人參皂苷Rg1通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞（K562）衰老

周雯 韓艷軍 周玥 汪小波 丁繼超 劉小虎

【摘要】目的：探討磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路在人參皂苷Rg1 （ginsenoside Rg1）誘導(dǎo)人紅白血病細(xì)胞（K562）衰老中的作用機制。方法：將K562分為實驗組和對照組，實驗組加入20 μmol·Lˉ1的人參皂苷Rg1，對照組加入等量的PBS。使用CCK-8試劑盒檢測K562的增殖能力;使用SA-β-gal染色檢測細(xì)胞衰老情況、western blotting檢測端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）活性以確定K562細(xì)胞衰老生物學(xué)改變，熒光定量PCR檢測PI3K，Akt和mTOR mRNA表達(dá)改變，western blotting 檢測PI3K、p - Akt、p - mTOR和自噬調(diào)控因子微管輕鏈I蛋白3-II型（LC3II）蛋白表達(dá)的改變。結(jié)果：人參皂苷Rg1誘導(dǎo)后，K562細(xì)胞增殖抑制率增高，K562的增殖能力下降（P<0.05），SA-β-gal染色顯示衰老細(xì)胞較對照組明顯增多，陽性率增高（P<0.05），端粒酶hTERT蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05），K562細(xì)胞呈現(xiàn)衰老生物學(xué)改變;自噬調(diào)控因子LC3II蛋白表達(dá)下調(diào)（P<0.05）與對照組比較，實驗組K652細(xì)胞PI3K，Akt和mTOR mRNA表達(dá)上調(diào)（P<0.05），PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表達(dá)上調(diào)（P<0.001）。結(jié)論： 人參皂苷Rg1可通過激活PI3K /Akt / mTOR信號通路誘導(dǎo)K562細(xì)胞衰老。

【關(guān)鍵詞】K562;衰老;人參皂苷Rg1;PI3K;Akt;mTOR

【中圖分類號】R733.7 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2026-5328（2021）08-014-03

白血病 （leukemia） 是多能造血干細(xì)胞異常增殖形成的惡性血液系統(tǒng)疾病，病因復(fù)雜多樣，目前化療藥物治療是臨床白血病治療的主要方法，但化療藥物在殺傷白血病細(xì)胞的同時也損傷機體正常血細(xì)胞[1，2]。許多天然藥物在抗白血病細(xì)胞同時具有保護正常細(xì)胞的優(yōu)點，因此，對中藥活性成分的探究并從其中尋找治療白血病的有效藥物是值得探索的途徑之一。

據(jù)報道，人參皂苷Rg1在體外可有效抑制白血病K562細(xì)胞增殖[3，4]，促進腫瘤細(xì)胞凋亡[5]?，F(xiàn)下對人參皂苷Rg1的作用機制研究大多針對促進腫瘤細(xì)胞凋亡，但卻很少有研究報道Rg1誘導(dǎo)白血病細(xì)胞衰老的作用機制。本研究以人慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞為對象，探討人參皂苷Rg1通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導(dǎo)K562細(xì)胞衰老的機制。

1.材料

2.K562細(xì)胞、RPMI培養(yǎng)基（HyClone公司）;胎牛血清（BI公司）;人參皂苷Rg1（大連美侖生物有限公司，純度>95%）;CCK-8試劑盒、SA-β-Gal Staining Kit （ Cell Signaling 公司）;，PCR 引物（ Invitrogen 公司）;熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa 公司））;抗體（Santa Cruz 公司）;蛋白裂解液（ Applygen公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

2.分組

實驗組：取對數(shù)生長期K562細(xì)胞加入20 μmol·Lˉ1 的人參皂苷Rg1。對照組：加入與實驗組藥物等量的PBS。置于37 ℃、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.K562細(xì)胞衰老相關(guān)生物學(xué)檢測

3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力

將K562細(xì)胞重懸后，按1×105個/ml的濃度將K562細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。實驗組加入20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rg1，每孔10 μL;對照組加入10 μL PBS，共培養(yǎng)48 后，每孔加入10 μL CCK-8，孵育4 h后，酶標(biāo)儀檢測A450值。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對照組A450平均值-實驗組A450平均值）/對照組A450平均值×100%。

3.2 SA-β-Gal衰老染色

將K562細(xì)胞重懸后，取1×105 個K562細(xì)胞置于50 c㎡的培養(yǎng)瓶中，加入 RPMI 1640培養(yǎng)基至5 mL。實驗組和對照組分別加入20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rg1和PBS 各500 μL，培養(yǎng)48 h后離心收集兩組細(xì)胞，PBS洗滌2次，按照SA-β-Gal Staining Kit 方法操作，染色細(xì)胞孵育12h后顯微鏡下進行計數(shù)。

3.3 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）活性檢測

收集兩組細(xì)胞，PBS洗滌2次，提取各組細(xì)胞總蛋白，按BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定總蛋白濃度，取等量總蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 2h，加入兔抗鼠hTERT一抗（ 1∶200），4℃ 過夜，TBST 緩沖液漂洗2次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗 （1∶5000），室溫反應(yīng) 2h，TBST洗膜3次，CL增強發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光，顯影定影后觀察結(jié)果。

3.4 熒光定量PCR檢測PI3K，Akt和mTOR mRNA的表達(dá)

收集兩組細(xì)胞，Trizol裂解后，分別提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為DNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：30℃，10min，42℃，30min，95℃，5min;以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴增PI3K，Akt和mTOR，以 GAPDH 為內(nèi)參照。引物序列見表1。擴增條件：50℃ 2min; 95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環(huán)。 應(yīng)用Quantity One 4. 6. 2 軟件（ Bio Rad公司） 進行數(shù)據(jù)處理，分析結(jié)果。

3.5 western blotting 檢測PI3K、p-Akt、p-mTOR和自噬調(diào)控因子LC3II蛋白表達(dá)

收集兩組細(xì)胞，PBS洗滌2次，提取各組細(xì)胞總蛋白，按BCA蛋白濃度測定試劑盒方法測定總蛋白濃度，取等量總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入兔抗鼠PI3K、p-Akt、p-mTOR、LC3II一抗（ 1∶200），4℃過夜，TBST緩沖液漂洗2次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（ 1∶5000），室溫反應(yīng) 2h，TBST洗膜3次，ECL增強發(fā)光試劑顯色，凝膠成像系統(tǒng)曝光，顯影定影后觀察結(jié)果。

3.6 統(tǒng)計學(xué)分析

運用 SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行實驗數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析方法，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1. 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞增殖的影響

實驗組K562經(jīng)20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rg1處理48 h后，抑制率為（35.23±0.26）;與對照組相比，實驗組K562細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞增殖能力下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05）。

2. Rg1對K562細(xì)胞SA-β-Gal染色陽性率的影響

K562細(xì)胞經(jīng)不同組處理48h后，與對照組比較，實驗組K562細(xì)胞SA-β-Gal染色陽性率增高（見表2），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（P<0.05）。

3.人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞hTERT活性的影響

對照組hTERT蛋白表達(dá)為65.220±1.611%，實驗組hTERT蛋白表達(dá)為21.117±1.166 %（P<0.01）;與對照組比較，實驗組K562細(xì)胞hTERT蛋白表達(dá)下調(diào)。

4. 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞自噬因子LC3Ⅱ表達(dá)的影響

對照組K562細(xì)胞自噬因子LC3II表達(dá)量為30.477±0.828 %，實驗組LC3II表達(dá)量為18.790±2.305 %;與對照組比較，Rg1組K562細(xì)胞LC3II蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。

5. 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)的影響

經(jīng)過濃度為20 μmol·L-1的人參皂苷Rg1作用48h，與對照組比較，Rg1組K562細(xì)胞PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)（見表3）。

6. 人參皂苷Rg1對K562細(xì)胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，Rg1組K562細(xì)胞PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平上調(diào)（見表4）

討論

白血病是一類由造血干細(xì)胞惡性克隆形成的疾病，白血病的傳統(tǒng)治療包括骨髓移植和化療，骨髓移植供體來源缺，治療費用昂貴，化療副作用大，特異性差，且化療藥物在殺傷白血病細(xì)胞的同時也對機體正常細(xì)胞起到損傷的作用，探尋既能殺滅白血病細(xì)胞又能保護正常血液細(xì)胞的調(diào)控劑是白血病治療研究的新策略。

人參是祖國醫(yī)學(xué)“補氣活血”的君藥，具有生血，補氣，抗衰老，抗腫瘤的功效，Rg1對白血病K562細(xì)胞具有抑制增殖分化的功能。據(jù)報道，K562細(xì)胞與5、10、20、40、80μmol·Lˉ1劑量的人參皂苷共培養(yǎng)24、48、72h后，20 μmol·Lˉ1人參皂苷Rgl與K562細(xì)胞共培養(yǎng)48 h 時，對K562細(xì)胞增殖抑制作用最強。[6]Rg1能否通過誘導(dǎo)K562細(xì)胞衰老達(dá)到抑制白血病的作用是本文著重關(guān)注的問題。

細(xì)胞異常增殖是腫瘤的基本特征之一，細(xì)胞衰老是抑制增殖的重要機制，檢測腫瘤細(xì)胞增殖能力是評價腫瘤發(fā)生發(fā)展和腫瘤細(xì)胞衰老程度的重要指標(biāo)。衰老的細(xì)胞內(nèi)SA-β-Gal活性上調(diào)，與X-Gal反應(yīng)后在顯微鏡下呈現(xiàn)深藍(lán)色，是鑒定細(xì)胞衰老的重要標(biāo)識。端粒-端粒酶系統(tǒng)與細(xì)胞增殖和衰老有關(guān)，端粒酶的高表達(dá)可使細(xì)胞永生化，進而引起腫瘤無限增殖;衰老細(xì)胞端粒長度縮短，端粒酶活性下降hTERT與端粒酶活性呈正相關(guān)[7]。本研究將Rg1體外作用于K562細(xì)胞，結(jié)果顯示，Rg1誘導(dǎo)后K562細(xì)胞增殖能力顯著下降，SA-β-Gal染色陽性細(xì)胞數(shù)量增多，hTERT活性顯著下降，這些改變與細(xì)胞衰老的生物學(xué)變化一致，提示Rg1可在體外誘導(dǎo)K562細(xì)胞衰老。

自噬通過清除氧自由基和受損細(xì)胞器及誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡，來維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和基因組穩(wěn)定，抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展;同時細(xì)胞通過自噬清除其損傷的細(xì)胞器或錯誤折疊蛋白發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞衰老的功能，細(xì)胞自噬水平下降可加速細(xì)胞衰老的發(fā)生。LC3-II的含量的多少與自噬體數(shù)量的多少呈正比，是反映自噬強度的指標(biāo)。Rg1誘導(dǎo)后K562細(xì)胞PI3K，Akt和mTOR mRNA表達(dá)上調(diào)，PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)上調(diào)，說明Rg1可通過激活PI3K/Akt/mTOR信號通路而抑制細(xì)胞自噬，自噬調(diào)控分子LC3-II的表達(dá)下調(diào)，從而在誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

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[基金項目]國家自然科學(xué)基金（81860038;81660731;81873103）

[第一作者]周雯，碩士生，從事中藥藥理學(xué)相關(guān)研究，

[通訊作者]*周玥，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥藥理學(xué)