窖蛋白-1在衰老中的作用和信號(hào)通路

侯麗雅李欣悅白琳

(國家衛(wèi)生健康委員會(huì)人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京市人類重大疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型工程技術(shù)研究中心,北京 100021)

衰老是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程,其特征是退化過程的積累,涉及分子途徑內(nèi)的多種變化和破壞,衰老產(chǎn)生機(jī)制包括DNA損傷、活性氧(ROS)累積、分泌表型的變化等,這些過程不僅發(fā)生在細(xì)胞和分子水平,也發(fā)生在組織和器官系統(tǒng)[1]。衰老的本質(zhì)是一種細(xì)胞反應(yīng),表現(xiàn)為細(xì)胞周期停滯、炎性介質(zhì)的分泌以及其他表型改變[1-2]。衰老細(xì)胞隨著年齡的增長(zhǎng)在組織中逐漸積累,并導(dǎo)致衰老和相關(guān)的疾病發(fā)展,例如癌癥、II型糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化等[3]。

胞膜窖作為細(xì)胞膜的重要成分,對(duì)于衰老信號(hào)的應(yīng)激、轉(zhuǎn)導(dǎo)都有重要的作用。研究表明窖蛋白-1在調(diào)節(jié)衰老的過程中發(fā)揮重要作用[4]。目前已有眾多研究表明窖蛋白-1在不同組織器官、不同細(xì)胞系中影響衰老并調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路,然而其對(duì)調(diào)節(jié)衰老的作用和信號(hào)通路各不相同。因此,本文概述了窖蛋白-1的結(jié)構(gòu)和功能,從細(xì)胞、組織、器官和整體水平綜述了窖蛋白-1在衰老中的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制,可能為治療衰老及相關(guān)疾病提供潛在的靶點(diǎn)。

1 窖蛋白-1的結(jié)構(gòu)及功能

胞膜窖(caveolae)又稱小窩,是存在于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面上的瓶頸狀內(nèi)陷,具有特殊的脂筏結(jié)構(gòu),含有豐富的膽固醇、鞘磷脂以及許多跨膜蛋白,與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂質(zhì)調(diào)節(jié)以及內(nèi)吞作用等許多功能有關(guān)[5]。目前已鑒定出3種哺乳動(dòng)物的窖蛋白,分別是窖蛋白-1、窖蛋白-2及窖蛋白-3,它們?cè)诓煌慕M織細(xì)胞中表達(dá)[6]。其中對(duì)窖蛋白-1的結(jié)構(gòu)和功能研究最為廣泛,眾多研究表明其在衰老中發(fā)揮重要作用[7]。

窖蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是胞膜窖的標(biāo)志性支架蛋白,分子量為22×103,在許多細(xì)胞類型中表達(dá),包括脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等[8]。Cav-1在細(xì)胞膜上形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),其蛋白序列包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域:(1)NH2末端結(jié)構(gòu)域;(2)能夠識(shí)別膽固醇并與之相互作用的共有序列(CRAC),以及泛素化位點(diǎn)的支架結(jié)構(gòu)域(CSD;第82-101位殘基);(3)與膜脂質(zhì)相互作用的膜結(jié)構(gòu)域;(4)具有三個(gè)棕櫚?；稽c(diǎn)的COOH-末端結(jié)構(gòu)域[4]。其N端和C端兩個(gè)末端結(jié)構(gòu)域都保留在細(xì)胞質(zhì)中,支架結(jié)構(gòu)域(CSD)序列可結(jié)合許多不同的信號(hào)分子并影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),例如與Src家族蛋白、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體、異源三聚體G蛋白,內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)、蛋白激酶A、蛋白激酶C等相互作用[9]。除此以外,Cav-1在維持胞膜窖的形成和穩(wěn)定性、胞吐和胞吞、平衡膽固醇、脂質(zhì)代謝、線粒體功能、增殖、遷移和衰老等方面也具有重要作用[4,9]。

2 Cav-1在衰老中的作用

Cav-1在調(diào)控衰老的過程中發(fā)揮重要作用。對(duì)Cav-1在動(dòng)物方面的研究包括在小鼠、大鼠、線蟲、蠕蟲等多種動(dòng)物上。動(dòng)物研究表明,老年大鼠的腦、脾、肺[10]、老年小鼠骨骼肌[11]中均顯示出Cav-1的大量增加,表明Cav-1與衰老相關(guān)。Head等[12]還發(fā)現(xiàn)Cav-1敲除(KO)的年輕小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)元過早衰老和退化的跡象。Razani等[13]觀察到Cav-1 KO小鼠在進(jìn)入老年后體重顯著降低,這表明缺乏Cav-1的小鼠可能在神經(jīng)發(fā)育、脂質(zhì)代謝或脂肪細(xì)胞功能方面存在問題;小鼠缺乏Cav-1與多種表型有關(guān),如肺和心臟缺陷、血管異常、動(dòng)脈粥樣硬化、代謝障礙和癌癥[14-15]。與此結(jié)果相反的是,Cav-1表達(dá)減少會(huì)延長(zhǎng)秀麗隱桿線蟲的壽命[16]。用Cav-1 RNAi細(xì)菌處理無菌的CF512蠕蟲,發(fā)現(xiàn)Cav-1的敲除導(dǎo)致壽命延長(zhǎng)[16],這種相反的結(jié)論還沒有找到科學(xué)的解釋。

在細(xì)胞水平,Cav-1在不同細(xì)胞系、衰老細(xì)胞以及過表達(dá)、敲除、敲降細(xì)胞系等方面均有研究。Hayflick等[17]觀察到人類二倍體成纖維細(xì)胞在有限數(shù)量的細(xì)胞分裂后永久停止分裂,在細(xì)胞周期的G1期變得不可逆性停滯。因此對(duì)細(xì)胞衰老的定義為體細(xì)胞不可逆的細(xì)胞周期停滯(大多數(shù)腫瘤細(xì)胞和某些干細(xì)胞除外),并能分泌過多的炎癥介質(zhì)和生長(zhǎng)因子,從而改變衰老細(xì)胞的微環(huán)境[4]。Park等[10]發(fā)現(xiàn)衰老的人二倍體成纖維細(xì)胞中Cav-1表達(dá)上調(diào),并與EGFR共定位。雖然衰老細(xì)胞中的Cav-1水平較高,但通過降低Cav-1的水平可以逆轉(zhuǎn)衰老表型,在衰老細(xì)胞中敲除Cav-1可導(dǎo)致細(xì)胞呈年輕狀態(tài)的形態(tài)變化,導(dǎo)致它們變小和呈紡錘形[18]。Yu等[19]針對(duì)不同細(xì)胞系中Cav-1的表達(dá)進(jìn)行了研究,在A549人肺癌細(xì)胞、H460人肺癌細(xì)胞中、HCT116人結(jié)直腸癌細(xì)胞以及人二倍體成纖維細(xì)胞(HDFs)中敲降Cav-1后,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞系均表現(xiàn)衰老,其細(xì)胞增殖能力和集落形成能力均顯著降低。Cav-1敲降不僅阻止了G1期的細(xì)胞周期,還顯著升高了另外兩個(gè)G1期阻滯標(biāo)記p53和p21的表達(dá)。Yang等[20]同樣表明Cav-1敲降會(huì)誘導(dǎo)人大腸癌細(xì)胞的衰老樣形態(tài)變化,并阻止其在體外和體內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)。此外,早有研究表明Cav-1的過表達(dá)在小鼠成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)物中會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞早衰[21]。因此,Cav-1的過度表達(dá)和強(qiáng)烈抑制都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞過早衰老,而正常的細(xì)胞功能可通過Cav-1表達(dá)的正?；瘉砘謴?fù)。嚴(yán)重的Cav-1缺乏在某些細(xì)胞類型中會(huì)導(dǎo)致早衰,這種效應(yīng)與線粒體功能障礙有關(guān)[19]。Cav-1的過度表達(dá)抑制了包括血管平滑肌細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞的生長(zhǎng),這是進(jìn)入衰老終末狀態(tài)的前奏[20,22]。

在人的大腦皮層中[23]、前列腺平滑肌以及上皮[24]中發(fā)現(xiàn)Cav-1的表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)而升高。Kruglikov等[25]發(fā)現(xiàn)Cav-1的表達(dá)隨著皮膚的老化逐漸上升,并且伴隨著皮膚中透明質(zhì)酸含量下降以及膠原蛋白表達(dá)的減少。Powter等[26]發(fā)現(xiàn)Cav-1還參與血管的衰老表型和炎癥反應(yīng)。這些結(jié)果表明,Cav-1在老年人的多種器官、組織中表達(dá)上調(diào),表明其在衰老中的關(guān)鍵調(diào)控作用。阿爾茨海默病是衰老相關(guān)疾病,阿爾茨海默病患者海馬的Cav-1蛋白水平和額葉皮質(zhì)Cav-1基因水平增加[27]。此外,在Cav-1對(duì)早衰的研究中,Xin等[28]發(fā)現(xiàn)Cav-1通過p53途徑介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞衰老,阻斷Cav-1能夠顯著降低細(xì)胞衰老,為治療腎功能衰竭提供了新的靶點(diǎn)。

3 Cav-1衰老相關(guān)通路

細(xì)胞衰老可能由多種因素引起,氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞衰老的一個(gè)主要原因。氧化應(yīng)激造成的DNA損傷導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯,加速衰老的開始,即為早衰。氧化應(yīng)激與衰老理論表明,衰老細(xì)胞的積累導(dǎo)致衰老相關(guān)的功能喪失。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)衰老的確切機(jī)制仍不清楚,但可能通過增加活性氧(ROS)的水平導(dǎo)致細(xì)胞衰老,可以阻止細(xì)胞增殖以響應(yīng)復(fù)制過程中發(fā)生的損壞[29]。衰老細(xì)胞獲得不可逆的衰老相關(guān)分泌表型,例如導(dǎo)致衰老的p53/p21途徑的調(diào)節(jié)、NF-κB活性增加、叉頭蛋白O(FoxO)蛋白活性的抑制、胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)介導(dǎo)的對(duì)氧化應(yīng)激的保護(hù)、分泌大量炎性因子等[30]。

3.1 Cav-1與p53/p21途徑

p53/p21通路的激活是Cav-1促進(jìn)衰老的關(guān)鍵信號(hào)。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中,Cav-1缺乏通過p53/p21途徑誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[19];在髓核細(xì)胞中,Cav-1同樣通過體外p53/p21信號(hào)通路調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老[30]。

Cav-1過表達(dá)誘導(dǎo)早衰并激活p53途徑,Cav-1通過支架結(jié)構(gòu)域直接與信號(hào)中間體結(jié)合,從而激活p53腫瘤抑制蛋白,p53負(fù)調(diào)控子Mdm2具有Cav-1結(jié)合基序,并被Cav-1隔離胞膜窖中,限制其與p53的相互作用,從而穩(wěn)定p53并使得下游蛋白p21表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和早衰[31]。因此,Cav-1表達(dá)通過p53/p21Waf1/Cip1依賴機(jī)制誘導(dǎo)G0/G1期阻滯而負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程[32]。

共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變激酶(ATM)是應(yīng)激誘導(dǎo)的p53和p53信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[33]。Cav-1在氧化應(yīng)激后通過將蛋白磷酸酶2A(PP2A)的催化亞單元——ATM隔絕到胞膜窖中來激活A(yù)TM,ATM磷酸化并激活p53。PP2A屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶的保守磷酸蛋白磷酸酶家族,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程[34]。PP2A是由催化性C亞基(PP2A-C)、支架A亞基(PP2A-A)和調(diào)節(jié)性B亞基(PP2A-B)組成的全酶。Volonte等[35]的研究表明,吸煙可導(dǎo)致Cav-1的表達(dá)增加,進(jìn)而激活A(yù)TM,激活p53,上調(diào)p21Waf1/Cip1,從而誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞的細(xì)胞衰老,發(fā)展成肺氣腫,較為清晰地闡明了Cav-1/p53/p21誘導(dǎo)衰老的途徑(圖1a)。

此外,研究表明聚合酶I和轉(zhuǎn)錄釋放因子(PTRF)通過Cav-1/p53/p21途徑誘導(dǎo)造血干細(xì)胞衰老[36]。PTRF可作為胞膜窖的外殼蛋白。PTRF通過p53/p21和Cav-1途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老(圖1a),PTRF過表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞衰老,PTRF表達(dá)減少則延長(zhǎng)了細(xì)胞的復(fù)制壽命,Cav-1似乎受PTRF磷酸化的調(diào)節(jié)[37],然而其內(nèi)在確切機(jī)制仍需要進(jìn)一步探究。

Cav-1激活p53/p21途徑并誘導(dǎo)早衰,這是由于其能夠直接與Mdm2、PP2A-C、Sirt1等相互作用,并在氧化應(yīng)激后將其隔離到胞膜窖中[4]。Mdm2是p53的負(fù)調(diào)節(jié)因子,促進(jìn)p53降解。Mdm2在胞膜窖中的隔離導(dǎo)致Mdm2活性的抑制,p53表達(dá)的穩(wěn)定和早衰[31]。PP2A是體內(nèi)自動(dòng)磷酸化和活性的負(fù)調(diào)節(jié)因子。氧化應(yīng)激后,Cav-1介導(dǎo)的PP2A-C在胞膜窖中的定位抑制了PP2A,促進(jìn)p53的ATM依賴性磷酸化/活化,從而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[35]。Sirt1是一種Ⅲ類組蛋白去乙?；?調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程,包括細(xì)胞衰老。氧化應(yīng)激促進(jìn)Sirt1與Cav-1相互作用,使Sirt1失活,進(jìn)而導(dǎo)致p53乙?；?活化和誘導(dǎo)早衰[38]。因此,p53/p21途徑被激活導(dǎo)致細(xì)胞衰老[39]。

p53/p21途徑的激活還可以通過多種機(jī)制發(fā)生。除上述之外還有很多,例如致癌相關(guān)蛋白K-Ras、氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、博萊霉素、高糖、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、胰島素/IGF-1途徑通過Cav-1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)衰老(圖1b)。最近的研究還表明胰島素/IGF-1信號(hào)調(diào)節(jié)窖蛋白可調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲的衰老[40]。最后,由Cav-1激活的黏附斑激酶(FAK)和GTPases促進(jìn)衰老細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)改變。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)上調(diào)Cav-1的表達(dá),并促進(jìn)NADPH氧化酶亞單位p47phox向巨噬細(xì)胞胞膜窖的移位/激活,導(dǎo)致ROS依賴性衰老表型的發(fā)展[41]。

3.2 Cav-1與生長(zhǎng)因子受體

Cav-1與生長(zhǎng)因子受體(如表皮生長(zhǎng)因子和胰島素受體)以及其他信號(hào)分子(如蛋白激酶A、Src激酶等)相互作用,導(dǎo)致這些蛋白質(zhì)的活性大多受到負(fù)調(diào)節(jié)[20,40]。胰島素/PI3K(磷酸肌醇3-激酶)/PKB(蛋白激酶B)(又稱Akt)途徑是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能和過程的主要信號(hào)途徑[42]。FoxO轉(zhuǎn)錄因子是線蟲轉(zhuǎn)錄因子DAF-16(衰變加速因子16)的人類同源物,含有翼螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),受胰島素/PI3K/PKB信號(hào)級(jí)聯(lián)的直接控制。研究表明FoxO通過與Cav-1啟動(dòng)子區(qū)域的直接結(jié)合介導(dǎo)Cav-1對(duì)生長(zhǎng)因子信號(hào)的內(nèi)源性調(diào)節(jié),并且這種調(diào)節(jié)方式與細(xì)胞周期無關(guān)[43]。蛋白激酶B(PKB)磷酸化使得FoxO家族轉(zhuǎn)錄因子失活。當(dāng)激活時(shí),FoxO因子可與Cav-1啟動(dòng)子序列中的DNA結(jié)合,隨后調(diào)節(jié)基因表達(dá);在基因和蛋白質(zhì)水平上過度表達(dá)FoxO因子,Cav-1的表達(dá)增加;激活的Cav-1介導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)的信號(hào)減弱,FoxO對(duì)Cav-1的上調(diào)部分導(dǎo)致EGF誘導(dǎo)的MAPK(絲裂原活化蛋白激酶)磷酸化,從而使得MAPK活性明顯下調(diào)(圖1c)。然而,這種衰老表型可以通過降低Cav-1的表達(dá)水平來逆轉(zhuǎn)[43-44],這表明這種衰老狀態(tài)是可逆的表型。

此外,Cav-1的過表達(dá)可能通過抑制EGF誘導(dǎo)的EGFR介導(dǎo)的Raf/MAP激酶ERK激酶(MEK)/ERK(Raf-MEK-ERK)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20](圖1c)。Cav-1表達(dá)的下調(diào)激活體內(nèi)MEK和ERK的信號(hào),可能是通過提前釋放激活的ERK-1/2和p42/44 MAP激酶的其他成分級(jí)聯(lián)到胞質(zhì)溶膠中[20]。Cav-1過表達(dá)抑制EGF的表達(dá),從而抑制下游EGFR介導(dǎo)的Raf-MEK-ERK信號(hào)通路[14,20]。

3.3 Cav-1與其他信號(hào)分子

Cav-1參與衰老和細(xì)胞周期停滯的基因轉(zhuǎn)錄中存在許多細(xì)胞類型依賴性控制,其調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。最近有文獻(xiàn)表明衰老相關(guān)基因PAI-1調(diào)控Cav-1介導(dǎo)的衰老相關(guān)信號(hào)通路(TGF-β1/Src激酶/p53)的分子機(jī)制,進(jìn)一步闡明Cav-1相關(guān)的衰老通路[22]。除此之外,氧化應(yīng)激可通過p38/MAPK/Sp1介導(dǎo)的兩個(gè)富含GC的啟動(dòng)子元件的激活來刺激Cav-1基因轉(zhuǎn)錄,從而誘導(dǎo)早衰(圖1d),該途徑在表達(dá)Cav-1的正常上皮細(xì)胞中有活性,但在不表達(dá)Cav-1并在氧化應(yīng)激后發(fā)生凋亡的MCF-7乳腺癌細(xì)胞中沒有活性,因此Cav-1可能作為控制氧化應(yīng)激的乳腺癌細(xì)胞中衰老和凋亡細(xì)胞程序的轉(zhuǎn)換者[45]。

衰老細(xì)胞通常會(huì)伴隨著不可逆的衰老相關(guān)分泌表型,例如炎癥因子的釋放。NF-κB是一種驅(qū)動(dòng)衰老的重要轉(zhuǎn)錄因子,在對(duì)炎癥、遺傳毒性和氧化應(yīng)激的反應(yīng)中被激活。高濃度ROS促進(jìn)NF-κB的激活,而NF-κB可以通過上調(diào)Cav-1的表達(dá)介導(dǎo)衰老的信號(hào)通路[46](圖1d)。

圖1 Cav-1介導(dǎo)細(xì)胞衰老的相關(guān)通路Figure 1 Cav-1 related pathways that mediate cell senescence

4 討論

綜上,Cav-1在調(diào)控衰老的過程中發(fā)揮重要作用。對(duì)Cav-1在動(dòng)物水平研究中,大部分研究表明在老年動(dòng)物中Cav-1表達(dá)上調(diào),Cav1過表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)早衰,Cav-1缺乏將導(dǎo)致衰老相關(guān)的多種疾病,然而也有部分研究結(jié)果與之相反,主要集中在線蟲,Cav-1表達(dá)減少會(huì)延長(zhǎng)線蟲的壽命,推測(cè)這可能是由于不同物種間基因表達(dá)差異導(dǎo)致的相反結(jié)論。在人類的多種器官及組織中,Cav-1表達(dá)上調(diào),并伴隨著年齡相關(guān)疾病的發(fā)展,提示Cav-1的研究對(duì)于延緩衰老、治療衰老相關(guān)疾病發(fā)揮潛在作用。研究表明Cav-1是細(xì)胞衰老的主要調(diào)節(jié)因子[4]。其過表達(dá)或抑制均會(huì)產(chǎn)生衰老的相關(guān)表型。關(guān)于Cav-1在細(xì)胞衰老過程中的作用,同樣會(huì)出現(xiàn)一些自相矛盾的觀察,例如,盡管線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致衰老,然而Cav-1缺乏能夠防止活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老[19]。這種悖論出現(xiàn)已久,可能是Cav-1在不同細(xì)胞類型或者不同應(yīng)激或衰老誘導(dǎo)劑中發(fā)揮的作用不同所導(dǎo)致,Yu等[19]的研究與此推測(cè)一致,雖然Cav-1的減少和增加都與早衰有關(guān),大部分研究表明這與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)有關(guān),但Cav-1缺乏是通過一種活性氧非依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,Cav-1缺乏通過激活p53-p21途徑誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,并損害線粒體呼吸,導(dǎo)致SIRT1失活。

Cav-1介導(dǎo)的細(xì)胞衰老通路較為復(fù)雜,目前僅現(xiàn)冰山一角。本文主要介紹了Cav-1調(diào)控衰老的幾條關(guān)鍵通路,如p53/p21途徑、胰島素/PI3K/PKB/FoxO途徑、p38MAPK途徑、NF-κB途徑等。Cav-1介導(dǎo)的細(xì)胞衰老通路仍沒有確切的全部機(jī)制,有一些通路之間的關(guān)聯(lián)及分子機(jī)制尚不明確,因此,對(duì)于Cav-1介導(dǎo)的細(xì)胞衰老相關(guān)通路仍需要進(jìn)一步探究。