器官重(g)/體重(kg)。

1.5 血清生化指標(biāo)測(cè)定

血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)活性和總蛋白(total protein,TP)、白蛋白(albumin,ALB)、葡萄糖(glucose,GLU)、甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDLC)及低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDLC)含量測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒。

1.6 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

肝臟中過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)、谷胱甘肽疏基轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GSH-ST)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)和蛋白質(zhì)羰基(protein carbonyl,PC)含量均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定。樣品制備:稱(chēng)取1 g肝臟組織,按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例,加入預(yù)冷的生理鹽水,在冰浴條件下機(jī)械勻漿,制成10%的勻漿液,于4 ℃條件下3 000g離心10 min,取上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定

肝臟組織中總RNA使用Trizol試劑(Thermo Fisher Scientific,USA)提取。采用Hifair?Ⅱ第1鏈(Yeasen,中國(guó))試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到cDNA模板。用Hieff?熒光定量試劑盒(Yeasen,中國(guó))和ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照熒光定量試劑盒。以β-actin為內(nèi)參基因,目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法計(jì)算。所有引物由安徽通用生物科技有限公司合成,序列見(jiàn)表2。

表2 Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因的引物序列Table 2 Primers sequences of Nrf2 Signaling pathway-related genes

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知:與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組肉雞的終末體重、ADG和ADFI顯著降低(P<0.05),F/G顯著升高(P<0.05);與熱應(yīng)激組相比,熱應(yīng)激+白藜蘆醇組肉雞終末體重和ADG(P<0.05)顯著提高,F/G顯著降低(P<0.05)。

表3 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響(n=3)Table 3 Effects of resveratrol on growth performance of heat-stressed broilers

2.2 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞器官指數(shù)的影響

由表4可知:與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組肉雞肝臟、脾臟及胸腺指數(shù)顯著下降(P<0.05);與熱應(yīng)激組相比,熱應(yīng)激+白藜蘆醇組肉雞脾臟及胸腺指數(shù)顯著提高(P<0.05)。

表4 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞器官指數(shù)的影響(n=6)Table 4 Effects of resveratrol on organ indexes of heat-stressed broilers g·kg-1

2.3 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞血清生化指標(biāo)的影響

由表5可知:與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組肉雞血清中ALT活性和TG、TC含量顯著升高(P<0.05),GLU和TP含量顯著降低(P<0.05);與熱應(yīng)激組相比,熱應(yīng)激+白藜蘆醇組肉雞血清中ALT活性顯著降低(P<0.05),GLU和TP含量顯著升高(P<0.05)。

2.4 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知:與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組肉雞肝臟中CAT、GPX、GSH-ST和 SOD活性顯著降低(P<0.05),MDA和PC含量顯著上升(P<0.05);與熱應(yīng)激組相比,熱應(yīng)激+白藜蘆醇組肉雞肝臟中GPX和SOD活性顯著升高(P<0.05),MDA含量顯著下降(P<0.05)。

表6 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化指標(biāo)的影響(n=6)Table 6 Effects of resveratrol on antioxidant index in liver of heat-stressed broilers

2.5 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

由表7可知:與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組肉雞肝臟Nrf2、HO-1和SOD1基因mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05),而Keap1基因mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05);與熱應(yīng)激組相比,熱應(yīng)激+白藜蘆醇組肉雞肝臟Nrf2、HO-1和SOD1基因mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05),而Keap1基因mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)。

表7 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟Nrf2信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響(n=6)Table 7 Effects of resveratrol on the expression of Nrf2 signaling pathway-related genes in liver of heat-stressed broilers

3 討論

3.1 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞生長(zhǎng)性能的影響

熱應(yīng)激導(dǎo)致肉雞生理狀態(tài)失衡,抗氧化性能降低,免疫功能下降,是限制肉雞生產(chǎn)的重要環(huán)境因子[17-18]。前人研究表明,熱應(yīng)激會(huì)降低肉雞終末體重和ADFI[5];Zhang等[19]試驗(yàn)結(jié)果也表明,肉雞在高溫條件下終末體重和飼料轉(zhuǎn)化率均顯著下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激誘導(dǎo)肉雞生產(chǎn)性能顯著下降。這可能是因?yàn)闊釕?yīng)激對(duì)消化系統(tǒng)、內(nèi)臟器官供血不足,進(jìn)而影響其生長(zhǎng)及生理功能[20]。研究表明,熱應(yīng)激導(dǎo)致的肉雞生產(chǎn)性能下降可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控來(lái)緩解[5,21]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,熱應(yīng)激組肉雞終末體重、ADG、ADFI和飼料轉(zhuǎn)化效率較對(duì)照組顯著降低,而在飼糧中添加白藜蘆醇能有效緩解熱應(yīng)激對(duì)肉雞生產(chǎn)性能造成的不利影響,這與Liu等[5]在烏骨雞上的研究結(jié)果一致。

3.2 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞免疫器官指數(shù)的影響

法氏囊、胸腺、肝臟和脾臟是家禽最為重要的免疫器官,參與其細(xì)胞和體液免疫過(guò)程,免疫器官的生長(zhǎng)和發(fā)育是維持免疫功能的基礎(chǔ)。熱應(yīng)激對(duì)免疫器官的發(fā)育造成不利影響,并造成肉雞免疫功能損傷[5-6]。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激導(dǎo)致肉雞法氏囊和脾臟器官指數(shù)顯著下降。已證實(shí)免疫功能損傷可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)來(lái)調(diào)控。本試驗(yàn)結(jié)果表明,相比對(duì)照組,熱應(yīng)激組肉雞肝臟、脾臟和胸腺的器官指數(shù)均顯著降低,而飼糧中添加白藜蘆醇顯著提高了熱應(yīng)激肉雞胸腺和脾臟的器官指數(shù),這提示白藜蘆醇可改善熱應(yīng)激對(duì)肉雞免疫功能的不利影響。

3.3 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞血清生化指標(biāo)的影響

血清酶活性的高低直接與相應(yīng)組織器官代謝水平的功能狀態(tài)相關(guān)[22]。ALT和AST是反映雞應(yīng)激狀態(tài)較為敏感的指標(biāo),也是肝臟細(xì)胞功能酶,當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí),細(xì)胞膜通透性增加,胞漿內(nèi)的ALT和AST釋放入血[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激導(dǎo)致血液ALT活性顯著升高,說(shuō)明熱應(yīng)激可能對(duì)肝臟細(xì)胞及其功能造成損傷,這與郝生燕等[22]的研究結(jié)果相符;而飼糧中添加白藜蘆醇顯著降低了熱應(yīng)激肉雞血清ALT活性,說(shuō)明白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟具有保護(hù)作用。除了血清中多種代謝酶,熱應(yīng)激還會(huì)影響其他代謝物質(zhì)的含量。TP是反映機(jī)體蛋白質(zhì)合成效率的重要指標(biāo),GLU含量變化可反映機(jī)體對(duì)碳水化合物的利用率[24],熱應(yīng)激導(dǎo)致肉雞血清中GLU[8]和TP[25]含量降低。張彩云等[26]研究表明,白藜蘆醇可顯著影響肉雞血清生化指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加白藜蘆醇可有效緩解熱應(yīng)激對(duì)肉雞血液中TP和GLU含量的影響,說(shuō)明白藜蘆醇可有效緩解熱應(yīng)激對(duì)肉雞機(jī)體蛋白質(zhì)和糖代謝的影響。TG的來(lái)源主要分為內(nèi)源性和外源性,而內(nèi)源性TG主要在肝臟中合成。本實(shí)驗(yàn)室Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激會(huì)顯著提高肉雞血清中TG含量;He等[25]報(bào)道,飼糧中添加350、500 mg·kg-1的白藜蘆醇顯著降低熱應(yīng)激肉雞血清中TG含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明,熱應(yīng)激引起肉雞血清TG含量顯著升高,而在飼糧中添加白藜蘆醇可顯著降低熱應(yīng)激肉雞血清中TG含量,這提示白藜蘆醇可有效調(diào)節(jié)熱應(yīng)激對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝的影響。據(jù)報(bào)道,白藜蘆醇抑制熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)基因的表達(dá)[5],而HSP可能通過(guò)改善胰島素敏感性來(lái)增強(qiáng)胰島素功能[27]。因此,白藜蘆醇可能通過(guò)提高胰島素敏感性,導(dǎo)致糖酵解和脂肪合成,調(diào)節(jié)了熱應(yīng)激肉雞血清中GLU和TG的含量。

3.4 白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞肝臟抗氧化能力和Nrf2通路相關(guān)基因的影響

高溫環(huán)境會(huì)破壞動(dòng)物機(jī)體氧化還原平衡,導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量聚集,引起脂質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化及DNA損傷,最終誘發(fā)氧化應(yīng)激[12,28]。熱應(yīng)激導(dǎo)致肉雞肌肉ROS含量顯著提高[19],這可能是導(dǎo)致肌肉中MDA和PC含量顯著增加的原因[29-30]。白藜蘆醇具有很好的親脂性并具有特殊的多酚結(jié)構(gòu),能有效清除自由基,并抑制機(jī)體內(nèi)二硫化谷胱甘肽的形成,保持谷胱甘肽的還原狀態(tài),抑制自由基的形成,保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷[31]。Zhang等[6,8]研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加白藜蘆醇顯著降低熱應(yīng)激肉雞脾臟和肌肉中MDA含量。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,熱應(yīng)激組肉雞肝臟中MDA和PC含量顯著提高,而飼糧添加白藜蘆醇可顯著降低肝臟中MDA含量,說(shuō)明白藜蘆醇可有效緩解熱應(yīng)激誘發(fā)的氧化損傷,但其作用機(jī)制需進(jìn)一步探究。

動(dòng)物機(jī)體氧化還原平衡可通過(guò)多種抗氧化酶維持[29]。Liu等[5]研究發(fā)現(xiàn),高溫條件下,肉雞血清中GPX、SOD和CAT活性顯著降低;Zhang等[6]研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激會(huì)引起肉雞脾臟CAT和T-SOD活性下降;本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致,說(shuō)明熱應(yīng)激損害了肉雞酶促抗氧化系統(tǒng)。Nrf2是調(diào)控機(jī)體抗氧化能力的重要轉(zhuǎn)錄因子,調(diào)節(jié)著SOD、CAT、HO-1、GST、GR和GPX等多種抗氧化酶的表達(dá),對(duì)于維持機(jī)體氧化還原平衡至關(guān)重要,而Keap-1對(duì)Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)功能[12,28]。前期研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激顯著降低了肉雞脾臟中Nrf2、GPX、錳超氧化物歧化酶(manganese-containing superoxide dismutase,MnSOD)和HO-1mRNA表達(dá)量[6];此外,Sahin等[3]研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激顯著降低肉雞肌肉中Nrf2蛋白表達(dá)水平以及SOD和GPX活性,上述試驗(yàn)說(shuō)明熱應(yīng)激抑制了Nrf2信號(hào)通路的激活。早期研究發(fā)現(xiàn),飼糧中添加白藜蘆醇促進(jìn)熱應(yīng)激肉雞脾臟中Nrf2、CAT、MnSOD和GRmRNA表達(dá)水平,提高T-SOD、CAT和GSH多種抗氧化酶活性[6];Sahin等[32]以鵪鶉為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可線(xiàn)性提高肝臟中Nrf2含量,并提高肝臟中SOD、CAT和GPX活性,這些研究都表明白藜蘆醇作為飼料添加劑是緩解熱應(yīng)激導(dǎo)致的抗氧化系統(tǒng)紊亂的有效手段[33]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,熱應(yīng)激顯著降低了肉雞肝臟中Nrf2、HO-1和SOD1的mRNA表達(dá)量,同時(shí)提高了Keap1的mRNA表達(dá)量,提示熱應(yīng)激抑制了Nrf2通路的激活,這可能是熱應(yīng)激誘導(dǎo)肝臟發(fā)生氧化應(yīng)激損傷的主要原因;而飼糧中添加白藜蘆醇顯著提高了熱應(yīng)激肉雞肝臟中Nrf2、HO-1和SOD1 mRNA表達(dá)量及GPX和SOD活性,并顯著降低了Keap1mRNA表達(dá)水平,說(shuō)明白藜蘆醇可有效緩解熱應(yīng)激對(duì)肉雞抗氧化系統(tǒng)的損傷,其機(jī)制可能歸因于白藜蘆醇對(duì)Nrf2信號(hào)通路的激活。

綜上,飼糧添加白藜蘆醇對(duì)熱應(yīng)激肉雞的生長(zhǎng)性能、免疫器官發(fā)育、血清生化指標(biāo)及抗氧化能力具有有益作用;白藜蘆醇能提高熱應(yīng)激肉雞的抗氧化能力,進(jìn)而緩解氧化損傷的機(jī)制可能與其激活Nrf2信號(hào)通路關(guān)鍵抗氧化基因的表達(dá)有關(guān)。