固始雞和AA肉雞肝臟中脂肪酸合成酶基因表達及肌肉脂肪酸的比較研究

王明發(fā),王浩宇,王浩,袁林*

(1.河南省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.舞鋼市鴻發(fā)禽業(yè)有限公司,河南 舞鋼 462500)

雞體脂肪主要沉積在腹部、皮下和肌肉組織等部位[1-2]。肌內脂肪(IMF)主要分布在肌表層、肌周和肌內膜,是評價肉品質的重要指標。一定量的IMF可以提高肌肉的風味和嫩度等品質[3-8],IMF含量增加可減少肌肉滴水損失和蒸煮損失,因而改善肉質[9]。因此需要對肌內脂肪沉積的分子機制進行研究。脂肪酸是機體重要的能量來源,多余的脂肪酸可以作為脂肪在體內儲存。在現(xiàn)代肉雞養(yǎng)殖中,機體內脂肪沉積過多是養(yǎng)殖者關注的問題。因為肉雞體內脂肪沉積過多,不僅導致飼料效率下降,而且大部分脂肪作為邊角料在屠宰和加工過程中被舍棄,造成浪費[10]。哺乳類單胃動物多數(shù)脂肪酸的合成開始于脂肪組織,而雞的脂肪代謝則不同,脂肪組織中很少甚至幾乎沒有脂肪酸合成,脂肪組織中90% 以上的脂肪酸是在肝臟中合成的[10-12]。

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的關鍵多功能酶[13]。動物體內FASmRNA表達水平與體脂含量呈正相關[14]。組織中脂肪酸合成的最高水平由FASmRNA表達水平決定[15]。在豬和大鼠等哺乳動物中,已有一些關于IMF含量和FASmRNA表達水平之間關系的研究[5,16-18]。然而,雞FASmRNA的表達模式及其與IMF和脂肪沉積的關系尚不清楚。固始雞是我國著名的地方雞種,具有生長緩慢、肉質優(yōu)良的特點,AA肉仔雞是快速生長肉仔雞的代表。相關研究表明,8周齡固始雞胸肌中IMF含量顯著高于AA肉雞,但腿肌中含量沒有顯著差異[19],而不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FASmRNA表達及活性的研究還鮮見報道?；ㄉ南┧嶙鳛橐环N重要的風味物質,其含量顯著影響雞肉品質。本研究通過測定不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中的IMF含量及脂肪酸組成,研究固始雞和AA肉雞不同周齡肝臟中脂肪酸合成酶活性及FASmRNA表達的規(guī)律,對于闡明固始雞高品質雞肉形成的分子機制具有重要意義,同時也為固始雞日糧中脂肪配比水平的調控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、日糧和分組

選取1日齡快長型D系固始雞(固始三高集團提供)和AA肉雞(購自開封正大種雞場)公雛各200只,每個品種的雛雞隨機分成5個重復,每個重復40只雞。選用玉米-豆粕型日糧,分1～4周齡和5～6周齡2個飼養(yǎng)階段,營養(yǎng)水平參照美國營養(yǎng)研究委員會(1994)肉仔雞的營養(yǎng)需要配制日糧,基礎日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。雞群飼養(yǎng)和免疫按正常程序進行,保證充足光照時間,試驗雞用籠具為不銹鋼材料,飼槽和飲水設備為塑料制品。

表1 不同飼養(yǎng)階段基礎日糧組成及營養(yǎng)組成水平(風干基礎)Table 1 Basic diet composition and nutrient composition at the different feeding stages(air-dry basis) %

1.2 采樣

試驗開始第1天取樣(設為0周齡),然后分別在3、4、5和6周齡不禁食狀態(tài)下(禁食會影響FAS水平)從每個重復中隨機抽取體重相近的3只雞頸部放血宰殺,采集約1 g肝樣置于凍存管中,液氮速凍,然后轉入-80 ℃保存,用于測定FASmRNA表達水平。其余肝臟樣本裝入聚乙烯袋中,封口,于-20 ℃保存,用于分析FAS活性。采集4和6周齡左側胸肌和腿肌樣本,-20 ℃保存,用于測定肌肉中脂肪酸組成和脂肪含量。

1.3 胸肌和腿肌中IMF含量的測定

取每個肌肉樣品約2 g,先去除明顯的脂肪,解凍后切碎,65 ℃干燥12 h后轉至105 ℃繼續(xù)干燥12 h,然后在干燥器中冷卻30 min,以無水乙醚為溶劑,采用索氏抽提法測定腿肌和胸肌中脂肪含量。

1.4 肝臟中FAS活性的測定

用 FAS酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)測定肝臟中FAS活性。稱取 -20 ℃保存的肝臟組織10 mg,加入100 μL 9 g·L-1生理鹽水中,搗碎、勻漿,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液備用。標準品孔加入不同濃度的標準品溶液50 μL;在酶標包被板孔中先加樣品稀釋液40 μL,再加待測樣品10 μL;除空白外,每孔加入酶標試劑100 μL;用封板膜封板后37 ℃溫育60 min;洗滌液洗滌 5次,甩干;每孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑B 50 μL,37 ℃避光顯色15 min;每孔加終止液 50 μL,終止反應;用酶標儀(Infinite F50)在450 nm波長下測定吸光值(A450值),計算樣品脂肪酸合成酶活性(U·mg-1)。

1.5 肝臟中FAS mRNA水平的測定

取-80 ℃冰箱中保存的肝臟組織約100 mg,用Trizol試劑提取RNA,用紫外分光光度計測定D260、D280值并計算D260/D280值,計算RNA的純度和濃度,瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質量。取4.782 μg樣品RNA,在20 μL的反應體系中42 ℃反應60 min,逆轉錄成cDNA。從GenBank中查找FAS和β-actinmRNA的全序列,設計基因引物序列:β-actin(161 bp):5′-AGAAGGAGATCACAGCCCT-3′/5′-GGGTCCGGATTC-ATCGTACT-3′;FAS(119 bp):5′-GGACCTTATCGCATTGCTGG-3′/5′-TTTCCTTGGGTCAGCTTTGC-3′。由武漢巴菲爾(Biobuffer)生物技術有限公司合成。

RT-qPCR檢測(25 μL反應體系):0.5 μL內參 F(10 μmol·L-1),0.5 μL內參 R(10 μmol·L-1),2 μL dNTP(2.5 mmol·L-1),0.25 μLExTaq,2.5 μL 10×ExTaqE 緩沖液,1 μL cDNA,18.25 μL ddH2O。反應條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 25 s,30個循環(huán);72 ℃ 4 min。RT-qPCR檢測時,cDNA 6倍稀釋,20 μL反應體系如下:4 μL cDNA(6倍稀釋),0.4 μL上游引物(100 μmol·L-1),0.4 μL下游引物(100 μmol·L-1),10 μL SYBR Green/Flourescein qPCR Master Mix,5.2 μL ddH2O。反應條件:50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán)。以0.5 ℃·s-1從60 ℃升溫至95 ℃,繪制熔解曲線,再以2-ΔΔCT法進行分析。

1.6 胸肌和腿肌中脂肪酸組成測定

胸肌和腿肌中脂肪酸組成的測定采用《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定GB 5009.168—2016》第三法。

1.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件中的混合線性模型對肝臟中FASmRNA表達水平、FAS活性及肌肉中IMF含量進行分析。品種、周齡和品種×周齡作為固定效應,雞作為隨機效應,以周齡作為重復測量,雞肝臟中FASmRNA表達水平、FAS活性及肌肉中IMF含量作為協(xié)變量。由于某些脂肪酸在特定組織中的含量未測出,因此,只對胸肌和腿肌中部分脂肪酸采用t測驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FAS mRNA表達水平分析

從表2可以看出:AA肉雞肝臟中FASmRNA表達水平顯著高于固始雞。品種與周齡互作對表達水平產生極顯著影響,對相同周齡FASmRNA表達水平比較發(fā)現(xiàn),0、3和5周齡時,AA肉雞肝臟中FASmRNA表達水平顯著高于固始雞,而4和6周齡時品種間沒有顯著差異。

2.2 不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性分析

從表3可以看出:AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性沒有顯著差異。品種與周齡互作對FAS活性產生極顯著影響,對相同周齡FAS活性比較發(fā)現(xiàn),在0、3和和5周齡時,AA肉雞顯著高于固始雞,4和6周齡時,品種間沒有顯著差異,這與FASmRNA表達水平相一致;從0 到5周齡,AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性沒有顯著變化,6周齡時兩品種肉雞肝臟中FAS活性顯著提高。

表3 不同周齡AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性Table 3 Liver FAS activity of AA broiler and Gushi chicken of different week-age

2.3 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量分析

從表4可以看出:AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量極顯著高于固始雞。品種與周齡互作對胸肌中IMF含量產生顯著影響,對腿肌中IMF含量不產生顯著影響。對相同周齡IMF含量比較發(fā)現(xiàn),4周齡時,AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量均顯著高于固始雞;6周齡時,AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量與固始雞沒有顯著差異。

表4 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量Table 4 IMF contents in breast and leg muscles of AA broilers and Gushi chicken of different week-age

2.4 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸組成分析

從表5可以看出:相同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸總含量沒有顯著差異。脂肪酸組成方面品種間呈現(xiàn)顯著差異,無論是胸肌還是腿肌,固始雞多不飽和脂肪酸含量顯著高于AA肉雞;4周齡固始雞胸肌和腿肌中亞油酸含量顯著高于AA肉雞,6周齡時差異不顯著;4周齡時AA肉雞胸肌中亞麻酸含量顯著高于固始雞,腿肌中沒有顯著差異,6周齡時AA肉雞胸肌和腿肌中亞麻酸含量顯著高于固始雞,4和6周齡時固始雞胸肌和腿肌中花生四烯酸含量顯著高于AA肉雞。隨著周齡增加,AA肉雞胸肌和腿肌中多不飽和脂肪酸含量沒有顯著變化,而固始雞含量顯著降低;AA肉雞4周齡胸肌和腿肌中亞油酸含量與6周齡沒有顯著差異,而固始雞胸肌和腿肌中亞油酸含量隨著周齡增加顯著降低;與4周齡相比,6周齡AA肉雞胸肌中亞麻酸含量顯著提高,腿肌中沒有顯著變化,固始雞胸肌中亞麻酸含量沒有顯著差異,而腿肌中含量顯著降低;AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中花生四烯酸含量隨周齡增加均無顯著變化。

表5 不同周齡AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸組成Table 5 Fatty acid composition in breast and leg muscles of AA broiler and Gushi chicken of different week-age(w)

3 討論

3.1 AA肉雞和固始雞肝臟中FAS mRNA表達水平

脂肪酸合成酶(FAS)是脂肪酸合成的關鍵酶,在雞肝臟中以復雜的七步反應將乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成長鏈脂肪酸。FAS活性和表達水平與雛雞肝臟中脂肪酸合成的速度有關,FASmRNA表達量的變化直接與FAS蛋白的合成速度正相關[20-22]。本研究結果顯示,AA肉雞肝臟中FASmRNA表達水平顯著高于固始雞;0、3和5周齡時AA肉雞肝臟中FASmRNA表達水平顯著高于固始雞,4和6周齡時盡管差異不顯著,但AA肉雞的表達水平有高于固始雞的趨勢,這與Zhao等[23]的結果一致。此外,Daval等[24]和Douaire等[25]報道,遺傳性多脂系和瘦型系肉雞的FASmRNA表達水平存在差異,但由于個體間的變異系數(shù)較大,統(tǒng)計學上的差異不顯著。

3.2 AA肉雞和固始雞肝臟中FAS活性

本研究結果表明,在0、3和5周齡時,AA肉雞肝臟中FASmRNA表達水平顯著高于固始雞,同階段AA肉雞肝臟中FAS活性亦顯著高于固始雞;4和6周齡時AA肉雞的表達量與固始雞沒有顯著差異,FAS活性表現(xiàn)出相同趨勢。這與Richard等[26]的研究結果一致,肝臟中FASmRNA表達量與FAS活性間呈正相關關系。

3.3 AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量差異與FAS mRNA表達水平的關系

肌間脂肪含量直接影響肉品風味、多汁性和口感,是判定肉質的重要指標;在影響IMF的眾多因素中,遺傳因素對IMF含量影響較大。本研究中,4周齡時AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量顯著高于固始雞,6周齡時AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量與固始雞沒有顯著差異。這與王志祥等[19]的研究結果不同,他們測定了8周齡艾維茵肉雞、固始雞胸肌和腿肌中IMF含量,發(fā)現(xiàn)固始雞胸肌中IMF含量顯著高于艾維茵肉雞,而腿肌中沒有顯著差異,可能與測定的周齡有關。從4周齡到6周齡,AA肉雞胸肌和腿肌中IMF含量顯著降低,而固始雞腿肌中IMF含量沒有顯著變化,這可能與2個品種肉雞在此生長階段內的增重速率有關,AA肉雞在4周齡到6周齡期間絕對增重為1 120 g,而固始雞只有598 g[27],脂肪沉積速度低于增重速度,隨著飼養(yǎng)周期延長,固始雞胸肌和腿肌中IMF含量可能會高于AA肉雞。

本研究中,與4周齡相比,6周齡時除固始雞的腿肌中IMF含量增加外,AA肉雞胸肌、腿肌和固始雞胸肌中IMF含量均顯著降低,這與肝臟中FAS活性及mRNA水平的變化并不一致,可能與不同周齡的雞IMF變化滯后于肝臟FAS活性的變化有關。機體利用能量等合成脂肪的能力是逐漸增加的,而前期由于生長發(fā)育的需要,雞肉脂肪沉積較少[28],只有當脂肪酸的攝取速度大于脂肪酸氧化速度時,脂質才會在肌肉組織中進行沉積,從而形成IMF[29]。脂肪在機體組織內的沉積與分配主要受到激素和脂肪代謝相關酶活性的調控,肝臟是家禽合成脂肪的主要部位,家禽90% 以上的脂肪酸在肝臟內合成,因此肝臟內脂肪代謝酶活性的高低直接影響了脂肪在組織內的沉積與分配,雞肝臟內FAS活性雖然對肌肉IMF含量具有重要作用,但這在90～200日齡的生長階段更為明顯[30]。有研究表明河田雞、烏雞和北京油雞在8～16周齡階段胸肌和腿肌IMF含量會隨著周齡的增加而顯著升高[31]。AA肉雞與北京油雞在28～90日齡階段胸肌和腿肌IMF含量也隨日齡的增加呈上升趨勢[28]。

3.4 AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸組成差異

雞肉中脂肪酸組成直接影響雞肉的風味。研究發(fā)現(xiàn),花生四烯酸是前列腺素和凝血酶的前體,可影響血凝和愈合過程,同時在幼兒生長中也扮演著重要的角色[32];亞麻酸和亞油酸對人體起著至關重要的作用,但都必須直接攝入,無法在體內合成[33]。本研究中,AA肉雞、固始雞胸肌和腿肌中脂肪酸總量沒有顯著差異,但相同周齡時,固始雞胸肌、腿肌中亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸總量顯著高于AA肉雞。花生四烯酸為雞肉中最重要的香味前體物質之一,4周齡時,固始雞胸肌和腿肌中花生四烯酸含量分別為AA肉雞的2.09、4.03倍,6周齡時為分別為3.17和3.91倍,這可能是固始雞具有特殊風味的重要原因。

綜上,品種間FASmRNA表達水平及FAS活性的差異可能是造成肉雞生長前期IMF含量顯著不同的原因之一;胸肌和腿肌中多不飽和脂肪酸,特別是花生四烯酸含量可能是影響固始雞雞肉風味的重要因素。