姜黃素對非酒精性脂肪肝大鼠肝11β-HSD1表達及胰島素抵抗的影響

孫紅爽李鵬霖劉永雙乜春城高玲娜

(哈勵遜國際和平醫(yī)院藥學部,河北 衡水 053000)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是臨床上常見的慢性肝病之一,與2型糖尿病、肥胖、高血壓、高脂血癥等疾病密切相關[1]。NAFLD的發(fā)病機制尚不完全明確,但“二次打擊”理論已被普遍認同,胰島素抵抗、氧化應激、炎癥反應和脂質代謝紊亂在其疾病進展過程中發(fā)揮了重要作用[2]。姜黃素(curcumin)是中藥材姜黃的主要有效單體組分,具有抗炎、抗氧化、調節(jié)血脂、保護肝細胞、抗腫瘤等多種藥理作用[3]。本研究自2019年3月至2020年3月,通過高熱量飼料喂養(yǎng)建立非酒精性脂肪肝大鼠模型,觀察姜黃素對非酒精性脂肪肝大鼠肝11β-羥基類固醇脫氫酶1(11β-hydroxysteroid dehydrogenase,11β-HSD1)表達及胰島素抵抗的影響,為姜黃素治療NAFLD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

36只8周齡清潔級雄性Wistar大鼠,體重180～220 g,由河南實驗動物中心提供【SCXK(豫)2017-0001】,飼養(yǎng)于中國藥科大學藥理教研室【SYXK(蘇)2018-0018】。飼養(yǎng)條件:溫度21～25℃,濕度50%～60%,光照控制保證12 h明、暗條件,自由飲水攝食。適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。本研究經(jīng)哈勵遜國際和平醫(yī)院倫理委員會審核批準(批件號:2018-3-015)。

1.1.2 主要試劑與儀器

姜黃素(Sigma公司,美國);全自動生化分析儀(7600-020,日立公司,日本);兩步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司,日本);11β-HSD1抗體(Santa Cruz公司,美國);實時定量PCR儀(MJ Research公司,美國);Mini-Protean 3電泳槽、半干式轉膜槽、Power PacTM Basic電源(Bio-Rad公司,美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥

36只大鼠隨機分為4組:對照組8只、模型組12只、姜黃素低劑量組(C1組)8只姜黃素高劑量組(C2組)8只。對照組喂給普通飼料,其他3組喂給自制高熱量飼料(配方:22%豬油+8%糖+2%膽固醇+2%食鹽+66%基礎飼料),飲用自來水。8周后,模型組處死4只,確定造模是否成功。造模成功后,C1組、C2組分別灌胃給以姜黃素200 mg/(kg·d)和400 mg/(kg·d)。連續(xù)給藥8周。

1.2.2 胰島素耐量試驗

末次給藥后,進行胰島素耐量試驗,試驗方法參照文獻[4]。

1.2.3 樣本采集及處理

實驗結束時,大鼠禁食12 h,稱體重,麻醉后頸動脈插管取血,3500 r/min離心10 min,分離血清,于-20℃保存待測。取大鼠肝,稱重,計算肝指數(shù)(hepatic index,HI):HI(mg/g)=肝重量(g)/體重(g)×1000。制作肝石蠟切片,蘇木精-伊紅染色法(HE)染色,光學顯微鏡下觀察,參照非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)臨床研究評分系統(tǒng)[5]評分,評分標準參照文獻[6]。

1.2.4 血液指標測定

采用全自動生化分析儀檢測各組血清丙氨酸轉氨酶(alaninne aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、總膽固醇(Totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)及血糖。采用DFM-96型16管放射γ免疫計數(shù)器檢測血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和胰島素。并計算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessmentinsulin resistance,HOMA-IR):HOMA-IR=(空腹胰島素×空腹血糖)/22.5。

1.2.5 肝組織生化指標測定

取新鮮肝組織200 mg,制成10%的組織勻漿,3000 r/min離心15 min,取上清液,測定肝組織TC、TG、FFA及TNF-α含量,檢測方法同血液指標測定。

1.2.6 肝組織11β-HSD1基因表達

11β-HSD1引物上游5’-GCAGAGCGATTTG TTGTT-3’,引物下游5’-TGTCTATGAAGCCGAGGA-3’;β-actin上游5’-CATCACCATGGCAATGAGCGG-3’,下 游5’-TGCGGTCCACGATGGAGGGGCC-3’。PCR反應條件為94℃預變性30 s,然后94℃變性4 min,48℃退火1.5 min,72℃延伸2 min,運行30個循環(huán),最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳,全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進行灰度掃描,計算各組相對灰度。

1.2.7 肝組織11β-HSD1蛋白表達

提取肝組織蛋白進行Western Blot檢測。14.7%分離膠、5%濃縮膠,60 V電泳后轉膜2 h,室溫封閉2 h,以兔抗小鼠11β-HSD1多克隆抗體為一抗(1∶200稀釋)4℃過夜,以羊抗兔IgG-HRP抗體為二抗(1∶800稀釋)室溫作用2 h,ECL檢測。Bandscan軟件對結果進行定量分析,并用自身β-actin灰度值校正。

1.3 統(tǒng)計學分析

結果以平均值±標準差(±s)表示,統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0軟件。多重組間比較采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)及LSD檢驗,P＜0.05表示具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胰島素耐量試驗

與對照組(4.28±0.28)mmol/L比較,模型組基礎血糖值(5.18±0.39)mmol/L顯著升高。腹腔注射胰島素30 min后,對照組、模型組、C1組和C2組血糖分別下降了44.15%、13.53%、28.14%、32.58%。與對照組(11.76±0.70)mmol*h/L比較,模型組AUC值(16.89±1.36)mmol*h/L顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,C1組(14.98±0.88)mmol*h/L和C2組(12.96±0.51)mmol*h/L AUC值均顯著下降(P＜0.01),且C2組下降更明顯(見圖1)。

圖1 胰島素耐量試驗中不同時間點的血糖值和AUC值(±s,n=8)Note.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared with the model group,##P＜0.01.Figure 1 Blood glucose values at different time points and AUC values in Wistar rats(±s,n=8)

2.2 血液生化指標

與對照組比較,模型組大鼠AST、ALT、血糖、血脂、胰島素及炎癥因子TNF-α水平均顯著性升高(P＜0.05);與模型組比較,C1組和C2組以上各項指標均有不同程度的好轉,且C2組變化更為明顯;其中TG只有下降趨勢,無顯著性差異(P＞0.05),其余各項指標均有顯著性差異(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠血液生化指標(±s,n=8)Table 1 Serum parameters of Wistar rats(±s,n=8)

表1 各組大鼠血液生化指標(±s,n=8)Table 1 Serum parameters of Wistar rats(±s,n=8)

注:與對照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。(下表同)Note.Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.Compared with the model group,#P＜0.05,##P＜0.01.(The same in the following table)

血液指標Serum parameters對照組Control group模型組Model group C1組C1 group C2組C2 group血糖(mmol/L)Blood glucose(mmol/L) 4.60±0.21 5.70±0.23** 5.09±0.19**## 4.91±0.26**##胰島素(mIU/L)Insulin(mIU/L) 14.30±1.38 37.93±3.58** 28.17±3.50**## 20.35±2.52**##HOMA-IR 2.92±0.32 9.63±1.16** 6.37±0.84**## 4.43±0.51**##ALT(U/L) 41.38±9.33 70.25±13.04** 63.00±5.71** 48.38±13.32##AST(U/L) 99.88±14.27 189.63±20.50** 167.00±17.07**# 140.38±16.24**##TC(mmol/L) 1.53±0.18 2.10±0.15** 1.87±0.20**# 1.66±0.24##TG(mmol/L) 0.59±0.06 0.68±0.07* 0.65±0.06 0.63±0.05 HDL(mmol/L) 1.04±0.11 0.81±0.11** 0.87±0.07** 0.92±0.10*#FFA(μmol/L) 649.34±57.24 1082.96±55.51** 879.42±62.67**## 767.15±77.98**##TNF-α(fmol/ml) 5.63±1.48 13.16±1.12** 10.92±0.96**## 9.54±1.18**##

2.3 肝指數(shù)和肝生化指標

與對照組比較,模型組大鼠肝指數(shù)明顯增大,出現(xiàn)明顯的肝脂質沉積,且肝TNF-α含量明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,C1組和C2組以上各項指標均顯著下降(P＜0.05),且C2組下降更為明顯(見表2)。

表2 各組大鼠肝生化指標(±s,n=8)Table 2 Hepatic tissue biochemical parameters of Wistar rats(±s,n=8)

表2 各組大鼠肝生化指標(±s,n=8)Table 2 Hepatic tissue biochemical parameters of Wistar rats(±s,n=8)

肝組織指標Hepatic tissue biochemical parameters對照組Control group模型組Model group C1組C1 group C2組C2 group HI(mg/g) 23.12±1.13 25.71±1.08** 24.87±1.26* 23.83±1.95#TC(mmol/gprot) 1.43±0.12 2.11±0.27** 1.89±0.25** 1.56±0.21##TG(mmol/gprot) 4.47±0.31 5.70±0.40** 5.22±0.69** 4.89±0.34*##FFA(umol/gprot) 586.68±52.18 1485.68±141.57** 1047.63±115.82**## 785.53±157.38**##TNF-α(fmol/mgprot) 9.34±1.78 22.54±1.80** 19.13±2.34**# 16.79±2.01**##

2.4 肝組織11β-HSD1基因及蛋白表達

與對照組0.052±0.008、0.102±0.024比較,模型組0.264±0.015、0.477±0.074肝組織11β-HSD1 mRNA及蛋白表達明顯升高(P＜0.01);與模型組比較,C1組0.157±0.013、0.264±0.062和C2組0.091±0.009、0.191±0.021肝組織11β-HSD1 mRNA及蛋白表達均顯著降低(P＜0.05,P＜0.01),且C2組變化更為明顯(見圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織11β-HSD1基因及蛋白表達Note.A.The expression of 11β-HSD1 mRNA in liver.B.Western Blot analysis of 11β-HSD1 in liver.Figure 2 Expression of 11β-HSD1 mRNA and protein in liver of Wistar rats

2.5 肝組織病理學觀察與評分

對照組大鼠肝細胞結構完整,肝小葉清晰,所有動物均未顯示有肝組織病變跡象;模型組8只動物均存不同程度的脂肪變性,7只存在匯管區(qū)炎癥,6只存在輕度或中度肝細胞氣球樣變,4只出現(xiàn)肝纖維化;C1組6只存在輕度脂肪變性,4只出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥,5只存在輕度肝細胞氣球樣變,2只出現(xiàn)肝纖維化;C2組3只存在輕度脂變,2只出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥,2只存在輕度肝細胞氣球樣變(圖3,表3)。

表3 肝組織切片評分結果Table 3 Histopathological assessment of steatosis,lobular inflammation,hepatocyte ballooning,portal inflammation and fibrosis

圖3 大鼠肝病理切片F(xiàn)igure 3 Representative histopathological findings in the liver of Wistar rats

3 討論

NAFLD是代謝綜合征疾病譜中的重要一員,其發(fā)病機制尚未完全闡明,但現(xiàn)已證實其發(fā)病過程與胰島素抵抗密切相關[5]。本研究通過高熱量飼料喂養(yǎng)的方式成功復制了大鼠NAFLD模型,表現(xiàn)為:肝指數(shù)增大、肝功能損傷、血脂紊亂、肝脂質沉積等病理改變,同時胰島素耐量試驗結果及HOMA-IR顯示大鼠處于胰島素抵抗狀態(tài),這也進一步證實了胰島素抵抗在NAFLD發(fā)病機制中的重要作用。截至目前,并沒有針對NAFLD的特效治療藥物,多采用改善飲食結構、運動等行為方式改變,結合降脂藥物、胰島素增敏劑、抗氧化劑、保肝藥物等對癥治療[7-8]。

姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的活性成分,具有廣泛的藥理活性,可用于治療炎癥、糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征、腫瘤等[9]。近年來,文獻報道了關于姜黃素治療非酒精性脂肪肝的實驗研究,但治療效果及作用機制尚不明確。舒泳翔等[10]研究發(fā)現(xiàn),姜黃素干預可改善氧化應激水平,抑制炎癥因子釋放,同時降低肝細胞凋亡水平,從而有效治療高脂飲食所致的大鼠NAFLD。吳鵬波等[11]認為姜黃素可通過上調自噬相關蛋白表達水平,減輕NAFLD大鼠肝組織脂質沉積和炎癥反應。另外,也有學者認為姜黃素是一種天然的11β-HSD1抑制劑,可通過選擇性的抑制11β-HSDl活性,從而有效改善胰島素抵抗和肝脂肪性病變[12-13]。11β-HSD1是一種低親和力、NADPH依賴的微粒體酶,主要在肝、脂肪、骨骼肌和胰腺中表達,在體內可以催化無活性的17-羥-11脫氫皮質酮轉化為有活性的皮質醇,從而調節(jié)內循環(huán)中糖皮質激素水平來發(fā)揮生理效應[14]。11β-HSDl與代謝綜合征、2型糖尿病等密切相關,11β-HSDl基因敲除后可改善動物胰島素抵抗,11β-HSDl抑制劑有類似效果[15-16]。本次研究結果顯示,姜黃素治療對高熱量飼料引起的大鼠NAFLD有顯著改善作用,可以降低肝指數(shù),改善肝功能,降低血脂及肝脂質沉積,減少炎癥因子的釋放,肝組織切片觀察結果與指標檢測結果吻合。模型組大鼠肝組織11β-HSD1基因及蛋白表達量均顯著升高,姜黃素治療可有效抑制肝組織內的11β-HSD1基因和蛋白表達,改善胰島素抵抗,且姜黃素高劑量組以上改善作用更為明顯。

綜上所述,推測姜黃素作為一種選擇性11β-HSD1抑制劑,可有效抑制肝組織內的11β-HSD1基因和蛋白表達,增加胰島素敏感性,進而發(fā)揮對NAFLD的治療作用。