中國小型豬在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究進展

陳雨榮安星蘭張勝翟巖輝于浩代相鵬*李子義*

(1.吉林大學第一醫(yī)院人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室,長春 130021;2.吉林大學動物科學學院,長春 130062)

人類疾病動物模型是為闡明人類疾病的發(fā)生發(fā)展機制或建立預防、診斷和治療方法而制作的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的實驗動物[1]。小型豬在生理生化指標、解剖結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)代謝、藥物代謝和疾病發(fā)展等方面與人類相似,是理想的研究人類疾病的動物模型[2]。我國小型豬實驗動物化研究開展于上世紀80年代,與歐美國家相比落后40多年。但我國小型豬資源豐富,一些地方小型豬種長期在封閉環(huán)境中進行繁育,形成了體型小、性成熟早、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)良特性,具有廣闊的應(yīng)用前景。我國實驗動物化培育的小型豬品系包括:巴馬小型豬、貴州小型豬、中國實驗用小型豬、五指山小型豬、西藏小型豬、版納微型豬、蕨麻小型豬等[3-4]。目前研究人員已建立了多種基于中國小型豬的人類疾病模型,但不同品系的小型豬在模擬不同的人類疾病上具有差異。為方便科研人員依照研究目的選擇合適的小型豬進行疾病研究,本文將對中國小型豬資源現(xiàn)狀及近年來建立的人類疾病模型進行綜述,為利用中國小型豬研究人類疾病提供參考和指導。

1 中國小型豬的資源現(xiàn)狀

在國家畜禽遺傳資源委員會辦公室近期公布的《國家畜禽遺傳資源品種名錄-豬志》中總共提及83個豬地方品種,其中屬于小型豬有香豬、五指山豬、藏豬、滇南小耳豬等。中國小型豬具有體重小、抗逆性強、性成熟早、肉質(zhì)好等特點,是發(fā)展生豬產(chǎn)業(yè)、培育新品種、保護遺傳多樣性、研究人類疾病的重要資源。由于中國小型豬種類較多,品種形成歷史復雜,為了進一步明確中國小型豬的起源和進化關(guān)系,選擇了12個代表性的各個地域的小型豬品種,以西南野豬、東北野豬、歐洲野豬為種的外類群,非洲疣豬為屬的外類群。利用MEGA X軟件,采用最小進化法基于線粒體DNA全基因組序列進行系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建(見圖1)[5-10]。結(jié)果表明:中國小型豬主要起源于西南野豬,而與東北野豬、歐洲野豬的進化距離較遠。首先從西南野豬分化出來的是江浙地區(qū)的金華豬,另外一個是由兩個亞類群組成的大類群,其中一支由云貴地區(qū)的版納微型豬、從江香豬與滇南小耳豬組成的亞類群,另一支則是由巴馬香豬、五指山豬、陸川豬、藏豬、碧湖豬、隆林豬、萊蕪豬和荷包豬構(gòu)成的最大類群。在最大的子類群中,云貴地區(qū)的小型豬無論從地理上還是遺傳距離上都更接近西南野豬。推測中國的小型豬品種最初是從西南地區(qū),尤其是云貴地區(qū)開始品種形成并逐漸向外擴散,可能由于人類遷移的不確定性等因素的影響,后期形成的小型豬種并沒有形成地理依賴性聚類。

圖1 基于線粒體全基因組構(gòu)建的中國小型豬分子發(fā)生樹Figure 1 Molecular phylogenetic trees of Chinese miniature pigs based on complete mitochondrial genome

2 中國小型豬在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究

2.1 香豬

香豬包括從江香豬、環(huán)江香豬、劍白香豬、久仰香豬以及巴馬香豬[11]。

2.1.1 巴馬香豬(Bama xiang pig)

巴馬香豬原產(chǎn)于廣西巴馬瑤族自治縣,因其肉味鮮香得名“香豬”。巴馬香豬體型較小,具有臀頭黑、其余白的“兩頭烏”的毛色。成年母豬體重為(40.88±1.14)kg,公豬(27.13±2.06)kg,母豬72日齡,公豬110日齡性成熟,母豬多產(chǎn),平均窩產(chǎn)仔數(shù)10.07頭。巴馬縣巴馬鎮(zhèn)設(shè)有一巴馬香豬國家級保種廠[11]。

廣西巴馬小型豬是1987年廣西大學王愛德教授等[12-13]以巴馬香豬為原始基礎(chǔ)群,采用閉鎖純繁近交方式培育而成的小型豬封閉群品系。1994年定名為“廣西巴馬小型豬”,簡稱“巴馬小型豬”。該品系成年母豬體重為40 kg左右,公豬35 kg左右[12-13]。

(1)在心血管系統(tǒng)疾病中的研究

巴馬小型豬的部分血液生理指標、心臟解剖結(jié)構(gòu)以及冠脈系統(tǒng)的分布與人類相似,目前已被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的研究中[14]。

采用球囊封堵冠狀動脈法可制備巴馬小型豬急性心肌梗死模型,該方法對實驗動物的創(chuàng)傷小,但容易引起心室顫動以及血栓[15]。開胸結(jié)扎冠狀動脈可建立良好的巴馬小型豬心肌缺血模型,該方法操作簡單,但創(chuàng)傷大且死亡率較高[16]。

李艷君等[17]采用高脂高膽固醇飼料持續(xù)飼喂誘導巴馬小型豬發(fā)生動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS),動脈粥樣硬化指數(shù)可達3.8以上,且AS特征可穩(wěn)定持續(xù)3個月以上。Fang等[18]采用CRISPR技術(shù)使載脂蛋白E基因(apolipoprotein E,ApoE)發(fā)生移碼突變,獲得ApoE-/-巴馬小型豬,經(jīng)高脂高糖飼料喂養(yǎng)6個月后模型豬出現(xiàn)嚴重的高膽固醇血癥和動脈粥樣硬化。研究人員認為該模型對AS的轉(zhuǎn)化研究具有重要意義。

采用高脂高鹽飼料連續(xù)誘導8周可建立巴馬小型豬高血壓模型,模型豬的收縮壓和舒張壓顯著上升。該模型模擬了人類自然狀態(tài)下高血壓發(fā)生進程,對人類高血壓病的預防和干預具有重要意義[19]。

Hai等[20]利用CRISPR技術(shù)敲除豬血管性血友病因子基因,建立了血管性血友病巴馬小型豬模型,模型豬出現(xiàn)嚴重凝血功能障礙,與臨床血友病患者癥狀較為相似。

(2)在內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中的研究

此外,巴馬小型豬可用于糖、脂代謝紊亂等相關(guān)代謝疾病的研究。研究人員也建立了巴馬小型豬Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)模型。Li等[21]、相磊等[22]利用高脂高糖飼料誘導建立了巴馬小型豬T2DM模型,實驗組小型豬出現(xiàn)高胰島素血癥以及肥胖癥狀。而采用飲食誘導聯(lián)合鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法可成功建立疾病特征更為穩(wěn)定的T2DM模型[23-24]。

(3)在消化系統(tǒng)疾病中的研究

巴馬小型豬的肝質(zhì)量、肝內(nèi)血管及膽管分布、肝輪廓等方面與人類相似,是研究肝疾病的理想動物模型[25]。周忠信等[26]及廖錦元等[27]采用四氯化碳(CCl4)復合因素造模法成功制備出小型豬肝硬化模型,實驗組小型豬丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及總膽紅素等水平逐漸升高,而球蛋白水平下降。并且,隨造模時間的延長,模型豬由肝纖維化逐步發(fā)展為不可逆轉(zhuǎn)的肝硬化,可用于研究肝炎、肝硬化的病理及生化指標的變化。

(4)在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究

為建立巴馬小型豬帕金森病(Parkinson disease,PD)模型,2015年賴良學團隊利用CRISPR技術(shù)成功敲除巴馬小型豬的磷酸酶及張力蛋白同源物誘導的蛋白激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)和帕金森蛋白2基因(parkin 2,PARK2)基因,但7月齡小型豬未表現(xiàn)出如震顫、運動遲緩等帕金森病的典型癥狀[28]。隨后,該團隊以相同方法敲除巴馬小型豬parkin、PINK1和DJ-1基因,但10月齡時小型豬表現(xiàn)正常[29]。Zhu等[30]采用CRISPR技術(shù)使α突觸核蛋白(α-synuclein)基因發(fā)生錯義突變,但3月齡小型豬未出現(xiàn)帕金森癥狀,仍需定期檢查是否會出現(xiàn)疾病表型。

(5)在免疫系統(tǒng)疾病中的研究

α-1,3-半 乳 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 (α-1, 3-galactosyltransferase,GGTA1)、胞苷磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶 (cytidine monophosphate-Nacetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)和β-1,4 N-乙酸氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶(β-1,4 Nacetylgalactosaminyltransferase 2,β4GalNT2)是3種引起異種移植排斥的主要抗原。潘登科團隊利用CRISPR等技術(shù)分別建立了GTTAl/β4GalNT2雙基因敲除[31],CAMH/GTTA1雙基因敲除[32]以及表達hCD47的GTTA1/hCD47[33]巴馬小型豬模型。模型豬的健康狀況和繁殖能力正常,可為進一步降低異種器官移植急性排斥反應(yīng)提供低免疫原性供體,并可用于探究hCD47基因在減弱受體巨噬細胞對異種移植各器官的排斥反應(yīng)。2017年,楊璐菡團隊利用CRISPR技術(shù)培育出了世界上首批不攜帶內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(porcine endogenous retroviruses,PERV)的巴馬豬,解決了PERV可能感染人的問題,大大提高了一種移植的安全性[34]。2020年,該團隊在PERV滅活巴馬豬的基礎(chǔ)上利用CRISPR技術(shù)敲除GGTA1,CMAH和β4GalNT2基因,并通過轉(zhuǎn)座子敲入了9個降低異種排斥反應(yīng)的人源基因(hCD46、hCD55、hCD59、hB2M、HLA-E、hCD47、hTHBD、hTFPI和hCD39),實現(xiàn)了異種移植的又一重大突破。體外實驗中,模型豬細胞對人體體液免疫、細胞介導的損傷以及凝血功能失調(diào)相關(guān)的發(fā)病機制具有抵抗性[35]。

白介素受體γ鏈基因(interleukin-2 receptor gamma gene,IL2RG)和重組活化基因 1/2(recombination activating gene 1/2,RAG1/2)與淋巴細胞發(fā)育相關(guān)。RAG1/2敲除純合豬表現(xiàn)出T、B細胞缺乏、脾發(fā)育不良等明顯的嚴重聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immune deficiency,SCID)癥狀[36]。2014年,Huang等[37]利用類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技術(shù)成功敲除巴馬小型豬RAG1/2基因,模型豬表現(xiàn)出免疫器官發(fā)育不全、無法進行V(D)J重組、缺乏成熟的B、T細胞等典型的SCID癥狀。吉林大學第一醫(yī)院人類疾病動物模型國家地方聯(lián)合工程實驗室李子義、楊永廣團隊聯(lián)合中科院動物所周琪團隊,在國家重點研發(fā)項目和中科院先導項目等支持下,目前已獲得RAG1和IL2RG雙基因突變的(RAG1-/-/IL2Rγ-/Y)SCID豬,仔豬表現(xiàn)出明顯的SCID癥狀。這些免疫缺陷模型對研究人類SCID相關(guān)疾病、評價干細胞移植的效率和安全性以及生產(chǎn)人源化動物模型具有重要意義(未發(fā)表)。

(6)在其他疾病中的研究

Zhang等[38]利用乙?；鶃喯趸?ethylnitrosourea,ENU)誘導雙氧化酶2(dual oxidase 2,DUOX2)基因發(fā)生純合錯義突變,建立了甲狀腺功能減退巴馬小型豬模型。模型豬出現(xiàn)嚴重的甲狀腺功能減退、貧血和免疫缺陷。

敲除 4-羥基苯丙酮酸氧化酶(4-OH phenylpyruvate dioxygenase,4HPPD/HPD)可建立III型酪氨酸血癥巴馬小型豬模型。模型豬血液中酪氨酸含量以及尿液中4-羥基苯乳酸和4-羥基苯乙酸水平顯著上升,符合人類III型酪氨酸血癥的臨床特征,可作為人類III型酪氨酸血癥的理想模型[39]。

2.1.2 從江香豬(Congjiang xiang pig)

從江香豬(貴州香豬)主要分布在貴州從江、苗族自治區(qū)及廣西環(huán)江縣等地。該品系豬被毛全黑,成年體重(母豬)為(55.88±2.91)kg,性成熟較早,公豬30日齡即有精液排出,窩產(chǎn)仔數(shù)為(7.11±2.35)頭[11]。

貴州小型豬是1985年貴州中醫(yī)學院甘世祥教授等以貴州小型香豬為基礎(chǔ)群,通過封閉培育、適度近交培育而成小型豬品系。1987年經(jīng)專家鑒定后正式命名為“貴州小型豬”。該品系小型豬12月齡不超過25 kg[40]。

中國實驗用小型豬是1985年中國農(nóng)業(yè)大學的裴德智等以川黔交界山區(qū)小香豬為基礎(chǔ)群,采用全同胞近交、負向選擇方法培育而成的小型豬品系。該品系小型豬成年體重為35～40 kg[41]。

(1)在心血管系統(tǒng)疾病中的研究

采用開胸結(jié)扎法[42]、球囊封堵法[43]以及導絲介入栓塞法[44]均可建立貴州小型豬急性心肌梗死模型,研究人員認為相比開胸結(jié)扎法,球囊封堵法以及介入栓塞法對實驗結(jié)果干擾小,與臨床條件更為相近。

劉錄山等[45]采用高脂高膽固醇飼喂法成功建立了貴州小型豬動脈粥樣硬化模型。模型豬冠脈和腹主動脈管腔內(nèi)出現(xiàn)明顯與人類成熟斑塊特點相似的凸起斑塊,具有脂質(zhì)壞死核心、大量泡沫細胞及炎性細胞等。

(2)在內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中的研究

采用高脂高糖飼料誘導法[46-47]或STZ連續(xù)誘導法[48]可成功建立貴州小型豬T2DM模型,模型豬血糖升高,可用于T2DM的研究。另外,陳華等[49]研究發(fā)現(xiàn)與巴馬小型豬和五指山小型豬相比,中國實驗用小型豬對高脂飼料誘發(fā)T2DM相對不敏感,建模需要較長時間誘導,可作為糖尿病抗性品系。

(3)在消化系統(tǒng)疾病中的研究

Wang等[50]采用肝動脈灌注80%乙醇方法建立了貴州小型豬肝硬化和門脈高壓模型。模型豬的疾病病理生理發(fā)展過程與人類相似,出現(xiàn)肝細胞變性壞死,肝發(fā)生明顯的纖維化,可用于研究肝硬化的診斷及治療方法。

采用外科手術(shù)方法可建立人工不完全性腭裂動物模型[51]以及牙槽嵴裂動物模型[52],這類唇腭裂模型效果穩(wěn)定,對臨床唇腭裂治療研究具有重要意義。

(4)在運動系統(tǒng)疾病中的研究

豬膝關(guān)節(jié)解剖結(jié)構(gòu)與人類相似,并且豬在運動過程中膝關(guān)節(jié)也存在大量屈曲動作。貴州小型豬還被用于建立雙膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型,研究人員分別采取移植骨髓有核細胞(bone marrow nucleated cells,BNCs)[53]或自體骨髓間充質(zhì)干細胞[54]治療軟骨缺損,并發(fā)現(xiàn)兩種方法對軟骨缺損修復效果均良好,但BNCs的移植較為經(jīng)濟方便。

(5)在其他疾病中的研究

多囊蛋白1(polycystin-1,PDK1)和多囊蛋白2(polycystin-2,PDK2)基因突變可能導致常染色體顯性遺傳性多囊腎病。2013年,He等[55]建立了PDK2過表達轉(zhuǎn)基因多囊腎病模型,但腎功能無明顯變化。2015年,該團隊利用鋅指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)技術(shù)敲除PDK1基因,建立了多囊性腎病中國實驗用小型豬模型。模型豬發(fā)生肝、腎囊腫,可用于研究多囊性腎病的發(fā)病機制[56]。

2.2 五指山豬(Wuzhishan pig)

五指山豬原產(chǎn)于海南中部黎族、苗族聚居的五指山地區(qū),因體型矮小又得名“老鼠豬”。該豬被毛多為黑色或棕色,腹部和四肢內(nèi)側(cè)為白色,成年體重為30～35 kg,公豬5～6月齡,母豬6～7月齡初配,母豬初產(chǎn)(4.37±0.22)頭,經(jīng)產(chǎn)(6.58±0.31)頭。1998年,海南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所對五指山豬進行了保種工作,并成立了五指山豬原豬場[11]。

五指山小型豬近交系是1989年中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧研究所馮書堂教授等以同窩的1公1母五指山豬通過“母配子”、“全同胞”的近交繁育方式培育而成的高度近交小型豬品系。該品系小型豬基因純合度較高,毛色為上黑下白,成年豬體重為35 kg左右[57-58]。

實驗用五指山小型豬封閉群是2007年由廣東省實驗動物檢測所王希龍等從五指山地區(qū)引種108頭五指山豬建立而成,該品系小型豬可分為花色系和白色系,12月齡體重為(27.72±6.56)kg[4]。

2.2.1 在心血管系統(tǒng)疾病中的研究

全基因組測序結(jié)果顯示五指山小型豬與人類在冠心病相關(guān)基因上存在很多相似之處,在已檢測的247個冠心病相關(guān)基因中僅缺失年齡相關(guān)性黃斑變性易感基因 2(age-related maculopathy susceptibility 2,ARMS2)基因和膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)基因,并且五指山小型豬有1618個藥物靶點與人類同源[59]。

采用微球分次灌注法或球囊封堵聯(lián)合微球栓塞法可建立五指山小型豬心力衰竭模型,兩種造模方法均具有閉胸、高成功率和重復性好等優(yōu)點[60-61]。

采用高脂飲食誘導法可建立五指山小型豬高脂血癥模型,連續(xù)誘導3～4月后小型豬血清中TC、HDL水平顯著提高。該模型模擬了人類高脂血癥發(fā)病過程,可用于研究血脂異常誘發(fā)心血管疾病的機制及預防治療辦法[62-63]。

延長高脂飲食誘導時間可建立五指山小型豬AS模型[64-65]。研究發(fā)現(xiàn)模型豬血漿和AS斑塊中脂蛋白相關(guān)磷脂酶 A2(1ipoprotein-associated phospholipaseA2,Lp-PLA2)的表達明顯升高,并且Lp-PLA2在血管炎癥發(fā)生和AS斑塊形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[65]。

2.2.2 在內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中的研究

Kong等[66]建立了肝特異性表達11β-羥類固醇脫氫酶1(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1,11β-HSD1)基因,胰島β細胞特異性表達人胰島淀粉多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)基因和DNA損傷誘導轉(zhuǎn)錄物3(C/EBP homologous protein,CHOP)基因的三基因共轉(zhuǎn)五指山小型豬。轉(zhuǎn)基因豬肝臟脂肪含量增加以及β細胞的凋亡,血糖并未升高。研究人員認為該模型具有T2DM發(fā)展?jié)摿?可用于開發(fā)治療糖尿病的新型藥物。Li等[67]建立了過表達顯性負性突變生長激素受體(growth hormone receptor,GHR)的轉(zhuǎn)基因豬模型,轉(zhuǎn)基因豬身材矮小,體重顯著降低,血糖輕度升高,胰島素/胰島素樣生長因子1通路紊亂。該模型可用于研究生長激素與癌癥、糖尿病和壽命的關(guān)系方面。

2.2.3 在消化系統(tǒng)疾病中的研究

2008年,丁鰲等[68]通過牙周翻瓣、絲線結(jié)扎和接種牙齦卟啉單胞菌造成小型豬牙周感染,再結(jié)合高脂誘導,建立了五指山小型豬牙周感染與AS復合模型。模型豬牙周袋加深,牙齦出血指數(shù)增加,并且主動脈出現(xiàn)早期AS病變,可用于研究牙周炎與冠心病的關(guān)系。

2.2.4 在免疫系統(tǒng)疾病中的研究

潘登科團隊先后采用免疫磁珠吸附[69]和TALEN技術(shù)[70]敲除α-1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(α-1,3-galactosyltransferase,GGTA1)基因,成功制備了GGTA1基因缺失的五指山小型豬。GGTA1基因敲除后可降低免疫排斥反應(yīng),為異種器官移植研究的可靠供體。隨后該團隊建立了遺傳穩(wěn)定的胰島特異表達LEA29Y轉(zhuǎn)基因五指山小型豬模型。LEA29Y是一種能夠高效抑制T細胞活性的新型人工融合蛋白。該轉(zhuǎn)基因豬用于胰島移植可以阻斷T細胞激活的共刺激通路,降低胰島移植術(shù)后人體內(nèi)T細胞介導的免疫排斥反應(yīng),是胰島異種移植的可靠供體[71]。戴一凡團隊采用CRISPR技術(shù)分別建立了GGTA1/CMAH雙基因敲除[72]、GGTA1/β4GalNT2雙基因敲除[73]以及GGTA1/β4GalNT2/CMAH三基因敲除[74]五指山小型豬,模型豬表現(xiàn)較低的免疫原性。這些模型為異種器官移植的研究與利用提供了良好的研究材料。

2.2.5 在運動系統(tǒng)疾病中的研究

楊程等[75]通過外科手術(shù)方法建立了五指山小型豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型,并發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和肋軟骨細胞(costal chondrocytes,CCs)共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程軟骨及共培養(yǎng)細胞修復五指山小型豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損均具有較好的修復作用,為臨床修復關(guān)節(jié)軟骨缺損提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

2.3 滇南小耳豬(Diannan small-ear pig)

滇南小耳豬主要分布于云南省,中心產(chǎn)區(qū)為西雙版納州一市兩縣境內(nèi),由長期近親繁殖、選育形成。該豬被毛黑色,少數(shù)有六白特征,成年母豬體重為(49.69±0.27)kg,公豬(48.81±0.61)kg,母豬4月齡、公豬3月齡即可配種,初產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)為8頭,經(jīng)產(chǎn)為9頭左右。西雙版納州種豬場承擔滇南小耳豬的保種工作[11]。

版納微型豬屬于滇南小耳豬。因其生長緩慢體型矮小等獨特形狀,1987年經(jīng)盛志廉教授定名為版納微型豬。該品系成年母豬體重為(43.3±1.0)kg,公豬(36.1±1.1)kg[76-77]。

版納微型豬近交系是1980年由云南農(nóng)業(yè)大學曾養(yǎng)志教授等以云南版納拉祜族寨子中的滇南小耳豬為基礎(chǔ)群,通過全同胞或親子交兩種高度近交方法培育而成。該品系近交程度高,成年豬體重平均為36kg[78-80]。

2.3.1 在代謝系統(tǒng)疾病中的研究

肖國華等[81]采用高脂高糖聯(lián)合低劑量STZ誘導法建立了版納微型豬T2DM模型。喂養(yǎng)12個月后,實驗組小型豬空腹血糖值明顯升高。隨后實驗發(fā)現(xiàn),模型豬骨骼肌纖維普遍萎縮、肌纖維排列紊亂、糖原合成減少,肌肉素(Musclin)蛋白表達水平升高,因此推測肌肉素可能在T2DM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[82]。。

2.3.2 在免疫系統(tǒng)疾病中的研究

2013年,Xin等[83]選用版納微型豬近交系小型豬,采用TALEN技術(shù)成功敲除小型豬GGTA1基因。該模型豬可用于異種器官移植研究。

2.3.3 在其他疾病中的研究

Zhou等[28]采用CRISPR技術(shù)成功敲除版納微型豬的酪氨酸酶(tyrosinase,TRY)雙等位基因,建立了白化病版納微型豬模型。該豬皮膚、毛發(fā)以及眼睛中的黑色素全部消失,表現(xiàn)出典型的白化病特性,是研究人類白化病的發(fā)病機制以及治療辦法的良好模型。

2.4 西藏藏豬(Xizang Tibetan pig)

西藏藏豬主要分布于西藏的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)牧區(qū),是典型的高原豬種。全身被毛為黑灰色或淡黑色,少數(shù)為棕色,12月齡母豬體重為(22.98±0.65)kg,成年公豬(24.52±0.92)kg,4～6月齡性成熟,經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)仔數(shù)為5.75頭。西藏農(nóng)牧學院目前建立了藏豬保種廠[4,11]。

西藏小型豬是2004年由南方醫(yī)科大學顧為望教授等從西藏自治區(qū)林芝市工布江達縣引進的42頭藏豬為基礎(chǔ),進行封閉群管理建立而成,目前已完成風土馴化以及實驗動物化研究。西藏小型豬全身黑色,體型矮小,是目前我國已知小型豬品系中體重最輕的品種。成年母豬體重為(28.06±3.92)kg,公豬(33.31±4.40)kg[84-85]。

2.4.1 在心血管系統(tǒng)疾病中的研究

與其他常見小型豬相比,西藏小型豬冠狀動脈分支較少,是建立心梗模型的理想實驗動物[86]。采用開胸結(jié)扎法[86]及球囊封堵法[87]均可建立西藏小型豬心肌梗死模型,病理切片結(jié)果顯示梗死區(qū)域心肌結(jié)構(gòu)失去完整性并且形成大量瘢痕組織。

陳民利團隊采用高脂誘導和高脂高膽固醇誘導方法建立了藏豬胰島素抵抗AS模型,模型豬主動脈脂質(zhì)沉積和粥樣硬化程度明顯,并伴有胰島素抵抗,可用于研究人類胰島素抵抗和心血管疾病的疾病發(fā)生發(fā)展機制[88-90]。與五指山小型豬相比,在高脂環(huán)境下西藏小型豬的炎癥反應(yīng)程度較高而血脂較低,易形成向心性肥胖,脂肪多沉積在心臟、腎臟組織。研究人員認為西藏小型豬可能適合于研究中心肥胖型胰島素抵抗的心血管疾病[91-92]。

賴良學團隊先后利用ZFN技術(shù)和轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)成功建立糖尿病和心血管病相關(guān)的重要靶點基因PPARγ基因敲除的雜合西藏小型豬模型[93],以及PPARγ過表達轉(zhuǎn)基因西藏小型豬模型[94],該類模型可用于研究PPARγ基因在心血管系統(tǒng)中的功能及其對糖尿病和心血管病的影響,以及開發(fā)靶向PPARγ的新型胰島素激動劑藥物。

2.4.2 在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究

賴良學團隊利用轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)成功培育出世界上首個轉(zhuǎn) httN208-105Q的亨廷頓舞蹈癥(Huntington’s disease,HD)西藏小型豬模型,模型豬腦神經(jīng)元發(fā)生凋亡,出現(xiàn)運動障礙及舞蹈樣運動[95]。隨后該團隊利用相同方法建立了銅/鋅超氧化物歧化酶(copper/zinc superoxide dismutase 1,SOD1)基因突變[96]以及反式激活反應(yīng)-DNA結(jié)合蛋白(TAR DNA-binding protein 43,TDP-43)基因突變的西藏小型豬,模型豬表現(xiàn)出人肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)類似癥狀,如運動神經(jīng)受損和肌肉萎縮等。

2.4.3 在運動系統(tǒng)疾病中的研究

手術(shù)切除西藏小型豬的左膝關(guān)節(jié)外側(cè)半月板并離斷其前交叉韌帶可建立早期膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)動物模型。模型豬術(shù)后四周的組織學檢查結(jié)果最符合KOA軟骨變化,可用于KOA早期MRI診斷以及早期治療研究[97]。

2.4.4 在其他疾病中的研究

2017年,顧為望團隊采用體細胞核移植技術(shù)成功建立了DKK1轉(zhuǎn)基因西藏小型豬,pDKK1轉(zhuǎn)基因在皮膚特異性表達,但并未出現(xiàn)無毛表型[98]。研究人員認為結(jié)果可能與轉(zhuǎn)基因表達量不足以誘導無毛表型或DKK1在豬和小鼠中發(fā)揮不同作用有關(guān)(見表1)。

表1 中國小型豬在多種疾病研究中的應(yīng)用Table 1 Application of Chinese miniature pigs in various diseases

3 展望

中國小型豬資源豐富,不同種群各具特色,可被廣泛應(yīng)用于人類疾病的研究中。目前已建立了涉及心血管疾病、糖尿病、肝病、神經(jīng)退行性疾病、異種移植及免疫缺陷、口腔及骨骼疾病等多個系統(tǒng)的疾病模型,其中心血管疾病及糖尿病模型占較大比例。在已有的中國小型豬品系中,巴馬小型豬的應(yīng)用最為廣泛。但中國小型豬的開發(fā)與實驗動物化及其推廣仍處于初級階段,存在育成品系較少、保護力度不足和發(fā)展阻力較大等問題。并且由于用小型豬建立疾病模型的時間較短,一些模型雖具有表面效度及結(jié)構(gòu)效度但缺乏預測效度,限制了小型豬疾病模型的推廣應(yīng)用及成果轉(zhuǎn)化。

為進一步推動我國在以豬為模式動物的表型和遺傳領(lǐng)域的研究,推動研究成果的轉(zhuǎn)化應(yīng)用,《國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)中長期規(guī)劃(2012-2030)》中明確指出“模式動物表型與遺傳研究國家重大科技基礎(chǔ)設(shè)施”為“十二五”期間優(yōu)先安排內(nèi)容。據(jù)報道,中國農(nóng)業(yè)大學負責豬表型與遺傳研究設(shè)施建設(shè)。該項目總投資7.5914億元,于2019年動工,預計將在2023實現(xiàn)開放共享。該設(shè)施計劃對豬的培育、表型和遺傳分析進行一體化研究,建成世界上首個以豬為模式動物的大型綜合研究設(shè)施,確立我國以豬為模式動物開展生命研究的國際領(lǐng)先地位。由中國農(nóng)業(yè)大學主導的國際模式豬計劃(Pig Model Project,PMP)是該項目的重要內(nèi)容,計劃對豬所有基因進行敲除,建立完整的基因敲除豬表型品系,促進國內(nèi)外合作,實現(xiàn)豬的模式動物化。

總之,通過加大科技投資力度,建立多種技術(shù)平臺,利用基因編輯、體細胞核移植等新興技術(shù)并結(jié)合我國小型豬品系的特點和優(yōu)勢,建立更多符合生物醫(yī)藥研究要求的小型豬新品系及疾病模型,促進資源開放共享與交流合作,將有助于提高小型豬資源的利用價值,為基因功能、人類疾病、異種器官移植研究以及動物遺傳育種提供良好的實驗材料。