殼聚糖對(duì)PM2.5所致小鼠急性肺損傷的干預(yù)作用

熊程趙英政陶映君徐光翠

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

近年來(lái),以PM2.5濃度嚴(yán)重超標(biāo)為特征的霧霾污染仍是空氣污染的主要原因。PM2.5是空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5μm的懸浮細(xì)顆粒物,高濃度PM2.5是霧霾的主要成因。我國(guó)PM2.5的高排放與我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、產(chǎn)業(yè)和能源結(jié)構(gòu)的不合理、城市化進(jìn)程的加速以及汽車(chē)保有量的快速上升等因素有關(guān)。因此,治理PM2.5污染將是一項(xiàng)長(zhǎng)期而又困難的工作,這就意味著我國(guó)大多數(shù)城市居民在未來(lái)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)都將生活在PM2.5超標(biāo)的環(huán)境中。據(jù)估計(jì),在全世界范圍內(nèi),每年空氣污染暴露造成約700萬(wàn)人過(guò)早死亡,3%的傷殘調(diào)整生命年減少[1]。PM2.5由于其形狀不規(guī)則、粒徑小,可以直接進(jìn)入肺泡,并在大氣中懸浮時(shí)間較長(zhǎng),能夠吸附大量毒性化合物等諸多特點(diǎn),會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重危害?？諝庵蠵M2.5的濃度與呼吸系統(tǒng)疾病、哮喘等的發(fā)病率、死亡率有緊密的聯(lián)系[2-3]。PM2.5容易滯留在終末細(xì)支氣管和肺泡中,從而刺激機(jī)體肺部或全身發(fā)生炎癥和氧化應(yīng)激,造成肺部損傷[4]。

雖然我國(guó)頒布了一系列控制空氣污染的法規(guī),這勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致PM2.5水平在今后會(huì)急劇減少。但目前人們?nèi)匀槐┞队谳^高的空氣污染水平,而且比目前環(huán)保部門(mén)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)要高許多倍。如果膳食補(bǔ)充劑或藥物制劑可以減輕空氣污染對(duì)健康的不利影響,那么居住生活在空氣高污染地區(qū)的民眾其健康可能會(huì)得到一定程度的保護(hù)。殼聚糖(chitosan,CTS)是甲殼素脫乙?；蟮慕到猱a(chǎn)物,是自然界中唯一大量存在的堿性氨基多糖。研究表明,殼聚糖具有清除自由基、保護(hù)機(jī)體免受過(guò)氧化損傷、調(diào)節(jié)血脂、保護(hù)肝、進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)等功能[5-6]。本研究采用動(dòng)物試驗(yàn),小鼠提前2周攝入一定劑量殼聚糖,之后氣管滴注PM2.5,評(píng)估短期PM2.5重復(fù)暴露對(duì)成年小鼠的肺健康效應(yīng),探討小鼠補(bǔ)充殼聚糖后是否可以減輕PM2.5暴露所致急性肺損傷的影響。這一研究結(jié)果將為減輕空氣污染對(duì)大眾健康的一種保護(hù)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

44只8周齡健康SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠,體重19～26 g,從北京維通利華有限公司購(gòu)買(mǎi)【SCXK(京)2016-0002】,飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院具有獨(dú)立通風(fēng)籠盒(IVC)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房【SYXK(豫)2016-0006】。1周適應(yīng)期后,隨機(jī)分為4組,即對(duì)照組、PM2.5組、殼聚糖組及殼聚糖+PM2.5組,每組11只。殼聚糖組及殼聚糖+PM2.5組動(dòng)物提前2周灌胃殼聚糖,劑量為200 mg/kg,采用等容量灌胃法(0.2 mL/10 g BW),對(duì)照組和PM2.5組灌胃相同劑量蒸餾水,每天1次,持續(xù)2周。PM2.5后,PM2.5組、殼聚糖+PM2.5組小鼠氣管滴注PM2.5(4 mg/kg),對(duì)照組和殼聚糖組氣管滴注0.9%生理鹽水(saline),每天1次,連續(xù)7 d。動(dòng)物自由攝食(上海斯萊康SPF級(jí)小鼠專(zhuān)用飼料)、飲水,室溫20℃～25℃,相對(duì)濕度60%～70%,晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。所有操作均符合新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)倫理學(xué)要求(審批號(hào):XYLL-2017086)。

1.1.2 主要試劑與儀器

水溶性殼聚糖購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;總蛋白(total protein,TP)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)等檢測(cè)試劑購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司(批號(hào)分別為A045-3-2、A020-1-2、A003-1-2);白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等試劑盒均由北京索萊寶科技有限公司提供(批號(hào)分別為SEKM-0002、SEKM-0046、SEKM-0034);TE-6070 PM2.5大流量采樣器(美國(guó)TISCH公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司),電子精密天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司),超聲波清洗機(jī)(鄭州生元儀器有限公司),冷凍干燥器(北京亞星儀科有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5采樣

選取新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科技樓七樓樓頂(北緯N35°17′11.17″、東經(jīng)E113°55′59.12″)作為采樣點(diǎn)。將石英膜置于TISCH大流量顆粒物采樣器進(jìn)行采樣。將采樣膜剪成約4 cm×4 cm的正方形置于培養(yǎng)皿,加入適量的超純水。利用KQ-500E型超聲波震蕩儀震蕩培養(yǎng)皿,冷凍干燥法采集培養(yǎng)皿內(nèi)的PM2.5。

1.2.2 動(dòng)物處理與樣本采集

末次染毒24 h后,稱(chēng)重,用4%異氟烷麻醉動(dòng)物,股動(dòng)脈取血。處死動(dòng)物,分離腎及肝并稱(chēng)重,計(jì)算臟器系數(shù):臟器質(zhì)量(g)/體重(100 g),分離血清。結(jié)扎右肺,取右肺下葉,多聚甲醛固定,蘇木精-伊紅(HE)染色。用預(yù)冷的PBS灌洗左肺,收集BALF。采用Bradford法測(cè)定TP和MDA含量;利用分光光度法測(cè)定LDH活性;ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β和IL-8等炎性因子水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,對(duì)正態(tài)分布資料,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析;若方差齊,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊,采用Dunnet T3檢驗(yàn)。對(duì)非正態(tài)分布資料,多組間均數(shù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)——秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用GraghPad Prism 8.0繪制統(tǒng)計(jì)分析圖。

2 結(jié)果

2.1 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠體重、臟器質(zhì)量及其臟器系數(shù)的影響

以體重、肝重、腎重及其臟器系數(shù)作為測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。與對(duì)照組比,PM2.5組小鼠體重、肝重、腎重及其臟器系數(shù)明顯降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);殼聚糖組體重、肝重、腎重及其臟器系數(shù)與對(duì)照組比無(wú)明顯差異(P＞0.05)。當(dāng)小鼠提前攝入一定劑量的殼聚糖,2周后暴露PM2.5,與不攝入殼聚糖的PM2.5組比,殼聚糖+PM2.5組小鼠體重、肝重和肝臟器系數(shù)均有所升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),但腎及其臟器系數(shù)無(wú)明顯差異(P＞0.05);與殼聚糖組比,殼聚糖+PM2.5組肝重降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠體重、臟器質(zhì)量及其臟器系數(shù)的影響(±s,n=11)Table 1 Effects of chitosan on body weight,organ mass and organ coefficient of mice exposed to PM2.5(±s,n=11)

表1 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠體重、臟器質(zhì)量及其臟器系數(shù)的影響(±s,n=11)Table 1 Effects of chitosan on body weight,organ mass and organ coefficient of mice exposed to PM2.5(±s,n=11)

注:與對(duì)照組比較,#P＜0.05;與PM2.5組比較,*P＜0.05;與殼聚糖組比較,△P＜0.05。Note.Compared with the control group,#P＜0.05.Compared with PM2.5 group,*P＜0.05.Compared with chitosan group,△P＜0.05.

組別Groups體重(g)Weight(g)肝重(g)Liver weight(g)肝系數(shù)(g/100 g)Liver coefficient(g/100 g)腎重(g)Kidney weight(g)腎系數(shù)Kidney coefficient(g/100 g)對(duì)照組Control group 22.88±2.24 1.20±0.18 5.88±0.85 0.27±0.04 1.28±0.11 PM2.5組PM2.5 group 19.07±1.58# 0.83±0.11# 4.33±0.31# 0.23±0.03# 1.12±0.07#殼聚糖組Chitosan group 22.85±2.05 1.17±0.14 5.89±0.93 0.27±0.02 1.24±0.06殼聚糖+PM2.5組Chitosan+PM2.5 group 21.18±1.28* 1.06±0.12*△ 5.03±0.67* 0.25±0.02 1.18±0.07

2.2 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠肺HE染色結(jié)果比較

對(duì)照組和殼聚糖組小鼠肺組織未見(jiàn)明顯異常。與對(duì)照組比較,PM2.5組肺泡間隔顯著增寬,出現(xiàn)炎癥,其內(nèi)有明顯的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn);與PM2.5組比較,殼聚糖+PM2.5組肺間隔明顯變窄,其內(nèi)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(見(jiàn)圖1)。

圖1 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠肺HE染色比較Figure 1 Comparison of HE staining of PM2.5 exposed mice lung with chitosan

2.3 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠BALF中TP和LDH的影響

以TP和LDH作為測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。與對(duì)照組比較,PM2.5組小鼠BALF中TP和LDH的含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);殼聚糖組小鼠BALF中TP和LDH含量與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。當(dāng)小鼠提前攝入一定劑量的殼聚糖,2周后暴露PM2.5,與沒(méi)有攝入殼聚糖的PM2.5組小鼠比較,殼聚糖+PM2.5組小鼠BALF中TP和LDH的含量明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與殼聚糖組比較,殼聚糖+PM2.5組小鼠BALF中TP和LDH的含量有所升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見(jiàn)圖2)。

圖2 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠BALF中TP和LDH的影響Figure 2 Effect of chitosan on TP and LDH in BALF of mice exposed to PM2.5

2.4 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠肝MDA的影響

以MDA作為測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。與對(duì)照組比較,PM2.5組小鼠肝中MDA含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);殼聚糖組小鼠肝中MDA含量與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與PM2.5組比較,殼聚糖+PM2.5組小鼠肝MDA含量明顯下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與殼聚糖組比較,殼聚糖+PM2.5組肝中MDA含量有所升高(P＜0.05)(見(jiàn)圖3)。

圖3 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠肝MDA的影響Figure 3 Effect of chitosan on MDA in liver of mice exposed to PM2.5

2.5 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠BALF及血清中炎性因子的影響

以IL-1β、IL-8和TNF-α作為測(cè)量指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。從圖4可見(jiàn)知,與對(duì)照組比較,PM2.5組小鼠BALF(圖4A,4B,4C)和血清中(圖4D,4E,4F)炎性因子IL-1β、IL-8和TNF-α水平明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);殼聚糖組小鼠BALF和血清中IL-1β、IL-8和TNF-α表達(dá)水平與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。與PM2.5組比較,殼聚糖+PM2.5組小鼠BALF和血清中IL-1β、IL-8和TNF-α明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與殼聚糖組比較,殼聚糖+PM2.5組BALF及血清中IL-1β水平有所升高(P＜0.05),但I(xiàn)L-8和TNF-α均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

圖4 殼聚糖對(duì)PM2.5暴露小鼠BALF和血清炎性因子的影響Figure 4 Effects of chitosan on BALF and serum inflammatory factors in mice exposed to PM2.5

3 討論

PM2.5暴露對(duì)小鼠有肺損傷,影響小鼠BALF中TP和LDH,肝MDA,BALF及血清TNF-α、IL-1β和IL-8水平。提前攝入一定劑量的殼聚糖對(duì)PM2.5所致肺損傷有一定的干預(yù)作用,主要從抑制氧化應(yīng)激和改善肺部炎癥反應(yīng)等方面促進(jìn)損傷修復(fù)。

本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn),通過(guò)氣管滴注法使小鼠暴露PM2.5,評(píng)估PM2.5短期重復(fù)劑量暴露是否對(duì)小鼠造成急性肺損傷,并給動(dòng)物提前補(bǔ)充殼聚糖,觀察殼聚糖是否可以減輕PM2.5暴露所致的毒效應(yīng)。結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,小鼠暴露PM2.5后,小鼠體重、肝重、腎重以及臟器系數(shù)明顯下降,這與李星輝等[7]研究結(jié)果一致。提示短期重復(fù)劑量PM2.5暴露對(duì)機(jī)體有一定的毒效應(yīng)。當(dāng)小鼠提前攝入一定劑量的殼聚糖,2周后暴露PM2.5,與沒(méi)有攝入殼聚糖的PM2.5組小鼠比較,殼聚糖+PM2.5組小鼠體重、肝重和肝臟器系數(shù)均有所升高。提示動(dòng)物提前補(bǔ)充殼聚糖對(duì)PM2.5所致的損傷有一定的緩解作用?？赡芘cPM2.5激發(fā)的氧化應(yīng)激有關(guān),殼聚糖具有清除自由基、保護(hù)機(jī)體免受過(guò)氧化損傷等作用[5],動(dòng)物提前攝入殼聚糖可能保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激,從而維系了相對(duì)正常三羧酸循環(huán)和代謝水平。

小鼠肺切片顯示,PM2.5染毒后肺泡間隔顯著增寬,出現(xiàn)明顯的炎癥改變,而殼聚糖在一定程度上能抑制肺部的炎性作用;與PM2.5組比較,殼聚糖+PM2.5組肺間隔明顯變窄,其內(nèi)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。上述結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的其它抗氧化劑的干預(yù)效果一致[8-9]。

PM2.5誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激在顆粒污染物所致呼吸系統(tǒng)急性效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[10-11]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化作用的最終產(chǎn)物,也是機(jī)體氧化損傷的主要標(biāo)志物。MDA含量的測(cè)定可以直接反映機(jī)體受到氧化損傷的程度[12-13],其容易引起細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,導(dǎo)致膜的功能損傷或喪失,進(jìn)而使得細(xì)胞內(nèi)LDH和TP漏出[14]。LDH是反映細(xì)胞膜損傷的早期敏感指標(biāo),是細(xì)胞毒性的標(biāo)志物;TP是反應(yīng)肺部血管通透性的指標(biāo),TP水平可反映肺泡上皮-毛細(xì)血管屏障損傷程度[15]。本研究發(fā)現(xiàn),染毒后肺泡灌洗液中的LDH、TP和肝中MDA明顯升高,而提前攝入一定劑量的殼聚糖后,以上指標(biāo)不同程度降低,由此可推測(cè)PM2.5可使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性發(fā)生改變,影響肺部血管通透性;而殼聚糖具有的抗氧化功效可減輕由PM2.5造成的氧化損傷,這與其它文獻(xiàn)的研究結(jié)果基本一致[5]。

PM2.5能夠誘發(fā)肺部炎癥,促進(jìn)呼吸道細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)如IL-8及TNF-α等[16-17]。TNF-α是生物體內(nèi)主要的促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子,主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,參與機(jī)體的急、慢性炎癥過(guò)程[18]。研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖能增強(qiáng)靜息中性粒細(xì)胞的活性,抑制中性粒細(xì)胞的過(guò)度活化、細(xì)胞中IL-8和TNF-α的分泌[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠暴露PM2.5,其BALF及血清中TNF-α、IL-1β和IL-8水平明顯升高,提前攝入一定劑量的殼聚糖能降低其表達(dá),對(duì)TNF-α和IL-8的抑制作用尤為明顯,因此提示殼聚糖通過(guò)對(duì)促炎因子表達(dá)的抑制作用可緩解PM2.5誘發(fā)的肺部炎癥反應(yīng),改善炎癥反應(yīng)所致肺損傷[22-23]。