人腦膠質(zhì)瘤小型豬原位移植模型的建立及評(píng)估

趙勇武文卿譚鄧旭丁桂榮師長(zhǎng)宏*

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,西安710322;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,北京 100071;3.空軍軍醫(yī)大學(xué)放射醫(yī)學(xué)教研室,西安 710032)

惡性腦膠質(zhì)瘤是成人最常見(jiàn)的侵襲性、原發(fā)性惡性腦腫瘤[1],目前還沒(méi)有確切的治療方法,因其高度侵襲性和腦實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)導(dǎo)致多數(shù)患者死亡[2]。其通常局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng),不向外轉(zhuǎn)移。惡性腦膠質(zhì)瘤占所有原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的近25%,占所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的55%[3-4]。惡性腦膠質(zhì)瘤的治療是一個(gè)世界性難題,其治療效果差的關(guān)鍵問(wèn)題在于惡性的膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞分化不全且深入神經(jīng)細(xì)胞深處,導(dǎo)致手術(shù)不可能全部切除,復(fù)發(fā)率極高[1]。預(yù)后最差的是多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[5],其中位生存時(shí)間為14.6個(gè)月,迫切需要更有效的腫瘤特異性療法[6-7]。建立有效、穩(wěn)定的腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型對(duì)其治療研究具有重要意義[8-9]。通常建立腫瘤移植模型的方法是采用小鼠或者大鼠來(lái)源的細(xì)胞系進(jìn)行原位移植或者選取裸鼠移植人的腫瘤細(xì)胞[10]。前者的鼠源性細(xì)胞系與人體存在很大差別,后者裸鼠體型較小并且生存期短,在建立模型之后進(jìn)行腫瘤干預(yù)性治療窗口期短,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作和飼養(yǎng)要求嚴(yán)格[11]。

既往的研究成果是以大、小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象獲得的,而人體腦組織結(jié)構(gòu)和顱骨厚度與小動(dòng)物相比差異較大,故不能將其效應(yīng)及參數(shù)推及到人[12-13]。小型豬體型適中,與人體較為接近,豬在解剖、組織和生理生化等許多生物學(xué)指標(biāo)上與人類非常相似,被認(rèn)為是研究人類疾病最合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,特別在腫瘤相關(guān)的代謝、影像和治療研究的理想動(dòng)物模型。本研究將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植裸鼠后成瘤,進(jìn)一步將該腫瘤組織原位移植免疫抑制劑處理的小型豬大腦形成膠質(zhì)瘤,建立豬膠質(zhì)瘤異種原位移植模型。核磁檢測(cè)確認(rèn)腫瘤的發(fā)生,處死動(dòng)物解剖后能夠觀察到腦部腫瘤的形成,進(jìn)一步進(jìn)行HE染色和組化分析確認(rèn)腫瘤的組織形態(tài),從而為人膠質(zhì)瘤藥物篩選和影像學(xué)研究提供與人體接近的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3只6～7 周齡SPF級(jí)雄性BALB/c裸鼠,20～22 g,購(gòu)自北京維通利華【SCXK(京)2016-0011】,飼養(yǎng)在空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障設(shè)施內(nèi)【SYXK(陜)2019-001】。。環(huán)境溫度23～25℃,相對(duì)濕度40%,12 h/12 h晝夜交替,飲用水經(jīng)高壓滅菌處理,動(dòng)物自由攝食和飲水。12頭4～5月齡普通巴馬小型豬,雌性,體重15～20 kg。購(gòu)自北京創(chuàng)世紀(jì)小型豬養(yǎng)殖基地【SCXK(京)2018-0011】,飼養(yǎng)在空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心普通設(shè)施內(nèi)【SYXK(陜)2019-001】。本研究通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審核(IACUC-20200602)。

1.1.2 主要試劑與儀器

環(huán)孢霉素軟膠囊(新賽斯平)和他克莫司(普樂(lè)可復(fù))(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院);胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);蘇木精和伊紅(H&E)染色液(北京雷根生物技術(shù)有限公司);人線粒體抗體和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體(美國(guó)abcam公司,貨號(hào):ab92824,ab7260),前者是小鼠單克隆抗體僅與人源化組織標(biāo)本反應(yīng),不與大小鼠反應(yīng),工作液1∶1000稀釋;二抗為生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物科技有限公司);DAB顯色試劑盒、小鼠SP試劑盒(北京中杉金橋生物科技有限公司);人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG(ATCC HTB-14)。

大動(dòng)物腦立體定位儀(瑞沃德68868 N),顱轉(zhuǎn)(瑞沃德78067)和核磁共振(西門子skyra 3.0 T)。

1.2 方法

1.2.1 人膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞培養(yǎng)及移植

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG由本實(shí)驗(yàn)室保存,培養(yǎng)在37℃,5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI-1640加入青霉素(100 IU/mL)/鏈霉素(100μg/mL),收集對(duì)數(shù)期U87-MG腫瘤細(xì)胞,胰酶/EDTA聯(lián)合消化后用PBS重選至2×107備用。收集的U87-MG腫瘤細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)背部皮下。待腫瘤體積長(zhǎng)至500～600 mm3時(shí),CO2安樂(lè)死處死裸鼠,分離U87-MG腫瘤組織并修剪成1 mm3組織塊備用。

1.2.2 小型豬免疫抑制劑處理

術(shù)前3 d選用兩種免疫抑制劑對(duì)小型豬進(jìn)行預(yù)處理,分別為環(huán)孢素軟膠囊(新賽斯平)[14]和他克莫司膠囊(普樂(lè)可復(fù))[15]。聯(lián)合使用劑量分別為環(huán)孢素20 mg/kg;他克莫司0.01 mg/kg。免疫抑制劑給藥方式為口服,將兩種膠囊拌在液體飼料中進(jìn)食。給藥后動(dòng)物出現(xiàn)消瘦等免疫抑制癥狀,但并未出現(xiàn)死亡和并發(fā)癥的發(fā)生。術(shù)后持續(xù)上述藥物劑量連續(xù)用藥21 d。當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)偏頭、顫抖、體重下降大于20%時(shí),提前終止實(shí)驗(yàn),對(duì)動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。

1.2.3 小型豬的麻醉和手術(shù)

麻醉劑選擇丙泊酚注射液,麻醉劑量4 mg/kg,麻醉方式為耳靜脈注射。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。頭部皮膚去毛消毒,在枕骨嵴前顱骨中線上,縱向切開(kāi)4～5 cm的顱骨皮膚。在枕骨嵴前3 cm,距中線1 cm處用1.2 mm顱鉆開(kāi)顱骨孔,硬腦膜用注射器穿透。將修剪備用的裸鼠皮下U87-MG腫瘤組織用套管針將其移入深度為硬腦膜下9～10.5 mm的紋狀體位置。顱骨鉆孔用骨蠟填充,創(chuàng)口消毒后縫合,關(guān)閉皮膚層(手術(shù)過(guò)程如圖1)。術(shù)后持續(xù)觀察動(dòng)物的生存狀況。

圖1 人腦膠質(zhì)瘤組織小型豬原位移植手術(shù)過(guò)程Figure 1 Operative procedure of human glioma orthotopic xenograft in miniature pigs

1.2.4 核磁影像學(xué)檢測(cè)

丙泊酚麻醉實(shí)驗(yàn)豬,西門子skyra 3.0 T磁共振檢測(cè),分別執(zhí)行橫斷面T2W1加權(quán)、矢狀面T2W1加權(quán)、橫斷面T1加權(quán)、彌散序列等成像序列檢測(cè)腫瘤的大小和位置。

1.2.5 HE染色和免疫組織化學(xué)分析

核磁檢測(cè)后,200 mg/mL戊巴比妥心內(nèi)注射處死動(dòng)物并解剖。解剖后分離出小型豬的大腦,依據(jù)影像結(jié)果,肉眼觀察,初步確認(rèn)腫瘤發(fā)生的部位,取該部位組織4%多聚甲醛固定,石蠟包埋制作切片,脫蠟和水化后,HE染色確認(rèn)其膠質(zhì)瘤組織形態(tài)。同時(shí)用非特異性蛋白封閉并消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,一抗分別選擇人線粒體抗體和GFAP在4℃孵育過(guò)夜,加入二抗(羊抗鼠)室溫孵育20 min,DAB顯色后蘇木素復(fù)染,酒精脫水,甲醛透明并中性樹(shù)脂封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 建立人膠質(zhì)瘤裸鼠皮下移植模型

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG,皮下接種裸鼠,3周后腫瘤體積達(dá)到500～600 mm3。裸鼠實(shí)施安樂(lè)死,一部分腫瘤組織用于小型豬原位較重,另一部分腫瘤組織4%多聚甲醛固定后,石蠟包埋切片HE染色確認(rèn)其膠質(zhì)瘤組織形態(tài)。GFAP染色后腫瘤組織強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)確認(rèn)其膠質(zhì)瘤特征,人線粒體特異性抗體強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)確認(rèn)其人源性特征,而正常鼠腦組織表達(dá)為陰性(圖2)。病理組織學(xué)觀察,正常裸鼠腦組織皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);而小鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈多邊形或紡錘形,存在少量的纖維血管間質(zhì)。胞漿嗜酸性,細(xì)胞核圓形或不規(guī)則,有1或2個(gè)核仁。確認(rèn)裸鼠皮下瘤為人源性膠質(zhì)細(xì)胞瘤。

圖2 U87-MG腦膠質(zhì)瘤裸鼠移植瘤組織形態(tài)特征Figure 2 Morphological changes of transplanted tumor of U87-MG glioma in nude mice

2.2 免疫抑制劑處理效果

環(huán)孢素軟膠囊臨床上使用劑量為10～15 mg/(kg·d),兩次給藥,該劑量維持至術(shù)后1～2周。在本研究中,結(jié)合臨床用藥劑量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的表觀,進(jìn)行多個(gè)濃度批次的摸索。在使用高劑量時(shí),先后出現(xiàn)部分動(dòng)物死亡,或表現(xiàn)出腹瀉、體格消瘦、皮膚炎癥等不良反應(yīng),最后確定環(huán)孢素的每次使用濃度為20 mg/kg。環(huán)孢素和他克莫司聯(lián)合使用可以進(jìn)一步限制T細(xì)胞功能,因此聯(lián)合使用環(huán)孢素(20 mg/kg)和他克莫司(0.01 mg/kg),動(dòng)物出現(xiàn)消瘦等癥狀,但并未出現(xiàn)死亡和并發(fā)癥,說(shuō)明該劑量的控制是有效的?；谛g(shù)前和術(shù)后免疫干預(yù),免疫抑制方案從術(shù)前3 d開(kāi)始一直持續(xù)到術(shù)后3周,并伴隨體重的變化及時(shí)調(diào)整用藥量。

2.3 核磁掃描結(jié)果

術(shù)后3周,麻醉小型豬進(jìn)行核磁檢測(cè)。西門子skyra 3.0 T磁共振成像序列檢測(cè)腫瘤的大小和位置(圖3)。累計(jì)共完成12例小型豬腦膠質(zhì)瘤模型手術(shù)制備,有11例通過(guò)核磁檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腦部腫瘤形成,腫瘤大小約15 mm×20 mm。

圖3 U87腫瘤組織移植小型豬3周后腦部核磁掃描結(jié)果(箭頭所指部位為腫瘤病灶)Figure 3 MRI result for 3 weeks transplanted tumor of U87 glioma in miniature pigs(Arrow shows tumor)

2.4 腫瘤組織形態(tài)和特異性標(biāo)志物的表達(dá)

持續(xù)觀察小型豬神經(jīng)行為癥狀,必要時(shí)使用200 mg/mL戊巴比妥心內(nèi)注射處死動(dòng)物并解剖。分離顱內(nèi)腫瘤組織,4%多聚甲醛固定后切片,HE染色結(jié)果顯示為膠質(zhì)瘤特征(圖4)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果如圖5和圖6所示,人線粒體抗體和GFAP在膠質(zhì)瘤發(fā)生部位均表達(dá)陽(yáng)性,而正常的豬腦組織表達(dá)為陰性。

圖4 U87腫瘤組織移植小型豬3周后腦部腫瘤組織形態(tài)Figure 4 Histomorphology of 3 weeks brain tumor of U87 glioma in miniature pigs

圖5 U87腫瘤組織移植小型豬3周后腦部腫瘤組織中GFAP表達(dá)陽(yáng)性Figure 5 IHC result shows GFAP express positive in 3 weeks brain tumor of U87 glioma in miniature pigs

圖6 U87腫瘤組織移植小型豬3周后腦部腫瘤組織中人線粒體表達(dá)陽(yáng)性Figure 6 IHC result shows human mitochondria express positive in 3 weeks brain tumor of U87 glioma in miniature pigs

3 討論

利用小型豬建立腫瘤模型的報(bào)道相對(duì)較少,主要集中在自發(fā)性皮膚黑色素瘤模型[16],不同來(lái)源和遺傳背景的小型豬可自發(fā)皮膚黑色素瘤。但該類模型發(fā)生比率不宜控制、時(shí)間長(zhǎng)、個(gè)體差異大、短期內(nèi)很難獲取大量腫瘤學(xué)資料[17]。在膠質(zhì)瘤研究方面,已報(bào)道的腦膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型多以嚙齒類動(dòng)物為主。但嚙齒類動(dòng)物大腦皮層光滑,無(wú)腦溝和腦回,與人腦解剖結(jié)構(gòu)差異較大,導(dǎo)致大多成功用于小動(dòng)物模型的腫瘤療法在人類身上無(wú)法復(fù)制。豬腦因其解剖學(xué)、組織學(xué)和血管分布于人腦相似,制備小型豬腦膠質(zhì)瘤模型對(duì)開(kāi)展腦膠質(zhì)瘤臨床前應(yīng)用研究具有重要的價(jià)值和意義。建立小型豬異種移植模型,最重要的問(wèn)題是解決豬本身對(duì)人體組織細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng),即必須選擇合適的免疫抑制劑確定相應(yīng)的劑量。環(huán)孢霉素軟膠囊和他克莫司均是臨床常用的免疫抑制劑,多用于器官移植和自身免疫疾病[14,18]。環(huán)孢素軟膠囊主要是通過(guò)選擇性抑制T淋巴細(xì)胞活化而發(fā)揮免疫抑制作用[19]。他克莫司主要通過(guò)抑制IL-2的釋放,全面抑制T淋巴細(xì)胞的作用,從而達(dá)到免疫水平的抑制[20]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)探索,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)他克莫司和環(huán)孢素軟膠囊聯(lián)合用藥進(jìn)行免疫抑制,確定的聯(lián)合劑量用于小型豬并未出現(xiàn)死亡和并發(fā)癥的發(fā)生。體重變化一定程度上反應(yīng)了免疫抑制劑的藥效,聯(lián)合用藥組體重增長(zhǎng)最慢,同時(shí)說(shuō)明該劑量的控制是有效的。

相比于腫瘤細(xì)胞系移植模型,本實(shí)驗(yàn)將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87-MG接種裸鼠,將獲取的荷瘤鼠腫瘤組織原位移植到小型豬腦部紋狀體,不僅可以較好地保留瘤組織的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境,而且有利于腫瘤的生長(zhǎng),有效提高異種移植的成功率。同時(shí),直接移植分散的人體腫瘤細(xì)胞,很容易被豬(免疫抑制劑處理)體內(nèi)殘存的免疫系統(tǒng)-排斥,前期直接移植人U87-MG腫瘤細(xì)胞均未在免疫抑制劑處理的豬建立起腫瘤模型;而移植的腫瘤組織,已經(jīng)形成完整的組織結(jié)構(gòu)且細(xì)胞成分復(fù)雜,豬體內(nèi)的免疫體統(tǒng)很難排斥完整腫瘤組織,從而會(huì)有利于腫瘤的形成,提高腫瘤異種移植的成功率。因此,本研究通過(guò)將人膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植裸鼠,獲得腫瘤組織,進(jìn)一步通過(guò)移植腫瘤組織建立小型豬腦膠質(zhì)瘤原位移植模型,建模成功率達(dá)到90%。

本實(shí)驗(yàn)成功建立了小型豬腦膠質(zhì)瘤模型,能確保術(shù)后小型豬的存活。膠質(zhì)瘤組織塊原位移植到豬腦紋狀體3周時(shí),核磁檢測(cè)確認(rèn)腫瘤發(fā)生率達(dá)到90%以上,處死動(dòng)物解剖后能夠觀察到腦部腫瘤的形成,進(jìn)一步進(jìn)行H&E染色確認(rèn)腫瘤的組織形態(tài);人特異性線粒體表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性確定該移植瘤來(lái)源于人;星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物GFAP表達(dá)呈陽(yáng)性,確認(rèn)了其膠質(zhì)瘤特性?？傊?本實(shí)驗(yàn)獲得的人腦膠質(zhì)瘤小型豬移植模型可為人膠質(zhì)瘤藥物篩選和影像學(xué)研究提供與人體接近的實(shí)驗(yàn)工具。