FRD聯(lián)合Care HPV在大同地區(qū)宮頸癌篩查中的臨床研究

高艷萍，趙文娟，趙 康，郭永霞，崔夏夏，朱壯彥

(1.大同市第一人民醫(yī)院 山西大同 037009,2.陽高縣中醫(yī)院 山西大同 037000,3.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院 山西大同 037009）

宮頸癌（cervical cancer,CC）和人乳頭瘤狀病毒（human papilloma virus,HPV）罹患關(guān)系的發(fā)現(xiàn)使CC的防治取得了突破性的進展。通過宮頸脫落細胞和HPV 的篩查，極大地降低了CC 的發(fā)病率和死亡率[1?2]：發(fā)達國家和我國沿海地區(qū)CC 的死亡率分別降低了67%～74%。然而在經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)CC的篩查不能普及，導(dǎo)致CC 的發(fā)病率顯著高于發(fā)達國家和我國沿海發(fā)達地區(qū)，仍然保持既往的死亡率。因此開發(fā)經(jīng)濟實效的CC 篩查技術(shù)便成了臨床亟待解決的問題，為此國家衛(wèi)生健康委員會科學(xué)技術(shù)研究所推出了葉酸受體介導(dǎo)的宮頸特殊染色（folate receptor?mediated tumor detection,FRD）以及Care HPV 技術(shù)，并在我國部分地區(qū)對宮頸癌進行試點篩查，取得了顯著社會效應(yīng)。FRD 和Care HPV 在大同地區(qū)的篩查尚未開展，本研究選取大同市適齡婦女，采用FRD 和Care HPV 技術(shù)對CC 展開篩查研究，探究篩查的臨床效果并為FRD和Care HPV篩查提供臨床數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用自身對照法，收集2019 年1 月?2021 年1 月大同市第一人民醫(yī)院門診就診患者，共2 000 例，采用FRD 聯(lián) 合Care HPV 與TCT 聯(lián) 合Aptima HPV 同 時進行檢測。

納入標準：年齡21～65 歲（平均42.53±18.62歲）、有性生活史的患者。

取材排除標準：宮頸和（或）陰道急性炎癥期，經(jīng)期，妊娠期，在服用葉酸受體介導(dǎo)的抗腫瘤藥，篩查前48 h 內(nèi)陰道和（或）子宮內(nèi)進行過灌洗或用過殺精劑，篩查前48 h 內(nèi)進行過宮頸細胞或HPV 檢測的樣本采集，篩查前7 d內(nèi)進行過陰道鏡檢查，篩查前30 d內(nèi)進行過宮頸組織活檢或組織內(nèi)膜刮取，3 月內(nèi)使用激素，24 h內(nèi)有性生活。

我院醫(yī)學(xué)倫理委員會對本研究審核、批準，參與患者對本研究知情同意，征得患者同意后同時行FRD 聯(lián)合Care HPV 與TCT 聯(lián)合Aptima HPV 檢測，其中FRD 和（或）TCT 陽性者行陰道鏡檢查并取宮頸活組織，以活檢結(jié)果為金標準對比TCT 聯(lián)合Aptima HPV與FRD聯(lián)合Care HPV檢測的臨床應(yīng)用價值。

1.2 檢查方法及判斷標準

入選病例在常規(guī)婦科檢查后即行FRD 染色檢測，之后進行TCT 檢測。Care HPV 和Aptima HPV 取材同TCT。FRD 陽性或TCT 陽性轉(zhuǎn)陰道鏡及活檢，Care HPV 或Aptima HPV 陽性轉(zhuǎn)陰道鏡及活檢。各項取材由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的婦科醫(yī)生執(zhí)行，TCT報告與病理組織活檢均由經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的病理醫(yī)生完成。

1.2.1 FRD染色

采用購自陜西高源醫(yī)療器械服務(wù)有限公司的FRD 染色液進行宮頸管染色：將宮頸完全暴露，無菌小頭棉簽浸泡于FRD 染液中約2 s 至飽和，再插入宮頸管3～5 cm，沿宮頸管內(nèi)壁順時針旋轉(zhuǎn)5周，逐步拉出棉簽，觀察其顏色。宮頸染色：無菌大頭棉簽浸泡于FRD 染液中約5 s至飽和，用力涂抹宮頸5圈，再按壓宮頸約5 s 后取出，觀察其顏色。棉簽顏色與標準比色卡對比，讀取結(jié)果需在2 min 內(nèi)完成，判斷標準：淺藍色、淺綠色，提示宮頸無異常病變，棉簽顏色為藍色、藍黑色和黑色提示宮頸異常病變，行陰道鏡宮頸活檢。

1.2.2 TCT檢查

采用購自長沙康柏恩醫(yī)療科技有限公司的細胞保存液。用無菌細胞刷將刷頭伸入宮頸管，深度約1～1.5 cm，順時針轉(zhuǎn)動5圈取出，取出細胞刷，刷頭浸入液體細胞保存液，震蕩使脫落細胞保存于液基中，常溫保存待檢測。病理檢測采用TBS 系統(tǒng)分級進行判斷：無上皮內(nèi)病變或惡性病變。

鱗狀上皮細胞異常：未明意義的不典型鱗狀上皮細胞（atypical squamous cell of undetermined signifi?cance,ASC?US）及不除外高度鱗狀上皮病變的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cells?cannot exclude HIS,ASC?H）、LSIL、HSIL、鱗癌（squamous cervical cancer,SCC）。

腺上皮異常：非典型腺細胞（atypical glandular cells,AGC）、原位腺癌、腺癌（adenocarcinoma,AC）。

ASC?US 和AGC及以上的宮頸病變者為陽性，宮頸高度病變?yōu)長SIL 及以上者，均需陰道鏡檢查，并行宮頸活檢病取得病理證實。

1.2.3 Care HPV檢查

采用購自德國凱杰公司的Care HPV，該技術(shù)基于HPV DAN 檢測金標準二代雜交捕獲技術(shù)，采用專利全長8 000 個堿基對的14 種全長RNA 混合雞尾酒探針，利用核酸雜交和信號放大及化學(xué)發(fā)光方法，在分子水平對14 種高危HPV 亞型進行檢測，無需基因擴增，快速準確。在標本收集后1～3 d完成檢測。

1.2.4 Aptima HPV

采用全自動核酸檢測系統(tǒng)PANTHER（Hologic）。此方法為不能區(qū)分具體型別的定性檢測，能直接檢測出基于HPV 的2 個致癌基因E6/E7 病毒信使RNA（mRNA）。檢測分為靶標捕獲、靶標擴增及雜交保護反應(yīng)3個步驟，在一只試管中可完成。試劑盒內(nèi)含質(zhì)控品，可對核酸的捕獲、擴增和檢測情況以及操作員或儀器出現(xiàn)的錯誤進行監(jiān)測。

1.2.5 陰道鏡檢查及活檢取材

采用深圳金科威SLC 2000 電子陰道鏡成像系統(tǒng)進行陰道鏡檢。檢查時間為月經(jīng)干凈后3～7 d 進行。一次性窺陰器充分暴露宮頸，陰道鏡下放大20倍觀察，在宮頸鱗柱交界處3、6、9、12 點以及可疑病變處取材，采集標本標注后置于10% 福爾馬林液中保存送病理學(xué)檢查。

1.2.6 宮頸活組織病理學(xué)檢查

診斷標準參照2009 年WHO 子宮頸腫瘤組織學(xué)分類標準，包括慢性宮頸炎、宮頸上皮內(nèi)瘤變及浸潤癌，其中宮頸上皮內(nèi)瘤變包括LSIL、HSIL 和HG?CGIN，浸潤癌分為SCC 及AC。LSIL 及以上定義為病理學(xué)陽性病變。

1.3 評價指標

以陰道鏡檢查結(jié)果為金標準，比較FRD、TCT、Care HPV、Aptima HPV、FRD+Care HPV、TCT+Aptima HPV 檢測方法的檢出及漏診率與病理活檢的一致性；對各種檢測方法的特異度、敏感度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值進行比較。其中敏感度=真陽性例數(shù)（/真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)（/真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)（/真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用（）表示，兩組之間率的比較用χ2檢驗來分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FRD分流與病理檢測結(jié)果比較

病理活檢檢出124 例陽性患者，檢出率為6.20%（124/2000）；FRD 檢測127 例陽性患者，檢出率為6.35%（127/2000），漏診率為16.13%（20/124），與病理活檢具有較好的一致性（Kappa=0.815，P=0.000）。FRD 檢測與病理檢出率比較經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.004，P=0.169）。見表1。

表1 FRD分流與病理結(jié)果比較 /例

2.2 TCT分流與病理結(jié)果比較

病理活檢檢出陽性111 例，檢出率為6.20%（124/2000），TCT 檢測陽性率為130 例，檢出率為6.50%（130/2000），漏診率為14.52%（18/124），與病理活檢具有較好的一致性（Kappa=0.821，P=0.000）。TCT檢測分流結(jié)果與病理組織確診結(jié)果經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.004，P=0.178）。見表2。

表2 TCT分流與病理結(jié)果比較 /例

2.3 Care HPV分流與病理檢測結(jié)果比較

病理活檢檢出陽性124 例，檢出率為6.20%（124/2000），Care HPV 檢測陽性率為114 例，檢出率為5.70%（114/2000），漏診率為16.13%（20/124），與病理活檢具有較好的一致性（Kappa=0.811，P=0.000）。Care HPV 檢測結(jié)果與病理組織確診率經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.005，P=0.173）。見表3。

表3 care HPV分流與病理結(jié)果比較 /例

2.4 Aptima HPV分流與病理檢測結(jié)果比較

病理活檢檢出陽性111 例，檢出率為6.20%（124/2000），Aptima HPV 檢測陽性率為112 例，檢出率為5.60%（112/2000），漏診率為16.93%（21/124），與病理活檢具有較好的一致性（Kappa=0.821，P=0.000）。Aptima HPV 檢測分流結(jié)果與病理組織確診結(jié)果經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.006，P=0.168）。見表4。

表4 Aptima HPV分流與病理結(jié)果比較 /例

2.5 FRD+Care HPV檢測分流與病理檢測結(jié)果比較

病理活檢檢出陽性124 例，檢出率為6.20%（124/2000），F(xiàn)RD+Care HPV 檢測陽性率為128 例，檢出率為6.40%（128/2000），漏診率為4.84%（6/124），與病理活檢具有較好的一致性（Kappa=0.618，P=0.000）。FRD+Care HPV 檢測分流結(jié)果與病理組織確診結(jié)果經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.003，P=0.292）。見表5。

表5 FRD+Care HPV分流與病理結(jié)果比較 /例

2.6 TCT+Aptima HPV 檢測分流與病理檢測結(jié)果比較

病理活檢檢出陽性124 例，檢出率為6.20%（124/2000），TCT+Aptima HPV 檢測陽性率為126 例，檢出率為6.30%（126/2000），漏診率為1.61%（2/124），與病理活檢具有較好的一致性（Kappa=0.810，P=0.000）。TCT+Aptima HPV 檢測分流結(jié)果與病理組織確診結(jié)果經(jīng)卡方檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.004，P=0.216）。見表6。

表6 TCT+Aptima HPV 分流與病理結(jié)果比較 /例

2.7 不同檢測方法的診斷效能比較

FRD、TCT、Care HPV、Aptima HPV、FRD+Care HPV 和TCT+Aptima HPV 敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值見表7。敏感度FRD、TCT、Care HPV和Aptima HPV各組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），F(xiàn)RD+CareHPV 和TCT+Aptima HPV 之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但FRD（或TCT、或Care HPV、或Aptima HPV）和FRD+Care HPV（或TCT+Aptima HPV）組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。特異度和陰性預(yù)測值各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。陽性預(yù)測值FRD 和TCT 之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Care HPV 和Aptima HPV 之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），F(xiàn)RD+Care HPV 和TCT+Aptima HPV 之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但FRD（或Care HPV、或TCT、或Aptima HPV）和FRD+Care HPV（或TCT+Aptima HPV）組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表7 不同檢測方法的診斷效能比較 %

3 討論

FRD 利用宮頸病變細胞內(nèi)發(fā)生異常變化，從而表現(xiàn)出不同顏色來判斷病變的性質(zhì)，是人體上皮組織腫瘤活細胞的染色劑。由于葉酸受體在多數(shù)腫瘤細胞表面高表達，在正常細胞表面少表達，所以葉酸復(fù)合物作為腫瘤特殊靶向介導(dǎo)分子用于診斷技術(shù)[5]。FRD 染液涂抹于宮頸上皮后的病變細胞，葉酸衍生物就會與其表面的葉酸受體結(jié)合進入細胞質(zhì)，激活細胞質(zhì)內(nèi)亞鐵離子，使無色的還原態(tài)亞甲藍迅速生成氧化還原態(tài)的亞甲藍并溢出細胞外，表現(xiàn)為變色反應(yīng)[6]。Care HPV 是在雜交捕獲技術(shù)（hybrid capture 2,HC2）的基礎(chǔ)上引入磁珠捕獲的方法，采用互補性RNA 探針與宮頸脫落細胞中HPV DNA 進行雜交形成DNA 和RNA 雜交物，在微孔板中定性檢出宮頸標本中14種高危人乳頭瘤狀病毒利用核酸雜交和信號放大及化學(xué)發(fā)光方法[7?8]。本研究發(fā)現(xiàn)FRD 對宮頸病變的檢出率為6.35%，與病理活檢確證率6.20%之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Care HPV 檢測陽性率為5.70%，與病理活檢檢出率6.20%差異無統(tǒng)計學(xué)意義,FRD 和Care HPV 在CC 篩查中檢出率和病理確證率的一致性提示FRD和Care HPV在宮頸病變篩查中有重要的臨床意義，這與Xiao等[9]和Simms等[10]研究成果一致。

TCT通過采集陰道或?qū)m頸分泌物，獲得脫落細胞后浸入液基細胞處理試劑中進行處理，可用HE 染色、巴氏染色或其他免疫組織化學(xué)染色等方法使細胞著色，再通過人工觀察分析來檢查陰道或?qū)m頸的細胞形態(tài)，診斷子宮頸癌及其癌的前期變化[11?12]。Aptima HPV 利用PCR 技術(shù)擴增靶物HPV E6/E7 mRNA，然后以核酸雜交的方式獲取14 種高危型HPV。Aptima HPV 提供HPV16 E6/E7 mRNA 和（或）HPV18 E6/E7 mRNA 基因分型報告，并將其他12 種高危型別HPV 混合報告[13?14]。本研究發(fā)現(xiàn)TCT 對宮頸病變的檢出率為6.50%，與病理活檢確證率6.20%之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Aptima HPV 檢測陽性率為5.60%，與病理活檢檢出率6.20%差異無統(tǒng)計學(xué)意義，TCT 和Aptima HPV 在CC 篩查中檢出率和病理確證率的一致性提示TCT和Aptima HPV 在宮頸病變篩查中有重要的臨床意義，這與Fan等[15]和Ruan 等[16]研究成果一致。

西方發(fā)達國家和我國東南沿海經(jīng)濟發(fā)達的省市CC 發(fā)病率呈逐年下降趨勢，而在發(fā)展中國家呈上升趨勢，這與其是否擁有完善的“細胞學(xué)/HPV、陰道鏡、病理學(xué)檢查”三階梯CC 篩查模式密切相關(guān)[17]。細胞學(xué)和HPV 的聯(lián)合檢測不僅提高了檢出率，還降低了漏診率，顯著提高了篩查效率[18]。本研究FRD 聯(lián)合Care HPV 檢測陽性率6.40%，與病理活檢檢出率6.20%差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而漏診率4.84%，較FRD的16.13%和Care HPV16.13%顯著降低。本研究中TCT聯(lián)合Aptima HPV 對檢測陽性率6.30%，與病理活檢檢出率為6.20%差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而漏診率1.61%，較TCT 的14.52%和Care HPV 的16.93%顯著降低。提示細胞染色聯(lián)合HPV 檢測較單獨采用細胞學(xué)或HPV 篩查能提高漏診率，提高與病理結(jié)果的符合率。

敏感度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值是衡量檢測方法的基本指標，尤其是敏感和陽性預(yù)測值是衡量漏診的主要指標[19]。本研究發(fā)現(xiàn)FRD、TCT、Care HPV 和Aptima HPV 之間敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但FRD 聯(lián)合Care HPV（或TCT 聯(lián)合Aptima HPV）與FRD（或TCT、或Care HPV、或Aptima HPV）比較，敏感度顯著提高，而FRD 聯(lián)合Care HPV 和TCT聯(lián)合Aptima HPV 之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；陽性預(yù)測值FRD 和Care HPV、TCT 和Aptima HPV、FRD 聯(lián)合Care HPV 和TCT 聯(lián)合Aptima HPV 之間敏感度差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但FRD（或Care HPV）、TCT（Aptima HPV）、FRD 聯(lián)合Care HPV（或TCT 聯(lián)合Aptima HPV）組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這提示細胞學(xué)和HPV聯(lián)合檢測可以提高檢測的陽性預(yù)測值，有助于提高檢查率，降低漏診率。這與古力米熱·乃扎爾等[20]和Zhang等[21]的研究結(jié)果相一致。

總之，F(xiàn)RD 聯(lián)合Care HPV（或TCT 聯(lián)合Aptima HPV）均能提高檢出率，降低漏診率，同時提高敏感度和陽性預(yù)測值，是提高宮頸病變篩查的有效途徑。然而TCT和Aptima HPV 不僅費用高，而且耗時長，對工作人員的要求較高，不僅需要專職的病理醫(yī)師，還需專項性高的檢驗醫(yī)師，同時并不能降低檢測的誤差率，不能在經(jīng)濟條件落后地區(qū)大面積展開。FRD和Care HPV 的研發(fā)，不僅解決了費用問題，還解決了技術(shù)難度問題，F(xiàn)RD 和Care HPV 操作簡單方便，費用僅為TCT 和Aptima HPV 的10%左右，而FRD 和Care HPV 聯(lián)合檢測敏感度、陽性預(yù)測值、檢出率、漏診率、和病理確證的符合率都TCT 和Aptima HPV 接近，特別適合包括我國在內(nèi)的發(fā)展中國家。