谷物中具有抑制霉菌活性乳酸菌的分離篩選及鑒定

丁寧,陸兆新,別小妹,呂鳳霞,趙海珍

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,江蘇 南京 210095)

霉菌是真菌的一類,具有菌絲體發(fā)達(dá)、分布范圍廣和可產(chǎn)毒素等特點(diǎn)。最新研究表明,60%～80%的農(nóng)產(chǎn)品中均可檢測(cè)到霉菌毒素[1]。谷物是農(nóng)產(chǎn)品中最常見的易被污染產(chǎn)品,引起霉菌污染的途徑包括從生長(zhǎng)、收獲、儲(chǔ)存到加工的全過程[2]。被霉菌污染后農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)地、顏色和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失,霉菌產(chǎn)生的霉菌毒素更會(huì)導(dǎo)致急性和慢性中毒[3]。近年來,國(guó)內(nèi)外關(guān)于霉菌及霉菌毒素污染谷物造成重大損失的相關(guān)報(bào)道也在逐年增加[4]。我國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó),谷物產(chǎn)量位于世界前列,因此明確霉菌污染谷物的特征及尋找科學(xué)有效的霉菌污染防治方法對(duì)推動(dòng)我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。

關(guān)于抑制霉菌生長(zhǎng)和毒素降解的方法有很多,主要可分為物理方法、化學(xué)方法、生物方法及組合方法[5]。其中,生物方法指微生物及其代謝產(chǎn)物、植物提取物的使用,具有環(huán)境友好、高效率和可以運(yùn)用于食品的優(yōu)點(diǎn)。近年來,關(guān)于乳酸菌抑制霉菌及降解霉菌毒素的研究逐漸增多,展現(xiàn)了乳酸菌對(duì)霉菌抑制的巨大潛力。在抑制霉菌方面,Cizeikiene等[6]研究表明乳酸菌在生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生具有抑制霉菌活性的物質(zhì);Franco等[7]從小麥中分離出可抑制禾谷鐮刀菌的乳酸菌。此外,Zhao等[8]篩選出1株通過拮抗作用抑制黃曲霉的植物乳桿菌,轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌通過抑制黃曲霉細(xì)胞壁多糖的合成從而抑制黃曲霉。抑制霉菌毒素最有效的方法是抑制產(chǎn)毒素霉菌的生長(zhǎng)從而防止毒素污染,此外還有些乳酸菌可以結(jié)合毒素從而去除毒素。Peltonen等[9]研究發(fā)現(xiàn)多株乳酸菌菌株可與黃曲霉毒素B1結(jié)合。

乳酸菌作為一種安全的生物防腐劑已獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理安全認(rèn)定(Generally Recognized as Safe,GRAS)認(rèn)證以及歐盟食品安全資格認(rèn)定(Qualified Presumption of Safety,QPS)認(rèn)證,并被應(yīng)用于多種食品中[10]。關(guān)于乳酸菌應(yīng)用于谷物的研究也不斷增加[11-12],這些乳酸菌的來源通常為泡菜[13]、發(fā)酵乳制品和酸面團(tuán)[14],很少有從谷物中篩選具有抑制霉菌活性的乳酸菌。因此本文以谷物為原料篩選具有抑制霉菌活性的乳酸菌,分析發(fā)酵液中的抑制霉菌物質(zhì),為乳酸菌作為谷物生物防腐劑運(yùn)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品與菌種谷物樣品:小麥麩皮來自不同產(chǎn)地,包括江蘇(J、Jm,其中Jm為第2批篩選菌株,下同)、甘肅(G、Gm)、山西(S、Sm)、河南(H、Hm)和內(nèi)蒙古(N、Nm);南京市售其他谷物,包括玉米顆粒(A)、面粉(F)、糯米粉(M)、蕎麥粉(Q)、黃豆粉(D)、青稞(K)和燕麥(Y)。菌種:黃曲霉(A.flavusCICC2062)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum2021)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g,牛肉膏10.0 g,酵母粉5.0 g,檸檬酸氫二胺2.0 g,葡萄糖20.0 g,吐溫80 1.0 mL,三水合乙酸鈉5.0 g,三水合磷酸氫二鉀2.0 g,七水合硫酸鎂0.58 g,一水合硫酸錳 0.25 g,蒸餾水1 000 mL,調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.2。MRS固體培養(yǎng)基:在MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂18.0 g,蒸餾水1 000 mL。PDA培養(yǎng)基:土豆200.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂10.0 g,蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 谷物中乳酸菌的分離與純化使用富集法分離谷物中的乳酸菌[15]。將0.5 g谷物樣品加入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中,30 ℃靜置培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)后使用無菌蛋白胨水(2 g·L-1)將懸浮液梯度稀釋至10-5、10-6和10-7倍,并吸取50 μL至MRS固體平板涂布,30 ℃培養(yǎng)48 h,從每個(gè)平板中隨機(jī)取出10%不同形態(tài)的菌落。在MRS固體平板上反復(fù)劃線篩選,選取單一菌落,進(jìn)一步劃線分離純化。分離菌株在20%(體積分?jǐn)?shù))甘油中保存。

1.2.2 篩選乳酸菌的初步鑒定通過溶鈣圈、革蘭氏染色以及過氧化氫酶對(duì)分離純化后的菌株進(jìn)行初步鑒定。菌液接種至含有10 g·L-1CaCO3的MRS固體培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)72 h,觀察是否產(chǎn)生溶鈣圈;吸取菌液進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢,紅色為革蘭氏陰性,紫色為革蘭氏陽性;挑取菌落,滴加3%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液,有氣泡產(chǎn)生為陽性,無氣泡產(chǎn)生為陰性。產(chǎn)生溶鈣圈、革蘭氏陽性和過氧化氫酶陰性的菌株初步定為乳酸菌。

1.2.3 抑制霉菌活性乳酸菌的初步篩選1)霉菌孢子液的制備[16]。選擇在谷物污染中最常見的禾谷鐮刀菌和黃曲霉作為乳酸菌抑制霉菌活性檢測(cè)的指示菌。將待試的禾谷鐮刀菌和黃曲霉分別接種在PDA平板上,30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d至產(chǎn)生大量孢子。加入5 mL含 0.08%(體積分?jǐn)?shù))吐溫80的無菌水并用接種環(huán)輕輕刮取,收集孢子液,充分振蕩后使用無菌脫脂棉過濾去除菌絲。去除菌絲的孢子懸液使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定濃度,調(diào)整濃度至106mL-1,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)具有抑制霉菌活性乳酸菌的篩選。使用雙層平板法篩選對(duì)霉菌具有抑制活性乳酸菌的測(cè)定[17],并稍作修改。將2 μL乳酸菌接種在MRS固體平板上,30 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)期結(jié)束后,在平板上覆蓋PDA培養(yǎng)基,涂布20 μL已制備的霉菌孢子液,并在30 ℃進(jìn)一步培養(yǎng)72 h。游標(biāo)卡尺測(cè)量乳酸菌菌落周圍的生長(zhǎng)抑制區(qū)。

1.2.4 乳酸菌發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子抑制活性的測(cè)定1)乳酸菌發(fā)酵液(CFS)的制備。乳酸菌活化后培養(yǎng)20 h(菌濃度約為2×109CFU·mL-1),再以2%接種量接種至MRS液體培養(yǎng)基,在30 ℃靜置培養(yǎng)48 h,培養(yǎng)期結(jié)束后將發(fā)酵液以8 000 r·min-1離心10 min,取上清液,用0.22 μm微孔濾膜過濾除去菌體。

2)96孔板法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵液對(duì)2種霉菌孢子的抑制率[18]。取10 μL霉菌孢子懸浮液(106mL-1)加入不同體積的發(fā)酵液中,用MRS培養(yǎng)基將最終體積調(diào)整為200 μL。以接種霉菌孢子懸液于MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照。將96孔板在30 ℃培養(yǎng)72 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定617 nm處的吸光度。乳酸菌發(fā)酵液的孢子抑制率計(jì)算公式為:

抑制率=100-(DLAB×100/Dc)×100%。

式中:DLAB表示2種霉菌在乳酸菌發(fā)酵液中培養(yǎng)72 h的吸光度值;Dc表示2種霉菌在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后的吸光度值。

1.2.5 乳酸菌菌株鑒定利用DNA抽提試劑盒提取乳酸菌的基因組DNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物27f和1495r,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,然后使用Sanger法測(cè)定16S rDNA序列(金唯智生物技術(shù)有限公司)。將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),找出同源性最高菌株,并使用MEGA 7軟件進(jìn)行序列對(duì)比、繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 乳酸菌抑制霉菌有效物質(zhì)分析1)調(diào)節(jié)pH值對(duì)發(fā)酵液抑制霉菌活性的影響。用2 mol·L-1NaOH溶液分別調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4.0、5.0和6.0,采用96孔板法測(cè)定處理后的發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制率,以未調(diào)整pH值的發(fā)酵液作為對(duì)照。

2)蛋白酶處理對(duì)發(fā)酵液抑制霉菌活性的影響。采用薩如拉[19]的方法并稍作修改。取等量乳酸菌發(fā)酵液3份,調(diào)節(jié)pH值分別至3種酶的最適pH值(胰蛋白酶為7.4,木瓜蛋白酶為6.0,胃蛋白酶為2.0),再分別加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在30 ℃處理1 h(蛋白酶終質(zhì)量濃度為 1.0 mg·mL-1),再 65 ℃加熱5 min使蛋白酶失活。調(diào)節(jié)pH值至初始值,采用96孔板法測(cè)定處理后的發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制率,以未添加蛋白酶的發(fā)酵液作為對(duì)照。

3)高溫處理對(duì)發(fā)酵液抑制霉菌活性的影響。為測(cè)定熱穩(wěn)定性,將發(fā)酵液放置沸水中加熱10、20、30和40 min,然后冷卻至室溫,采用96孔板法測(cè)定處理后的發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制率,以未加熱的發(fā)酵液作為對(duì)照。

1.2.7 HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中有機(jī)酸含量1)有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。使用檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、富馬酸、乙酸、乳酸和苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品分別配制0.002～10 mg·mL-1不同濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品,HPLC檢測(cè)其峰面積。以有機(jī)酸濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2)HPLC檢測(cè)條件。苯乳酸色譜條件[20]:梯度洗脫高效液相色譜分析。檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(25 cm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20.0 μL;流速:1.0 mL·min-1;流動(dòng)相:A相為0.05%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸甲醇溶液,B相為0.05%三氟乙酸溶液。洗脫程序:0～20 min為A相與B相的體積比由10%線性變化為100%,20～23 min為100% A相,23～25 min保持A相與B相的體積比為10%。其他酸的色譜條件:等比例高效液相色譜分析,采用Bukhari等[21]的方法并稍作修改。檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng):215 nm;色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(25 cm×4.6 mm,5 μm);柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:20.0 μL;流速:0.6 mL·min-1;流動(dòng)相:0.1%(體積分?jǐn)?shù))磷酸與甲醇混合液(體積比為97∶3);洗脫時(shí)間:20 min。

3)戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中有機(jī)酸的抑制霉菌作用。向MRS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的乳酸(0.5～4.0 mg·mL-1)、乙酸(0.5～4.0 mg·mL-1)、檸檬酸(0.5～4.0 mg·mL-1)、琥珀酸(0.5～4.0 mg·mL-1)和苯乳酸(0.05～4.00 mg·mL-1),96板法測(cè)定其對(duì)黃曲霉孢子的抑制率。配制與戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中各種有機(jī)酸濃度相同的混合溶液,調(diào)節(jié)pH值至與發(fā)酵液相同(pH值3.7),測(cè)定其對(duì)黃曲霉孢子的抑制率。

1.2.8 戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中蛋白類抑制霉菌物質(zhì)的分析1)戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中抑制霉菌物質(zhì)的粗提及其對(duì)黃曲霉孢子的抑制活性。采用酸沉法分離提取戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中的抑制霉菌物質(zhì)[22]。調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至2.0,4 ℃下靜置過夜。靜置后,發(fā)酵液在4 ℃下8 000 r·min-1離心15 min,取沉淀,用蒸餾水復(fù)溶。抑制霉菌物質(zhì)粗提液用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶處理后,再用96孔板法測(cè)定其對(duì)黃曲霉孢子的抑制率。2)戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中粗提抑制霉菌物質(zhì)的傅里葉紅外光譜。將抑制霉菌粗提物凍干樣品與KBr按質(zhì)量比 1∶100混合研磨,使用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定。測(cè)定條件:分辨率為4 cm-1,掃描波數(shù)為4 000～400 cm-1。3)戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中粗提抑制霉菌物質(zhì)的SDS-PAGE凝膠電泳。電泳條件為濃縮膠5%,分離膠12%;濃縮膠工作電壓80 V,分離膠工作電壓140 V。糖蛋白染色采用高碘酸-硝酸銀染色法[23]。糖化酶作為陽性對(duì)照,乳清蛋白作為陰性對(duì)照,樣品為抑制霉菌粗提物以及胰蛋白酶處理后的抑制霉菌粗提物。電泳結(jié)束后,凝膠用10%(體積分?jǐn)?shù))乙酸和25%(體積分?jǐn)?shù))異丙醇溶液固定30 min,加入10 g·L-1高碘酸溶液4 ℃反應(yīng)1 h,反應(yīng)完畢后使用蒸餾水反復(fù)沖洗(約3 h),使用250 mL 2.5 g·L-1硝酸銀溶液銀染10 min(使用前加入100 μL 37%甲醛),蒸餾水水洗3次,再用250 mL 25 g·L-1無水碳酸鈉溶液顯色(使用前加入50 μL 37%甲醛),在乳清蛋白變色前使用14.6 g·L-1EDTA二鈉溶液浸泡10 min終止反應(yīng)。蛋白或多肽使用考馬斯亮藍(lán)R250染色,樣品為抑制霉菌粗提物以及胰蛋白酶處理后的抑制霉菌粗提物。電泳結(jié)束后,凝膠使用1 g·L-1考馬斯亮藍(lán)染色液染色2 h,再脫色過夜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件的單因素方差分析(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從5種產(chǎn)地的小麥麩皮以及玉米顆粒、面粉、糯米粉、蕎麥粉、黃豆粉、青稞、燕麥樣品中共分離得到純培養(yǎng)物178株。乳酸菌菌株菌落直徑較小,形態(tài)呈規(guī)則圓形,表面光滑濕潤(rùn);大多數(shù)為白色或乳白色,少量為半透明;挑取時(shí)具有一定黏性。

2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸可與MRS固體培養(yǎng)基中CaCO3反應(yīng),在乳酸菌菌落周圍形成透明圈,10株菌落周圍無透明圈,不具備產(chǎn)酸能力。革蘭氏染色鏡檢中,27株菌為革蘭氏陰性;革蘭氏陽性菌的細(xì)胞形態(tài)大多數(shù)為球狀,少量為桿狀。過氧化氫酶試驗(yàn)中僅有3株為過氧化氫酶陽性。綜上,在分離出的178株菌株生理生化鑒定中有139株初步被判定為乳酸菌。

2.3 具有抑制霉菌活性乳酸菌的初步篩選

由表1可見:在139株菌株中,12株菌對(duì)黃曲霉的抑制透明圈半徑大于3 mm,分別為Jm6、Nm11、Sm8、Q7、Y9、Y5、Q4、K1、H7、Q5-1、S2、S9;14株菌對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制透明圈半徑大于3 mm,分別為Jm11、Hm1、Hm9、Nm4、Sm1、Sm7、S1、N6、H9、D1、Y2、Q6-2、S6、Sm12。共篩選出26株可對(duì)霉菌有高抑制作用的乳酸菌。圖1-a為菌株Q7對(duì)黃曲霉的抑制透明圈,半徑大于3 mm;圖1-b為菌株Hm9對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制透明圈,半徑大于3 mm。

表1 雙層平板法篩選乳酸菌對(duì)黃曲霉和禾谷鐮刀菌的抑制透明圈Table 1 Inhibition zone of lactic acid bacteria against Aspergillus flavus and Fusarium graminearum by dual culture overlay technique

圖1 乳酸菌對(duì)2種霉菌的抑制透明圈Fig.1 Clear zone of inhibition of lactic acid bacteria against two kinds of moulda.Q7對(duì)黃曲霉的抑制透明圈Clear zone of inhibition of Q7 against A.flavus;b.Hm9對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制透明圈Clear zone of inhibition of Hm9 against F.graminearum.

2.4 乳酸菌發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制活性分析

由表2和表3可見:隨乳酸菌發(fā)酵液比例上升,其對(duì)黃曲霉孢子萌發(fā)的抑制率逐漸上升,其中S2、S9、Y5和Y9在發(fā)酵液比例為50%時(shí),抑制率達(dá)99%以上;隨乳酸菌發(fā)酵液比例上升,其對(duì)禾谷鐮刀菌孢子的抑制率上升,其中Sm1、Sm12、S6和N6在發(fā)酵液體積比為50%時(shí),抑制率達(dá)99%以上。從26株乳酸菌共篩選出8株對(duì)霉菌孢子抑制效果較好的菌株。

表2 96孔板法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵液對(duì)黃曲霉孢子的抑制率Table 2 Inhibition ratio of lactic acid bacteria in the cell free supernatant(CFS)against A. flavus spores germination on 96-well plate %

表3 96孔板法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌孢子的抑制率Table 3 Inhibition ratio of lactic acid bacteria in the cell free supernatant(CFS)against F.graminearum spores germination on 96-well plate %

2.5 篩選乳酸菌的鑒定

將測(cè)得的序列在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),測(cè)序結(jié)果顯示從谷物中篩選的8株抑制霉菌活性較好的菌株均屬于片球菌屬,與鏡檢結(jié)果一致,系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。其中N6、S2和Y9屬于乳酸片球菌,分別與乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)菌株5560、JY1R1和 8275基因序列相似度均在99%以上;而Y5、Sm12、Sm1、S6和S9為戊糖片球菌,與戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceusstrain)菌株opq3和6108基因序列相似度均在99%以上。

圖2 8株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 8 strains of lactic acid bacteria

2.6 乳酸菌發(fā)酵液中抑制霉菌有效物質(zhì)分析

由表4可知:與未處理發(fā)酵液相比,在調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4時(shí),抑制率下降但不顯著(P>0.05);而發(fā)酵液pH值調(diào)節(jié)至5和6時(shí),發(fā)酵液的抑制率均顯著下降(P<0.05)。因此,乳酸菌發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制活性受pH值的影響大。8株乳酸菌發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶處理后,7株乳酸菌發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制率沒有顯著改變,而戊糖片球菌Y5發(fā)酵液在木瓜蛋白酶、胰蛋白酶處理后對(duì)黃曲霉孢子的抑制率顯著下降。因此推測(cè)戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中可能存在對(duì)胰蛋白酶、木瓜蛋白酶敏感的多肽類物質(zhì),而其他7株乳酸菌發(fā)酵液中不存在。高溫處理中,發(fā)酵液在沸水浴中處理10、20、30和40 min后,對(duì)霉菌孢子的抑制率無顯著改變,因此發(fā)酵液中抑制霉菌有效物質(zhì)的熱穩(wěn)定性較高。

表4 不同處理方式對(duì)乳酸菌發(fā)酵液抑制霉菌孢子活性的影響Table 4 Effects of different treatments on the antifungal activities of lactic acid bacteria in the cell free supernatant(CFS)

2.7 乳酸菌發(fā)酵液中有機(jī)酸含量測(cè)定

2.7.1 乳酸菌發(fā)酵液中有機(jī)酸含量發(fā)酵液的高效液相色譜分析結(jié)果(表5)顯示,8株乳酸菌發(fā)酵液中均可檢測(cè)到多種有機(jī)酸,但有機(jī)酸種類和含量存在差異。發(fā)酵液中均存在的有機(jī)酸有乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸,其中含量超過1 mg·mL-1的為乳酸、乙酸和檸檬酸,乳酸最高含量為(5.61±0.49)mg·mL-1,乙酸最高含量為(3.29±0.27)mg·mL-1,檸檬酸最高含量為(1.68±0.29)mg·mL-1。其他有機(jī)酸含量較低或檢測(cè)不到,例如在S2、S9、Sm1和Sm12發(fā)酵液中檢測(cè)到了蘋果酸,而其他發(fā)酵液中沒有。

表5 8株乳酸菌發(fā)酵液中各種有機(jī)酸的含量Table 5 Contents of organic acids in the cell free supernatant(CFS)of 8 strains of lactic acid bacteria mg·mL-1

2.7.2 戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中有機(jī)酸的抑制霉菌活性分析由圖3可見:有機(jī)酸質(zhì)量濃度低于1.5 mg·mL-1時(shí),5種有機(jī)酸中琥珀酸對(duì)黃曲霉孢子的抑制率最高,質(zhì)量濃度高于1.5 mg·mL-1時(shí),乙酸的抑制作用最佳。以戊糖片球菌Y5發(fā)酵液為標(biāo)準(zhǔn)配制的有機(jī)酸混合溶液對(duì)黃曲霉孢子的抑制率為(76.77±0.58)%,高于對(duì)應(yīng)相同濃度單一有機(jī)酸的抑制率,因此戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中有機(jī)酸對(duì)黃曲霉孢子的抑制作用是多種有機(jī)酸共同作用的結(jié)果。有機(jī)酸混合溶液的抑制率低于發(fā)酵液的抑制率(86.80±0.30)%,推測(cè)這是由于戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中存在對(duì)蛋白酶敏感的其他抑制霉菌物質(zhì)。

圖3 不同質(zhì)量濃度有機(jī)酸對(duì)黃曲霉孢子的抑制率Fig.3 Inhibition rate of organic acids in different concentrations against A. flavus spores

2.8 戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中蛋白類抑制霉菌物質(zhì)的分析

調(diào)節(jié)戊糖片球菌Y5發(fā)酵液pH值至2.0,分離蛋白類物質(zhì),結(jié)果表明復(fù)溶后含蛋白質(zhì)粗提物的溶液具有抑制霉菌活性,抑制率為(77.71±5.31)%。而復(fù)溶溶液經(jīng)木瓜蛋白酶和胰蛋白酶處理后,抑制率均有所下降,尤其在胰蛋白酶處理后,抑制率下降至(14.83±2.72)%。因此,戊糖片球菌Y5發(fā)酵液粗提物中主要的抑制霉菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。

圖4 戊糖片球菌Y5抑制霉菌粗提物的傅里葉紅外光譜Fig.4 FTIR spectrum of antifungal substances crude extract of Pediococcus pentosaceus Y5

使用SDS-PAGE凝膠電泳以及高碘酸-硝酸銀染色確認(rèn)粗提物中的抑制霉菌物質(zhì),結(jié)果見圖5-a。戊糖片球菌Y5的抑制霉菌粗提物在丙烯酰胺凝膠上出現(xiàn)條帶,且位置高于糖化酶,而在胰蛋白酶處理后條帶明顯下移。由于糖化酶的相對(duì)分子質(zhì)量為(60～100)×103[26],因此戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中的抑制霉菌物質(zhì)為相對(duì)分子質(zhì)量大于60×103?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果見圖5-b,抑制霉菌粗提物在胰蛋白酶處理后出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量小于25×103和18×103的條帶,胰蛋白酶水解抑制霉菌粗提物后可產(chǎn)生低分子量的蛋白或多肽。因此,戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中對(duì)蛋白酶敏感的抑制霉菌物質(zhì)為糖蛋白。

圖5 戊糖片球菌Y5抑制霉菌粗提物的SDS-PAGE凝膠電泳Fig.5 SDS-PAGE gel electrophoresis of P.pentosaceus Y5 antifungal substances crude extracta.抑制霉菌粗提物SDS-PAGE凝膠電泳的高碘酸-硝酸銀染色(1.乳清蛋白,2.糖化酶,3.粗提物,4.胰蛋白酶處理物);b.抑制霉菌粗提物SDS-PAGE凝膠電泳的考馬斯亮藍(lán)染色(1.胰蛋白酶處理物,2.粗提物,M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn))。a. The crude extract with periodic acid-silver nitrate staining after SDS-PAGE gel electrophoresis(1.Whey protein,2. Glycosylase,3. Crude extract,4. Trypsin treatment);b. The crude extract with coomassie blue staining after SDS-PAGE gel electrophoresis(1.Trypsin treatment,2. Crude extract,3. Marker).

3 討論

本研究從谷物中共篩選出26株對(duì)霉菌菌絲抑制透明圈半徑達(dá)3 mm以上的乳酸菌,其中8株乳酸菌發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制率在體積比50%時(shí)達(dá)99%以上。這不僅比本研究中其他乳酸菌表現(xiàn)出的抑制霉菌活性更強(qiáng),而且強(qiáng)于其他一些研究中的乳酸菌菌株,例如馬歡歡等[27]篩選出1株可抑制黑曲霉的植物乳桿菌,在發(fā)酵液體積比95%時(shí)抑制率為92.5%。經(jīng)16S rDNA鑒定,篩選出的8株菌為乳酸片球菌(N6、S2和Y9)和戊糖片球菌(Y5、S9、Sm1、Sm12和S6)。

乳酸菌已被證明可通過產(chǎn)生有機(jī)酸[21]、脂肪酸和環(huán)二肽[28]等具有抗真菌活性的化合物而起到抑制霉菌的作用。本試驗(yàn)使用不同pH值、蛋白酶和高溫處理分析篩選乳酸菌發(fā)酵液中有效抑制霉菌物質(zhì)的種類,結(jié)果顯示8株乳酸菌發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的抑制率在調(diào)節(jié)pH值調(diào)高后顯著下降,這表明酸堿度能顯著影響發(fā)酵液的抑制霉菌活性。Ndagano等[16]研究了1株植物乳桿菌發(fā)酵濃縮液對(duì)黑曲霉的抑制活性,發(fā)現(xiàn)調(diào)高pH值后抑制霉菌活性下降顯著,并確定了抑制霉菌活性是不同有機(jī)酸共同作用的結(jié)果。Sheng等[29]研究表明抗菌肽LAH4在不同pH值下與生物膜結(jié)合親和力和結(jié)合速率不同,從而影響抗菌活性。因此推測(cè)篩選出的8株乳酸菌發(fā)酵液的有效抑制霉菌物質(zhì)為對(duì)酸堿度敏感物質(zhì),如有機(jī)酸和多肽。發(fā)酵液的蛋白酶處理試驗(yàn)中,戊糖片球菌Y5發(fā)酵液在經(jīng)木瓜蛋白酶和胰蛋白處理后,抑制率顯著下降,而胃蛋白酶處理不改變其抑制率。不同蛋白水解酶對(duì)蛋白或多肽的作用位點(diǎn)不同,其中木瓜蛋白酶具有廣泛特異型,對(duì)多種動(dòng)植物蛋白、多肽、酯具有較強(qiáng)的水解能力;而胰蛋白酶雖然特異性強(qiáng),但分解特定多肽的能力強(qiáng)。因此推測(cè)戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中可能存在對(duì)木瓜蛋白酶和胰蛋白酶敏感的有效物質(zhì)。此前也有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌可產(chǎn)生對(duì)蛋白酶敏感的抑制霉菌物質(zhì),如Muhialdin等[12]就從植物乳桿菌TE10中分離出37種抗菌肽。此外,8株乳酸菌發(fā)酵液在熱處理后抑制率均未下降,因此抑制霉菌的有效物質(zhì)為熱穩(wěn)定物質(zhì)。綜上,8株乳酸菌發(fā)酵液中主要抑制霉菌有效物質(zhì)為有機(jī)酸,且戊糖片球菌Y5發(fā)酵液中可能存在對(duì)蛋白酶敏感的其他物質(zhì)。

已有研究證明有機(jī)酸如乙酸、乳酸和苯乳酸具有抗真菌活性[30-31]。本研究使用HPLC法測(cè)定8株乳酸菌發(fā)酵液中有機(jī)酸的種類及含量,結(jié)果顯示乳酸菌發(fā)酵液中存在多種有機(jī)酸。發(fā)酵液中濃度較高的有機(jī)酸為乳酸、乙酸和檸檬酸,可達(dá)1 mg·mL-1以上。檸檬酸和乳酸可以通過破壞膜結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞內(nèi)pH值、抑制主動(dòng)運(yùn)輸和阻礙幾種代謝功能來發(fā)揮抗真菌活性[32]。乙酸抑制霉菌活性體現(xiàn)在具有較高的pKa(酸度系數(shù))值(pKa=4.75),高pKa值使其存在更多的未解離形式,這種形式能夠在穿過細(xì)胞膜后解離引起細(xì)胞的酸性應(yīng)激[33]。因此,發(fā)酵液中高濃度有機(jī)酸是抑制霉菌孢子生長(zhǎng)的原因之一。抑制霉菌活性的表現(xiàn)除單一物質(zhì)濃度作用外,也可能有多種酸之間的聯(lián)合作用。Dagnas等[34]的研究發(fā)現(xiàn),乳酸本身由于pKa值較低而抗真菌活性較低,但其在與乙酸結(jié)合的情況下,兩者的抑制霉菌活性均提高;Valerio等[35]也解釋了兩者的協(xié)同作用有助于降低pH值從而抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)。以戊糖片球菌Y5為例的各種有機(jī)酸抑制作用分析中混合酸抑制率高于單一有機(jī)酸,因此8株乳酸菌發(fā)酵液對(duì)霉菌孢子的高抑制活性是所有有機(jī)酸共同作用的結(jié)果。

本研究中戊糖片球菌Y5產(chǎn)生的蛋白類抑制霉菌物質(zhì)在酸性條件下沉淀,且在胰蛋白酶處理后抑制率顯著下降。龔慶偉[36]使用酸沉法從莫海威芽胞桿菌發(fā)酵液中提取出抑制霉菌粗提液,分離純化后獲得5種抗菌肽。傅里葉紅外光譜推測(cè)戊糖片球菌Y5的抑制霉菌物質(zhì)由多糖和蛋白質(zhì)組成,經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳再用硝酸銀-高碘酸染色和考馬斯亮藍(lán)染色確定其中抑制霉菌物質(zhì)為糖蛋白。在de Azevedo等[20]的研究中,戊糖片球菌LBM18發(fā)酵液經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶處理后抑制霉菌活性完全消失,使用傅里葉紅外、核磁共振和掃描電鏡判定其為1種糖蛋白。

本研究從谷物中篩選出多株具有良好抑制霉菌活性的乳酸菌,這對(duì)谷物防霉有重要意義。其中戊糖片球菌Y5可產(chǎn)蛋白類抑制霉菌物質(zhì),在接下來的研究中可進(jìn)一步提取純化,確定其結(jié)構(gòu)并在谷物中應(yīng)用。