蘆丁對熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能的影響

唐宇杰,盧浩誠,韓兆玉,李惠俠

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院/草食動物研究所,江蘇 南京 210095)

早期研究中,用于描述人在溫?zé)岘h(huán)境下舒適程度的溫?zé)嶂笖?shù)(temperature-humidity index,THI)逐漸應(yīng)用到家畜生產(chǎn)中,用以評定家畜所處的溫?zé)岘h(huán)境以及家畜的耐熱性能[1]。南方夏季高溫高濕,奶牛長期處于不利于生理活動的環(huán)境下。處于熱應(yīng)激狀態(tài)下的奶牛生產(chǎn)性能與繁殖性能水平急劇下滑,嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益[2]。目前國內(nèi)外研究人員都在尋求減緩熱應(yīng)激的方法以解除奶牛業(yè)發(fā)展的掣肘,除常見的物理降溫措施外,選擇安全高效的飼料添加劑也許是一條更為廣闊的途徑。

蘆丁(rutin)是一種從植物中提取的黃酮類化合物,并且結(jié)構(gòu)上與內(nèi)源性雌激素具有相似的特性[3],通常認(rèn)為這樣的結(jié)構(gòu)可以通過結(jié)合于雌激素所占據(jù)的雌激素受體的位點而發(fā)揮類雌激素樣作用。已有研究表明,大豆黃酮可以提高蛋雞產(chǎn)蛋性能[4],改善妊娠母豬的繁殖性能與免疫機(jī)能的作用[5],據(jù)此推測蘆丁能夠提高奶牛生產(chǎn)性能與抗逆能力。此外蘆丁還被證明具有抗癌[6]、抗心腦血管疾病、抗氧化[7]、減輕陣痛、抗炎癥[8]、抗血小板聚集以及舒張血管[9]等作用。

在受到應(yīng)激刺激后,細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白、糖類的合成代謝均會發(fā)生相應(yīng)的改變,與之相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)量會發(fā)生變化,細(xì)胞合成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與糖的能力也隨之改變。故本試驗以荷斯坦奶牛為試驗對象,在日糧中添加蘆丁研究對夏季奶牛抗熱能力、生產(chǎn)性能的影響,并初步探究蘆丁影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)與脂質(zhì)合成、蛋白質(zhì)合成、乳糖合成變化的潛在機(jī)制,為蘆丁在畜禽生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、材料及試驗藥品

試驗荷斯坦奶牛由安徽省宿州市草源牧業(yè)股份有限公司提供;飼養(yǎng)試驗所用蘆丁(95%,20200116)購自巨邦植物原料(什邡)有限公司。奶牛乳腺上皮細(xì)胞系(bovine mammary epithelial cells,MAC-T)為哈佛大學(xué)孫友平博士贈送;體外試驗所用蘆丁(95%,S13033)購自源葉生物科技(上海)有限公司。奶樣采集后于南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司檢測中心進(jìn)行奶牛生產(chǎn)性能(DHI)檢測。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)購自HyClone公司;胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)購自Gibco公司;細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司;RNA isolater(Trizol)、HiScript?Ⅲ RT SuperMix、AceQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix購自諾唯贊生物科技(南京)有限公司;凋亡檢測試劑盒(Annexin V-Alexa Fluor 647/PI)購自福麥斯生物技術(shù)(南京)有限公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)水購自奧青生物科技有限公司。所用儀器:美國ABI公司的熒光定量PCR儀(Quant-Studio7 Flex),美國Thermo公司全波長酶標(biāo)儀(Multiskan Go)和微量分光光度計(ND-1000),丹麥FOSS公司的多功能乳品質(zhì)分析儀(MilkoScanTMFT+)和體細(xì)胞分析儀(FossomaticTMFC)。

1.3 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

本試驗采用單因素試驗設(shè)計,選擇體重600 kg左右、生理情況與生產(chǎn)性能基本一致的健康圍產(chǎn)期荷斯坦牛30頭(5胎牛,泌乳期150 d左右),隨機(jī)分為3組,對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,試驗1、2組于日糧中分別添加2和3 g蘆丁,每日1次加入TMR機(jī)攪拌混勻飼喂,試驗期為60 d。試驗期內(nèi)自由飲水、采食?；A(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)組成水平Table 1 Composition and nutrient content of basal diet %

1.4 數(shù)據(jù)收集和指標(biāo)測定

1.4.1 溫?zé)嶂笖?shù)于牛舍中部距離地面1.5 m處掛干濕度溫度計,試驗期內(nèi)每10 d記錄牛舍內(nèi)溫度(T)與相對濕度(RH),計算溫?zé)嶂笖?shù)(THI)。計算公式:THI=(1.8×T+32)-(0.55-0.55×RH×0.01)×(1.8×T-26)。當(dāng)THI為68～71時,動物處于熱應(yīng)激狀態(tài),72～79為輕度熱應(yīng)激狀態(tài),80～89為中度熱應(yīng)激狀態(tài),大于90時,為重度熱應(yīng)激狀態(tài)。

1.4.2 呼吸頻率試驗期內(nèi)每10 d記錄各組奶牛每分鐘的呼吸頻率。每次重復(fù)測定3次取平均值,測定時在牛安靜狀態(tài)下,站在牛腹部后側(cè)方觀察,胸腹部一起一伏記為呼吸1次。

1.4.3 直腸溫度試驗期內(nèi)每15 d測量各組奶牛的直腸溫度。檢查體溫計完好后將體溫計的水銀柱甩至35 ℃以下,用酒精棉球擦拭體溫計進(jìn)行消毒,緩緩旋動體溫計插入牛的肛門內(nèi)并固定,停留3～5 min后取出讀數(shù)。

1.4.4 奶樣采集試驗期內(nèi)每10 d記錄各組奶牛產(chǎn)奶量數(shù)據(jù)并采集奶樣。采集日當(dāng)天收集奶牛早、中、晚3次奶樣50 mL,按早、中、晚4∶3∶3(體積比)比例混合,取50 mL移入新采奶管,滴入2滴防腐劑后保存,用于統(tǒng)計奶牛DHI數(shù)據(jù)。

1.4.5 4%乳脂矯正乳與能量矯正乳計算為分析各組奶牛之間生產(chǎn)性能及飼喂效率的差異,對采集到的奶樣DHI數(shù)據(jù)與產(chǎn)奶量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算,將不同乳脂含量的乳矯正為含4%乳脂的標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài),即乳脂矯正乳(fat corrected milk,FCM)。計算公式:FCM=0.4M+15F。式中:FCM為乳脂矯正乳質(zhì)量,M為非標(biāo)準(zhǔn)乳質(zhì)量,F為非標(biāo)準(zhǔn)乳含脂量,單位均為kg。將乳蛋白率與乳脂率經(jīng)過矯正,計算能量矯正乳(energy corrected milk,ECM)。計算公式:ECM=12.28F+7.13P+0.323M。式中:ECM為能量矯正乳質(zhì)量,F為非標(biāo)準(zhǔn)乳含脂量,P為非標(biāo)準(zhǔn)乳含蛋白量,M為非標(biāo)準(zhǔn)乳質(zhì)量,單位均為kg。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

1.5.1 蘆丁毒性檢測蘆丁溶于二甲基亞砜(DMSO),DMSO占培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)的0.4%,奶牛乳腺上皮細(xì)胞系接種于細(xì)胞專用T25培養(yǎng)瓶,用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM/F12液體培養(yǎng)基培養(yǎng),傳至第3代。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期時,用胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞濃度為105mL-1,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔培養(yǎng)基為100 μL。培養(yǎng)至孔底部細(xì)胞融合度為70%時更換培養(yǎng)基。對照組添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基,試驗1組添加0.4% DMSO,試驗2、3、4和5組分別添加10、20、40和 80 μg·mL-1蘆丁。均于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑,培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光值(D450),計算細(xì)胞存活率,分析蘆丁對細(xì)胞是否存在毒性。計算公式:細(xì)胞存活率=(試驗孔吸光值-空白孔吸光值)/(對照孔吸光值-空白孔吸光值)×100%。

1.5.2 熱應(yīng)激處理與細(xì)胞活力檢測將奶牛乳腺上皮細(xì)胞按105mL-1接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔培養(yǎng)基為100 μL,培養(yǎng)至孔底部細(xì)胞融合度為70%時更換培養(yǎng)基,分為對照組、試驗1、2、3和4組,培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入42 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h進(jìn)行熱應(yīng)激處理,然后放入37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)恢復(fù)培養(yǎng)12 h,再于每孔加入10 μL CCK-8試劑,培養(yǎng)3 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光值(D450),計算細(xì)胞存活率,分析蘆丁對熱應(yīng)激處理下細(xì)胞活力的影響。根據(jù)毒性檢測與細(xì)胞活力檢測結(jié)果,確定測定mRNA表達(dá)量時所添加的蘆丁劑量。

1.5.3 總RNA提取與RT-qPCR分析將細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,熱應(yīng)激處理并恢復(fù)培養(yǎng)步驟同1.5.2節(jié),使用RNA提取試劑提取奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA,微量分光光度計檢測RNA純度與濃度(1.8

表2 本試驗RT-qPCR所用引物序列Table 2 The primer sequence used for RT-qPCR in this experiment

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗期60 d內(nèi)溫?zé)嶂笖?shù)

由圖1可見,在試驗期60 d內(nèi),奶牛均處于熱應(yīng)激的狀態(tài),試驗10 d時溫?zé)嶂笖?shù)大于90,此時奶牛處于高度熱應(yīng)激狀態(tài),試驗20～40 d THI為78～89,此時奶牛處于中度熱應(yīng)激狀態(tài),試驗50～60 d THI均大于73,此時奶牛處于輕度熱應(yīng)激狀態(tài)。

圖1 試驗期(60 d)內(nèi)奶牛溫?zé)嶂笖?shù)變化Fig.1 Dynamic of temperature and heat index change of dariy cow in 60 days during the test period

2.2 蘆丁對奶牛呼吸頻率與直腸溫度的影響

由圖2可見:與對照組相比,在試驗45 d時,試驗1組與試驗2組奶牛直腸溫度顯著降低(P<0.05);在試驗60 d時,試驗1組奶牛直腸溫度極顯著降低(P<0.01),試驗2組奶牛直腸溫度顯著降低(P<0.05);呼吸頻率均無顯著差異(P>0.05)。

圖2 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激奶牛直腸溫度與呼吸頻率的影響Fig.2 Effects of dietary rutin on rectal temperature and respiratory rate in heat stressed dairy cows與對照組相比較*和**分別表示差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。下同。Compared with the control group,* and ** showed significant difference(P<0.05)and extremely significant difference(P<0.01). The same below.

2.3 蘆丁對熱應(yīng)激奶牛產(chǎn)奶量的影響

由圖3可見:與對照組相比,在試驗40和50 d時,試驗1組與試驗2組產(chǎn)奶量顯著提高(P<0.05);試驗60 d時試驗1組與試驗2組產(chǎn)奶量極顯著提高(P<0.01)。

圖3 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激奶牛產(chǎn)奶量的影響Fig.3 Effect of dietary rutin on milk yield of heat stressed dairy cows

2.4 蘆丁對熱應(yīng)激奶牛FCM與ECM產(chǎn)量的影響

由圖4可見:與對照組相比,試驗20和30 d試驗2組FCM產(chǎn)量顯著提高(P<0.05);試驗40 d試驗1組產(chǎn)量顯著提高(P<0.05),試驗2組產(chǎn)量極顯著提高(P<0.01);試驗50 d試驗1組與試驗2組產(chǎn)量均顯著提高(P<0.05);試驗60 d試驗1組與試驗2組產(chǎn)量均極顯著提高(P<0.01)。

圖4 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激奶牛乳脂矯正乳(FCM)與能量矯正乳(ECM)產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of dietary rutin on daily fat corrected milk(FCM)and energy corrected milk(ECM) yield of heat stressed dairy cows

與對照組相比,試驗40 d試驗1組ECM產(chǎn)量顯著提高(P<0.05),試驗2組產(chǎn)量極顯著提高(P<0.01);試驗50 d試驗1組與試驗2組產(chǎn)量均顯著提高(P<0.05);試驗60 d試驗1組與試驗2組產(chǎn)量均極顯著提高(P<0.01)。

2.5 蘆丁對熱應(yīng)激奶牛乳品質(zhì)的影響

由表3可見:與對照組相比,乳脂率無顯著差異(P>0.05);試驗40 d試驗1組乳蛋白率顯著升高(P<0.05),50和60 d試驗1組與試驗2組乳蛋白率均顯著升高(P<0.05);試驗50和60 d試驗1組與試驗2組乳糖率均顯著升高(P<0.05);試驗40、50和60 d試驗1組與試驗2組乳中體細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

表3 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激奶牛乳品質(zhì)的影響Table 3 Effects of dietary rutin on milk quality of heat stressed dairy cows

續(xù)表3 Table 3 continued

2.6 蘆丁對熱應(yīng)激奶牛乳成分含量的影響

由圖5可見:與對照組相比,試驗40 d試驗1組乳脂含量顯著提高(P<0.05),試驗2組乳脂含量極顯著提高(P<0.01);試驗50 d試驗1組與試驗2組乳脂含量均顯著提高(P<0.05);試驗60 d試驗1組與試驗2組乳脂含量均極顯著提高(P<0.01)。與對照組相比,試驗40、50和60 d試驗1組與試驗2組乳蛋白含量均極顯著提高(P<0.01)。與對照組相比,試驗10 d試驗1組乳糖含量顯著提高(P<0.05),試驗30 d試驗1組與試驗2組乳糖含量均顯著提高(P<0.05);試驗40 d試驗1組乳糖含量顯著提高(P<0.05),試驗2組乳糖含量極顯著提高(P<0.01);試驗50 d試驗1組與試驗2組乳糖含量均顯著提高(P<0.05);試驗60 d試驗1組與試驗2組乳糖含量均極顯著提高(P<0.01)。

圖5 日糧添加蘆丁對熱應(yīng)激奶牛乳成分含量的影響Fig.5 Effects of dietary rutin on milk composition of heat stressed dairy cows

2.7 蘆丁對BMEC的毒性作用

由表4可見:蘆丁以DMSO作溶劑,在培養(yǎng)基中占體積分?jǐn)?shù)的0.4%。與對照組相比,DMSO組及10、20、40 μg·mL-1蘆丁組對細(xì)胞均無毒性作用(P>0.05);80 μg·mL-1蘆丁組D450值極顯著降低(P<0.01),故后續(xù)試驗蘆丁添加量控制在40 μg·mL-1及以下。

表4 不同蘆丁添加量對BMEC的毒性作用Table 4 Toxic effect of different addition of rutin on BMEC

2.8 蘆丁對熱應(yīng)激處理BMEC活力的影響

由表5可見:與對照組相比,熱應(yīng)激處理下0、10和20 μg·mL-1蘆丁組細(xì)胞活力均極顯著下降(P<0.01),40 μg·mL-1蘆丁組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.05);對細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,與未添加蘆丁組相比,10和 20 μg·mL-1蘆丁組細(xì)胞活力無顯著差異(P>0.05),40 μg·mL-1蘆丁組細(xì)胞活力均極顯著提高(P<0.01);40 μg·mL-1蘆丁組細(xì)胞活力顯著高于10 μg·mL-1蘆丁組;20 μg·mL-1蘆丁組與40 μg·mL-1蘆丁組細(xì)胞活力無顯著差異(P>0.05),故后續(xù)試驗蘆丁添加量確定為40 μg·mL-1。

表5 不同蘆丁添加量對熱應(yīng)激下BMEC活力的影響Table 5 Effects of different addition of rutin on the viability of BMEC under heat stress

2.9 蘆丁對熱應(yīng)激處理BMEC HSP70、HSP90基因表達(dá)的影響

由圖6可見:對BMEC進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,HSP70與HSP90基因均過表達(dá);與熱應(yīng)激處理組相比,40 μg·mL-1蘆丁組HSP70mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05),HSP90mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖6 熱應(yīng)激處理后蘆丁對BMEC HSP70、HSP90基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of rutin on the expression of HSP70 and HSP90 mRNA in BMEC under heat stressCon:對照Control;HS:熱應(yīng)激Heat stress;HS+Rutin:熱應(yīng)激+蘆丁Heat stress+Rutin. 下同。The same below.

2.10 蘆丁對BMEC乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖7可見:與對照組相比,對BMEC進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,熱應(yīng)激處理組ACC、DGAT2、SREBP1表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),FASN表達(dá)量顯著降低(P<0.05);與熱應(yīng)激組相比,40 μg·mL-1蘆丁組ACC、DGAT2、SREBP1表達(dá)量顯著升高(P<0.05),FASN表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

圖7 蘆丁對BMEC乳脂合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of rutin on the expression of lipid synthesis related genes in BMEC

2.11 蘆丁對BMEC乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖8可見:與對照組相比,對BMEC進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,熱應(yīng)激組CSN1S1、CSN2表達(dá)量極顯著降低(P<0.01);與熱應(yīng)激組相比,40 μg·mL-1蘆丁組CSN1S1表達(dá)量極顯著升高(P<0.01),CSN2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖8 蘆丁對BMEC乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effects of rutin on the expression of milk protein synthesis related genes in BMEC

2.12 蘆丁對BMEC乳糖合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖9可見:與對照組相比,對BMEC進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,熱應(yīng)激處理組GLUT1mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01);與熱應(yīng)激組相比,40 μg·mL-1蘆丁添加組GLUT1表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

圖9 蘆丁對BMEC乳糖合成相關(guān)基因GLUT1表達(dá)的影響Fig.9 Effect of rutin on the expression of lactose synthesis related genes GLUT1 in BMEC

3 討論

3.1 蘆丁對熱應(yīng)激奶牛熱應(yīng)激指標(biāo)的影響

環(huán)境溫?zé)嶂笖?shù)與奶牛的呼吸頻率、直腸溫度是最常用的用來判斷奶牛是否處于熱應(yīng)激狀態(tài)的指標(biāo)[10],在試驗期60 d內(nèi),環(huán)境溫?zé)嶂笖?shù)均高于72,表明奶牛長期處于熱應(yīng)激狀態(tài)[11],為后續(xù)研究提供了良好模型。在本試驗中,日糧中添加蘆丁并飼喂超過30 d,能有效降低奶牛的直腸溫度,但對呼吸頻率無顯著影響,結(jié)合試驗期溫?zé)嶂笖?shù)變化,可能是由于氣溫對于奶牛呼吸頻率的影響作用大于蘆丁對奶牛熱應(yīng)激的效應(yīng)所致。

3.2 蘆丁對熱應(yīng)激奶牛生產(chǎn)性能的影響

產(chǎn)奶性能直接決定了奶牛的經(jīng)濟(jì)效益。日糧中添加蘆丁有效延緩了高溫天氣產(chǎn)奶量急劇下滑的情況,并且在飼喂超過30 d后,試驗組產(chǎn)奶量均顯著高于對照組。蘆丁是一種從植物中提取的黃酮類化合物,郝振榮等[12]報道大豆黃酮能夠緩解泌乳后期奶牛產(chǎn)奶量下降的趨勢,并在一定程度上提高產(chǎn)奶量;朱河水等[13]研究也發(fā)現(xiàn)大豆黃酮能夠通過促進(jìn)乳腺腺泡細(xì)胞代謝提高奶牛泌乳量,本試驗結(jié)果與之一致。為比較不同組之間奶牛的產(chǎn)奶性能,以能量為標(biāo)準(zhǔn),將不同乳脂率的乳統(tǒng)一矯正為含4%乳脂的標(biāo)準(zhǔn)乳,本試驗中蘆丁添加組矯正乳產(chǎn)量均顯著高于對照組,證明蘆丁具有提高奶牛生產(chǎn)性能的作用。能量矯正乳是計算飼喂效率的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù),飼喂效率(feed efficiency,FE)也稱產(chǎn)奶效率,指單位質(zhì)量的干物質(zhì)采食量所生產(chǎn)的牛奶質(zhì)量,可以綜合反映奶牛飼養(yǎng)水平與飼料質(zhì)量。本試驗在日糧中添加蘆丁,顯著提高了奶牛能量矯正乳產(chǎn)量,表明蘆丁在有效提高奶牛生產(chǎn)能力的同時還可以提高飼喂效率,改善飼料質(zhì)量。

本試驗中飼喂蘆丁超過30 d后,乳蛋白率和乳糖率均有顯著上升的趨勢,乳中乳蛋白和乳糖含量同樣顯著增加,這與李琮等[14]報道的飼喂大豆黃酮能提高奶牛乳蛋白率和乳糖率的結(jié)果一致。本試驗中發(fā)現(xiàn)蘆丁對奶牛乳脂率無顯著影響,但顯著提高了乳中脂質(zhì)質(zhì)量,反映了蘆丁具有促進(jìn)乳脂合成分泌的能力,此外蘆丁能夠顯著降低乳中體細(xì)胞數(shù)。蘆丁被證實具有多種抗炎活性,如Choi等[15]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁可以通過抑制炎性因子的表達(dá)來調(diào)節(jié)過敏性接觸性皮炎等炎癥,達(dá)到治療炎癥的目的,這種抗炎活性可能也是本試驗中蘆丁添加組乳中體細(xì)胞數(shù)顯著降低的原因。根據(jù)各項試驗結(jié)果與成本綜合考慮,每天蘆丁添加量應(yīng)以每頭2 g為宜,且飼喂時長應(yīng)大于30 d。

3.3 蘆丁對熱應(yīng)激BMEC抗逆能力的影響

熱休克蛋白(heat shock proteins,HSP)是一類細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫下誘導(dǎo)過量表達(dá)的一組蛋白,其相對表達(dá)量是判斷細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)最有力的指標(biāo)[16]。HSP70參與多肽的折疊與前體蛋白形成,并通過及時降解異常蛋白來維系細(xì)胞應(yīng)激后的存活,HSP70基因過表達(dá)可以增強(qiáng)細(xì)胞耐熱性。HSP90參與促進(jìn)信號肽成熟,具備遺傳變異的調(diào)節(jié)功能,當(dāng)細(xì)胞受到環(huán)境脅迫時,HSP90會發(fā)揮緩沖作用,其表達(dá)程度與細(xì)胞被脅迫程度呈正相關(guān),以此使細(xì)胞有效適應(yīng)不利環(huán)境[17]。在本試驗中,熱應(yīng)激處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后,HSP70、HSP90均呈現(xiàn)過表達(dá),蘆丁添加組HSP70表達(dá)量顯著高于熱應(yīng)激組,這表明蘆丁能夠進(jìn)一步保護(hù)細(xì)胞以緩解熱應(yīng)激帶來的不利影響,且蘆丁組HSP90表達(dá)量顯著低于熱應(yīng)激組,也證實了添加蘆丁后,細(xì)胞受熱刺激脅迫程度降低,表明蘆丁具有一定的保護(hù)作用,這也進(jìn)一步佐證了本試驗中添加蘆丁后,乳中體細(xì)胞數(shù)降低且受到熱應(yīng)激的細(xì)胞存活率顯著提高的結(jié)果。

3.4 蘆丁對熱應(yīng)激BMEC乳脂、乳蛋白及乳糖合成關(guān)鍵基因的影響

在奶牛生成乳汁的過程中,乳腺上皮細(xì)胞執(zhí)行泌乳功能并決定了奶牛生產(chǎn)性能[18],通過對奶牛乳腺上皮細(xì)胞相關(guān)關(guān)鍵基因的研究,能夠在一定程度上反映奶牛泌乳能力與乳品質(zhì)[19],反映乳品質(zhì)的指標(biāo)主要包括乳脂、乳蛋白與乳糖,這三者也是牛乳中的主要營養(yǎng)物質(zhì),具有較大的研究意義。

在脂質(zhì)合成代謝的過程中,FASN、ACC參與合成長鏈脂肪酸的限速步驟[20-21],二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)與脂肪沉積、產(chǎn)奶性能及泌乳質(zhì)量等性狀具有密切的關(guān)聯(lián)性[22-23],DGAT2通?？梢暈槟膛?、奶山羊產(chǎn)奶性狀的重要候選基因。DGAT2是ACC/FAS信號通路下游蛋白,在白色脂肪、骨骼肌、肝中表達(dá)最多[24],SREBP1通過參與脂肪酸和甘油三酯合成相關(guān)基因的活化來調(diào)節(jié)脂肪生成的過程[25]。這些基因在細(xì)胞脂質(zhì)合成過程中均發(fā)揮重要作用,它們的相對表達(dá)量反映了細(xì)胞成酯能力的變化。在本試驗中,對細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,蘆丁添加組脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)量均顯著提高,反映蘆丁對調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成與分泌具有一定的影響作用。乳蛋白的80%為酪蛋白,是乳中特有的蛋白,牛乳中主要含有αs1-酪蛋白(CSN1S1)、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白(CSN2)、γ-酪蛋白及κ-酪蛋白[26]。本試驗中,對細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,乳蛋白合成關(guān)鍵基因表達(dá)量均顯著提高,反映蘆丁對奶牛乳蛋白合成具有積極作用。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)是人體內(nèi)最重要的跨膜蛋白之一,其中GLUT1是分布最廣泛的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白,在乳腺上皮細(xì)胞中,GLUT1是重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體,能夠介導(dǎo)葡萄糖的攝取,參與哺乳動物乳腺泌乳期乳糖合成的調(diào)控[27]。本試驗中,對細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理后,蘆丁添加組GLUT1基因表達(dá)顯著提高,表明蘆丁能夠一定程度提高細(xì)胞乳糖合成能力。本試驗中的體外試驗,同樣佐證了體內(nèi)試驗中乳中脂質(zhì)、蛋白及乳糖含量提高的結(jié)果。

綜上所述,日糧中添加蘆丁能夠通過調(diào)控?zé)嵝菘说鞍准叭橹?、乳蛋白及乳糖合成相關(guān)基因的表達(dá)量,增強(qiáng)奶?？箲?yīng)激能力,提高生產(chǎn)性能。