糖尿病視網(wǎng)膜病變動(dòng)物模型研究進(jìn)展

王嬌嬌李苗史平玲張貝貝魏圓夢(mèng)王艷歌宋宗明

(河南省人民醫(yī)院,河南省立眼科醫(yī)院,鄭州 450003)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一,是成年人低視力和致盲的主要原因[1-3]。我國(guó)是世界上II型糖尿病患者最多的國(guó)家,成年人糖尿病患病率約為10.9%～11.6%[3-4],其中約27.9%發(fā)展成DR[5]。DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,具體機(jī)制尚不明確[6],研究表明DR病理改變涉及視網(wǎng)膜缺血,異常新生血管,視網(wǎng)膜炎癥,血管滲透性增加[7],神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)異常等諸多表現(xiàn)[8],給DR的臨床診治及研究帶來(lái)不便。受臨床標(biāo)本來(lái)源及倫理學(xué)限制,圍繞DR發(fā)病機(jī)制的臨床研究極難開(kāi)展。DR動(dòng)物模型不僅能幫助人們更加全面地了解DR的病因病機(jī),同時(shí)也能更好地進(jìn)行新型藥物和干預(yù)手段的篩選,更重要的是動(dòng)物模型具有可控性、易得性及預(yù)知性等特點(diǎn),具備了優(yōu)于人體研究的優(yōu)勢(shì)。因此,選擇可靠、可行和適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型是探索DR病因病機(jī)的關(guān)鍵。近年來(lái)隨著DR發(fā)病率及危害性的持續(xù)升高,諸多DR動(dòng)物模型被學(xué)者篩選并建立。其中嚙齒類動(dòng)物以其成本較低,造模時(shí)間短,取材方便,重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)成為建立DR模型的首選。目前,國(guó)際上圍繞DR的動(dòng)物模型主要有藥物誘導(dǎo)型、高脂高糖飲食型和遺傳型動(dòng)物模型。為全面了解DR動(dòng)物模型的優(yōu)劣勢(shì),為實(shí)驗(yàn)研究提供參考,特將當(dāng)前主流DR動(dòng)物模型綜述如下,以資參考。

1 藥物誘導(dǎo)型

DR根據(jù)眼底血管損傷程度分為非增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy,NPDR)和增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)兩類。NPDR以血管迂曲、視網(wǎng)膜出血、微血管瘤和脂質(zhì)滲出為特點(diǎn),當(dāng)出現(xiàn)異常新生血管增殖時(shí)發(fā)展為PDR。DR另一個(gè)重要病理特征為糖尿病黃斑水腫,主要由液體積聚在神經(jīng)視網(wǎng)膜中導(dǎo)致視網(wǎng)膜增厚和黃斑囊樣改變引起[9]。能否較好模擬DR臨床病理特征,是判斷模型成功與否的重要標(biāo)志。藥物誘導(dǎo)模型因建模便捷,病理改變模擬性強(qiáng)等特點(diǎn)是當(dāng)前DR常用動(dòng)物模型。藥物誘導(dǎo)型主要包括鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)及四氧嘧啶誘導(dǎo)(alloxan,AXL)模型。

STZ是誘發(fā)糖尿病最常用的藥物,其藥效機(jī)制主要通過(guò)破壞胰島β細(xì)胞導(dǎo)致高血糖[10-13]。STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠,2～4周出現(xiàn)血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)破壞,4～6周時(shí)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡增加,同時(shí)伴隨視網(wǎng)膜外核層厚度的變薄和神經(jīng)細(xì)胞的減少,緊接著出現(xiàn)感光細(xì)胞的死亡[14]。基底膜的增厚、周細(xì)胞的丟失是DR的基本病理改變,且周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性對(duì)維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的穩(wěn)定性具有十分重要的作用,STZ誘導(dǎo)的糖尿病可出現(xiàn)上述一系列病理改變,成為DR早期病理改變的理想動(dòng)物模型。研究顯示,STZ可誘導(dǎo)兔出現(xiàn)視網(wǎng)膜出血、血管病變、靜脈血栓形成和增殖性視網(wǎng)膜病變,并可誘導(dǎo)猴子出現(xiàn)帶有棉絮斑和高熒光斑的缺血性視網(wǎng)膜病變,STZ可誘導(dǎo)豬的視網(wǎng)膜BRB通透性增加,INL和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)變薄,毛細(xì)血管基底膜增厚[15]。STZ誘導(dǎo)動(dòng)物模型所致DR在病理改變上能夠較好模擬臨床常見(jiàn)DR病理特征,能夠?yàn)镈R發(fā)病機(jī)制研究及治療提供預(yù)測(cè)性,在DR研究中應(yīng)用廣泛。

此外,在STZ誘導(dǎo)DR模型中,由于胰島β細(xì)胞的損傷程度取決于STZ的劑量,因此STZ誘導(dǎo)的糖尿病可能因劑量的不同,成模效果有所差別[16]。唐東紅等[17]使用單次大劑量(60 mg/kg,45 mg/kg)和多次小劑量(30 mg/kg)的STZ靜脈注射恒河猴,結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)猴均出現(xiàn)不同程度的視網(wǎng)膜病,分別顯示早期眼底微血管動(dòng)脈擴(kuò)張、視網(wǎng)膜出血瘤、微血管瘤、新生血管及晚期白內(nèi)障等。但是,單次大劑量注射傾向于造成胰島素依賴性糖尿病,而多次小劑量注射傾向于造成慢性持續(xù)性高血糖癥,后者誘發(fā)的DR模型與人類極為相似,表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞受到損害導(dǎo)致的糖代謝紊亂,損傷視網(wǎng)膜上的微血管,發(fā)生纖曲、變形,甚至破裂,進(jìn)而形成微血管瘤。有文獻(xiàn)表明單次大劑量注射STZ可快速導(dǎo)致大量的胰島β細(xì)胞壞死,而多次小劑量注射可造成部分胰島β細(xì)胞損傷,激發(fā)炎癥反應(yīng),從而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞迅速失活[18]。因此,在實(shí)驗(yàn)研究中需要選擇合適的劑量,既要保證DR的發(fā)生,又要避免胰島素合成和分泌功能的衰竭,且盡量減少STZ對(duì)其它組織的損害。基于當(dāng)前DR模型的病理結(jié)果研究,STZ誘導(dǎo)DR模型以采取小劑量多次誘導(dǎo)方法更為適宜。

AXL和STZ機(jī)理類似,目前AXL廣泛用于小鼠、大鼠、狗、兔子、豬等多種動(dòng)物中誘導(dǎo)DR。大鼠給藥AXL一周內(nèi)出現(xiàn)糖尿病[19],2個(gè)月時(shí)出現(xiàn)光感受器的破壞和間質(zhì)水腫,且視網(wǎng)膜的厚度減小,伴隨脈絡(luò)膜血管數(shù)量減少,內(nèi)皮細(xì)胞和血管壁紊亂[20]。另外,四氧嘧啶可誘發(fā)幼犬糖尿病,每周給藥1次,持續(xù)5周,誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變與人類的DR非常相似。綜合而論,藥物誘導(dǎo)DR動(dòng)物模型能夠不同程度上模擬DR臨床病理改變特征,其中以STZ誘導(dǎo)模型與臨床符合度最高。在實(shí)驗(yàn)研究中,學(xué)者可以根據(jù)對(duì)DR病理改變的研究側(cè)重選擇相應(yīng)動(dòng)物模型。

2 高脂高糖飲食型

高脂高糖飲食誘發(fā)的嚙齒類視覺(jué)疾病動(dòng)物模型已經(jīng)有50年的歷史[21-22]。小鼠在高脂高糖飲食6周時(shí)出現(xiàn)高血糖,15個(gè)月后,觀察到視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞減少,21個(gè)月后,可觀察到微動(dòng)脈瘤和視網(wǎng)膜增厚的病變[15]。而使用高脂高糖飼料喂養(yǎng)大鼠4周后,大鼠的視錐細(xì)胞感光器對(duì)光的敏感度下降[23]。然而,此種模型的缺點(diǎn)是視網(wǎng)膜病變的發(fā)展需要更長(zhǎng)的時(shí)間,發(fā)病較慢,但其優(yōu)點(diǎn)是比其他模型的小鼠活得更久,可以觀察更長(zhǎng)時(shí)間。因此,目前比較常用的是高脂高糖飲食聯(lián)合STZ注射來(lái)誘導(dǎo)的DR模型,通過(guò)高脂高糖飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗之后,再注射低劑量STZ損傷胰島功能,引起血糖的升高,模擬II型糖尿病的發(fā)病過(guò)程[24]。研究表明此種方法可導(dǎo)致視網(wǎng)膜變薄和結(jié)構(gòu)的紊亂,和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)升高[25-26]。因此,單純使用高脂高糖飲食誘導(dǎo)DR動(dòng)物模型常見(jiàn)于對(duì)DR的長(zhǎng)期研究觀察及藥物篩選中,常規(guī)實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用較少。

3 遺傳性動(dòng)物模型

DR成因復(fù)雜,主要觀點(diǎn)認(rèn)為糖尿病病程和血糖控制情況是DR出現(xiàn)的核心誘因,但臨床研究發(fā)現(xiàn)部分患者即使血糖控制良好,糖尿病病程持續(xù)時(shí)間短,也可能短期內(nèi)出現(xiàn)DR。而部分患者血糖控制較差,糖尿病病程持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),但也可能不會(huì)發(fā)展為DR,表明DR的發(fā)生發(fā)展存在異質(zhì)性[26]。且基于人群研究顯示,DR呈現(xiàn)一定的種族發(fā)病特征,表明遺傳因素是DR發(fā)病的重要誘因[27]。為探索DR遺傳病因及機(jī)制,遺傳性DR動(dòng)物模型被大量建立。I型和II型糖尿病誘發(fā)的DR都存在遺傳性動(dòng)物模型,常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型包括小鼠、大鼠和斑馬魚(yú)等。由于嚙齒類動(dòng)物具有簡(jiǎn)便易得、操縱性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)高效等的特點(diǎn),因此嚙齒類動(dòng)物常被用作DR的遺傳模型。

3.1 小鼠遺傳模型

DR的遺傳小鼠模型主要包括Ins2Akita、非肥胖糖尿病(non-obese diabetic,NOD)、db/db(Leprdb)、Kimba和Akimba共5種,它們?cè)谶z傳模式、疾病病因?qū)W、病理學(xué)和疾病進(jìn)展方面各不相同。Ins2Akita小鼠是I型糖尿病的模型,主要是由于胰島素基因Ins2突變,導(dǎo)致胰島素蛋白的構(gòu)象變化,引起的細(xì)胞死亡[28-29]。該模型可表現(xiàn)為血管通透性增加,周細(xì)胞丟失和新生血管的形成[30]。因此,Ins2Akita小鼠較適合于研究DR的早期進(jìn)展和神經(jīng)保護(hù)作用類藥物藥效評(píng)價(jià)[31]。NOD小鼠I型糖尿病的動(dòng)物模型,小鼠在12周齡發(fā)生自發(fā)型高血糖,血糖升高4周后就開(kāi)始出現(xiàn)周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和RGCs凋亡,視網(wǎng)膜毛細(xì)血管基底膜增厚[32],約4個(gè)月可檢測(cè)到大血管收縮和退行性變,微血管異常[33]。db/db(Leprdb)小鼠是美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的自發(fā)型基因突變小鼠,為II型糖尿病的成熟模型,其瘦素受體發(fā)生突變,在4～8周大時(shí),出現(xiàn)肥胖和高血糖,持續(xù)6周后,可觀察到RGCs數(shù)量減少,中央視網(wǎng)膜厚度增加,15個(gè)月后,這些小鼠表現(xiàn)出BRB的嚴(yán)重破壞、周細(xì)胞丟失、RGCs細(xì)胞凋亡、膠質(zhì)細(xì)胞激活[34]。Kimba小鼠是一種增殖性視網(wǎng)膜病變的非糖尿病模型,用純合子Kimba小鼠和Ins2Akita小鼠交配培育出Akimba小鼠,Akimba小鼠的表現(xiàn)兼有Kimba小鼠和Ins2Akita小鼠的特征[35]。主要包括是周細(xì)胞和血管缺失,視網(wǎng)膜新生血管和彌漫性血管滲漏,隨著疾病的進(jìn)展可以觀察到視網(wǎng)膜厚度的減少及視網(wǎng)膜持續(xù)水腫甚至視網(wǎng)膜脫離[36-37]。

3.2 大鼠遺傳模型

DR的遺傳大鼠模型主要包括Zucker大鼠(zucker diabetic fatty,ZDF)、Long-Evans大鼠(otsuka long-evans tokushima fatty,OLETF)、BB 大鼠(biobreeding,BB)、WBN/Kob大鼠、GK大鼠(goto kakizaki,GK)和Torii大鼠(spontaneously diabetic torii,SDT)。ZDF大鼠是一種自發(fā)性II型糖尿病模型大鼠,該模型在3個(gè)月時(shí)出現(xiàn)穩(wěn)定的高血糖,高血糖8個(gè)月后,表現(xiàn)出類似DR的毛細(xì)血管基底膜增厚,毛細(xì)血管核密度增加等病理改變[38]。OLETF大鼠亦是一種自發(fā)性II型糖尿病和肥胖的模型,由于G蛋白偶聯(lián)受體GPR10的起始密碼子發(fā)生突變,導(dǎo)致肥胖[39-40],約在12周可表現(xiàn)為輕度肥胖,直到18周時(shí)才出現(xiàn)高血糖,27周時(shí)可觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層變薄[41]。據(jù)報(bào)道OLETF大鼠的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化以及視網(wǎng)膜電圖的變化與DR患者相似。因此,不同于I型糖尿病小鼠模型和STZ誘導(dǎo)的動(dòng)物模型,OLETF大鼠表現(xiàn)為高血糖、胰島素抵抗和病理特征類似于人類的II型糖尿病[42]。BB大鼠模型被廣泛應(yīng)用于I型糖尿病所致DR的研究,該模型在8～11個(gè)月時(shí)出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變、周細(xì)胞丟失、毛細(xì)血管變性和微動(dòng)脈瘤,以及由于自身免疫反應(yīng)導(dǎo)致的胰腺小細(xì)胞凋亡[43]。WBN/Kob大鼠模型的特點(diǎn)是具有新生血管形成和腔內(nèi)血管透明化的病變,這使其成為了解DR新生血管的理想模型[44]。GK大鼠和SDT大鼠均屬于非肥胖II型糖尿病大鼠模型。52周齡的GK大鼠可表現(xiàn)為脈絡(luò)膜厚度增加,內(nèi)層脈絡(luò)膜血管密度降低,視網(wǎng)膜內(nèi)VEGFR2免疫反應(yīng)性增強(qiáng)等[45]。SDT大鼠的一個(gè)顯著特征是在視盤(pán)周圍出現(xiàn)巨大的視網(wǎng)膜皺襞,并有廣泛的滲漏,類似于在人類中觀察到的視網(wǎng)膜脫離[46]。

3.3 斑馬魚(yú)遺傳模型

除了嚙齒類動(dòng)物,最新研究表明斑馬魚(yú)也是DR的常用模型。Vhl斑馬魚(yú)的von Hippel-Lindau腫瘤抑制基因發(fā)生突變,導(dǎo)致血管形成增加,同時(shí),缺氧誘導(dǎo)因子上調(diào),觸發(fā)VEGF的mRNA高表達(dá),該模型的特點(diǎn)是玻璃樣血管增多并伴有血管滲漏、黃斑水腫、視網(wǎng)膜脫離和嚴(yán)重的新生血管形成[47]。

為系統(tǒng)了解各種DR動(dòng)物模型在模擬病理改變上的特征,特將當(dāng)前主要?jiǎng)游锬Ｐ退憩F(xiàn)的病理改變總結(jié)如下,見(jiàn)表1。

表1 研究DR的動(dòng)物模型Figure 1 Animal model of DR

續(xù)表1

4 展望

動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ),高度還原DR的臨床特征和發(fā)病狀態(tài)的動(dòng)物模型是研究DR的理想對(duì)象。目前圍繞DR的病因及發(fā)病機(jī)制而研發(fā)的動(dòng)物模型不斷增多,一方面顯示了學(xué)術(shù)界對(duì)本病的不斷重視,同時(shí)模型的多樣化也體現(xiàn)了對(duì)DR病因及發(fā)病機(jī)制的研究缺乏明確的結(jié)論,表現(xiàn)出一定的局限性。目前針對(duì)動(dòng)物模型優(yōu)劣的評(píng)價(jià),國(guó)際上多從表面效度、結(jié)構(gòu)效度及預(yù)測(cè)效度三個(gè)維度進(jìn)行評(píng)價(jià)。表面效度,即模型能夠模擬疾病的典型特征;結(jié)構(gòu)效度,即模型要符合一定的理論假說(shuō)且病理生理改變應(yīng)與假說(shuō)或理論相一致;預(yù)測(cè)效度,即模型的藥理學(xué)反映及非藥理學(xué)反應(yīng)與臨床治療表現(xiàn)相一致,并能夠?yàn)檫h(yuǎn)期的治療及發(fā)病機(jī)制研究提供預(yù)測(cè)性[48]?；谠u(píng)價(jià)三維度,結(jié)合模型制備的難易程度及經(jīng)濟(jì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià),當(dāng)前DR主要?jiǎng)游锬Ｐ椭?STZ誘導(dǎo)模型能夠較好模擬DR臨床病理表現(xiàn)及臨床特征,且STZ誘導(dǎo)模型在細(xì)胞因子、膠質(zhì)細(xì)胞增生等發(fā)病機(jī)制上能夠?yàn)镈R發(fā)病機(jī)制研究提供一定的方向預(yù)測(cè),具有一定的預(yù)測(cè)效度,故STZ誘導(dǎo)DR模型為目前較理想動(dòng)物模型,且建模成本低,操作方便。對(duì)于其他藥物誘導(dǎo)DR模型,均能夠模擬DR臨床癥狀及對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制進(jìn)行一定的模擬,均有較好的表面效度及預(yù)測(cè)效度,而在模擬DR臨床病例特征是不能夠較全面與臨床相吻合,結(jié)構(gòu)效度不足。高脂高糖誘導(dǎo)動(dòng)物模型結(jié)構(gòu)效度、預(yù)測(cè)效度較差,且建模時(shí)間長(zhǎng),經(jīng)濟(jì)效益一般,元?dú)馓蕴赡苄暂^大,除非進(jìn)行長(zhǎng)期藥理觀察,目前選擇性較低。對(duì)于基因遺傳模型,其建模目的圍繞模擬疾病遺傳發(fā)病機(jī)制而設(shè)立,本身具有較藥物誘導(dǎo)模型更好的預(yù)測(cè)效度,但在模擬DR病理改變及臨床癥狀時(shí),遺傳模型具有特定針對(duì)性,其結(jié)構(gòu)效度及表面效度弱于藥物誘導(dǎo)DR模型。遺傳型動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)是能夠自發(fā)形成I型或II型糖尿病,減少化學(xué)誘導(dǎo)方法可能帶來(lái)的器官損害,但是該類模型造模成本高,繁殖力低,某些模型只有純合子或者單一性別的鼠才能自發(fā)形成糖尿病,因此增加了動(dòng)物的飼養(yǎng)數(shù)量[49]。

此外,盡管STZ誘導(dǎo)模型具有較好的表面效度、結(jié)構(gòu)效度及預(yù)測(cè)效度,STZ誘導(dǎo)大鼠或小鼠糖尿病是目前比較公認(rèn)的經(jīng)典模型。但有一點(diǎn)需要指出,PDR是以新生血管的形成為主要標(biāo)志的糖尿病微血管并發(fā)癥,如果研究PDR必然涉及到新生血管,而STZ誘導(dǎo)模型出視網(wǎng)膜新生血管非常困難,有研究表明糖尿病大鼠成模3個(gè)月后HE染色顯示視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)水腫,成模6個(gè)月時(shí)視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)不清晰,周圍水腫更加明顯,毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張,但是并未看到明顯的PDR表現(xiàn)[50]。因此,對(duì)于PDR的研究,STZ誘導(dǎo)模型的應(yīng)用受限,在造模劑量、方法上需要繼續(xù)探索。目前,由于糖尿病性新生血管模型建立困難,目前,非糖尿病性氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型已經(jīng)成為研究視網(wǎng)膜新生血管的經(jīng)典模型,被廣泛使用。OIR模型利用了小鼠出生時(shí)只有部分發(fā)育的血管系統(tǒng)和后天對(duì)氧氣濃度的控制可以影響血管行為這一特點(diǎn),用于評(píng)估視網(wǎng)膜新生血管和中央血管閉塞。另外,往兔玻璃體腔內(nèi)注射DL-α-氨基己二酸(DLAAA),可造成持續(xù)性視網(wǎng)膜新生血管,可導(dǎo)致長(zhǎng)達(dá)48周的持續(xù)性血管滲漏[51]。但是這些模型終究不是高血糖引起的視網(wǎng)膜新生血管模型,結(jié)合DR疾病本身的復(fù)雜性,難以開(kāi)發(fā)出一種和人類具有相同的所有的表型和基因型特征的“完美”模型,還沒(méi)有一個(gè)單一的模型能夠顯示出在人類身上看到的DR的所有臨床特征。

目前,已經(jīng)建立的各種動(dòng)物模型各具優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn),都只能模擬人類DR的早期特征,并沒(méi)有一種動(dòng)物模型可以代表人DR的所有特征。因此,在選取DR的動(dòng)物模型時(shí),應(yīng)認(rèn)識(shí)到模型的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì),結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的選擇合適的動(dòng)物模型。未來(lái)仍然需要大量的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)合先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)開(kāi)發(fā)出更加合適的DR模型,探索一種完美模擬DR的動(dòng)物模型已成為本研究領(lǐng)域最大的挑戰(zhàn)。