桃仁紅花煎對(duì)妊娠期糖尿病大鼠及其子代結(jié)局的影響與機(jī)制

張陽(yáng)，李學(xué)春，李莉

長(zhǎng)沙市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，長(zhǎng)沙410006

調(diào)查顯示，我國(guó)妊娠期糖尿病（GDM）發(fā)病率逐年升高［1］。GDM 患者血糖與子代結(jié)局不良相關(guān)，高血糖能夠增加胎兒病死率、新生兒過(guò)度生長(zhǎng)及先天性異常發(fā)生率。因此，對(duì)GDM 患者進(jìn)行血糖控制對(duì)改善子代結(jié)局具有重要意義［2］。胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白2（IGF2BP2）是胰島素樣生長(zhǎng)因子家族成員之一，可通過(guò)IGF 依賴或非依賴發(fā)揮生物學(xué)作用［3］。IGF2BP2 是糖尿病發(fā)生的易感基因，能夠加快胰島β 細(xì)胞損傷，促進(jìn)糖脂代謝紊亂［4］。GDM 的治療以藥物干預(yù)為主，中藥治療GDM 具有較高的安全性。桃仁紅花煎最初記載于《素庵醫(yī)案》，有活血、祛瘀、通經(jīng)舒絡(luò)等作用。桃仁紅花煎治療糖尿病腎病療效較好，其主要通過(guò)抑制Wnt/βcatenin 信號(hào)激活而發(fā)揮作用［5］。但桃仁紅花煎對(duì)GDM 的治療鮮見研究報(bào)道。2020年9月—2021年4月，本研究通過(guò)建立GDM 大鼠模型觀察桃仁紅花煎對(duì)GDM大鼠子代結(jié)局的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 40只SPF級(jí)SD雌性大鼠、80 只SPF 級(jí)SD 雄性大鼠均購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量200～300 g，許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001，濕度為55%，溫度25 ℃，模擬黑白交替無(wú)菌飲食2 周，定時(shí)清洗、消毒鼠籠，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自北京中生瑞泰科技有限公司；桃仁紅花煎組方：桃仁9 g、紅花9 g、川芎 9 g、丹參9 g、香附9 g、延胡索9 g，生地12 g、青皮12 g、當(dāng)歸12 g、赤芍12 g，水煎至每毫升含藥5 g；鹽酸二甲雙胍片購(gòu)自華北制藥股份有限公司；小鼠抗人IGF2BP2 單克隆抗體、核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）抗體均購(gòu)自卡邁舒（上海）生物科技有限公司；HE 試劑盒購(gòu)自西安永屹生物技術(shù)有限公司；FlexiWash 全自動(dòng)蛋白質(zhì)免疫印跡系統(tǒng)夠自環(huán)亞生物科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及GDM 模型構(gòu)建 按照隨機(jī)數(shù)字表法將40只雌性大鼠分為A、B、C、D 組各10只。大鼠動(dòng)情期將雌性與雄性大鼠按1∶2 合籠，次日清晨采用陰道涂片法檢測(cè)雌性大鼠陰道存在精子則確定為妊娠［6］。妊娠第5天，B、C、D 組在尾靜脈注射STZ 混懸液35 mg/kg，72 h 后檢測(cè)空腹血糖（FPG），F(xiàn)PG≥13.5 mmol/L 為GDM 模型制備成功，造模成功大鼠共30只。A組大鼠尾部注射等體積枸櫞酸—磷酸氫二鈉緩沖液。最終四組各有9只大鼠符合實(shí)驗(yàn)。

1.3 藥物干預(yù) C 組于建模后當(dāng)日用桃仁紅花煎10 g/kg灌胃，D組采用二甲雙胍200 mg/kg灌胃，A、B組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，共給藥19 d。

1.4 FPG 及胰島素檢測(cè) 分別于孕前及孕7、19 d采集各組大鼠尾靜脈血1.5 mL，用血糖儀檢測(cè)FPG，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)胰島素。

1.5 胎鼠胚胎存活數(shù)及體質(zhì)量統(tǒng)計(jì) 孕19 d用2%戊巴比妥（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，開腹取出胚胎并分離胚胎，計(jì)算各組胚胎存活數(shù)，稱取胎鼠出生體質(zhì)量。用生理鹽水沖洗胎盤組織，將其放入-80 ℃冰箱中保存待用。

1.6 胎盤組織病理變化觀察 采用HE 染色。胎盤組織經(jīng)石蠟包埋后制5 μm 厚切片，脫蠟10 min后，用95%乙醇水化，用堿性蘇木精染色15 min，PBS 沖洗3 次，蒸餾水清洗，用1%伊紅復(fù)制液染色3 min，PBS 透明，在200倍顯微鏡下觀察胎盤組織病理改變。

1.7 胎盤組織中 IGF2BP2、NF-κB mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用qRT-PCR。將胎盤組織加入0.125%胰蛋白酶裂解，用TRIzol 法提取總RNA，無(wú)核酸酶溶解。按照MicroRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：總RNA 1 μL，5×Reaction Mix 4 μL，10 × Super Script Enzyme Mix 2 μL，加入雙蒸水將體系補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃保存。用qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，上下游引物均為0.5 μL，以β-actin 為內(nèi)參，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)作用3 min，95 ℃作用5 s、58 ℃退火，以上40 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。IGF2BP2上游引物序列5'-AACAGGACTGTCCGTGCTAT-3'，下游引 物 序 列 5'-CTCTGGATAACAGTGATGAT-3'；NF-κB 上游引物序列 5'-CTGAACCAGGGCATACCTGT-3'，下游引物序列5'-GAGAAGTCCATGTCCGCAAT-3'；β-actin 上游引物序列 5'-TCACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物序列5'-CTGGAAGGTGGACACCGAGG-3'。

1.8 胎盤組織IGF2BP2 及NF-κB 蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting 法。取胎盤組織加入胰蛋白裂解液，4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min 后收集上清液，以BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白含量。取蛋白30 μg，與上樣緩沖液混合后，行十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，并于電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素酶膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入IGF2BP2（1∶500）及 NF-κB（1∶500）一抗、GAPDH（1∶1 000），于4 ℃孵育過(guò)夜；用TBST溶液清洗10 min×3次，加入抗兔IgG 二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，用TBST溶液清洗10 min×3次，以ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后置于蛋白電泳系統(tǒng)及凝膠成像儀上成像，使用Image J 軟件處理，以 IGF2BP2、NF-κB 與內(nèi)參 GAPDH 條帶灰度值的比值作為 IGF2BP2、NF-κB 蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間FPG 及胰島素水平比較 見表1。

表1 各組不同時(shí)間FPG及胰島素水平比較（）

表1 各組不同時(shí)間FPG及胰島素水平比較（）

注：與同期A組比較，*P＜0.05；與同期B組比較，#P＜0.05。

胰島素（mIU/L）組別A組B組C組D組孕19 d 12.03±3.84 24.63±3.35*17.20±3.25*#16.93±3.45*#n 9 9 9 9 FPG（mmoL/L）孕前5.41±0.90 5.52±0.81 5.47±0.83 5.50±0.79孕7 d 5.80±1.21 16.33±2.65*14.30±1.51*#13.66±1.47*#孕19 d 6.05±1.10 20.89±3.14*10.25±1.18*#10.69±1.30*#孕前11.24±4.30 11.56±4.22 11.60±4.15 11.33±4.51孕7 d 11.33±3.98 21.28±3.60*19.31±3.02*#18.48±3.22*#

2.2 各組胎鼠胚胎存活數(shù)和體質(zhì)量 見表2。

表2 各組胎鼠胚胎存活數(shù)和體質(zhì)量比較（）

表2 各組胎鼠胚胎存活數(shù)和體質(zhì)量比較（）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05。

組別A組B組C組D組n 9 9 9 9胚胎存活數(shù)（只）18.5±1.2 13.2±2.0*15.5±2.3*#16.4±1.6*#出生體質(zhì)量（g）1.75±0.06 2.15±0.05*1.83±0.04*#1.81±0.05*#

2.3 各組胎盤組織病理變化比較 A 組胎盤組織中纖維、滋養(yǎng)葉及血竇層均結(jié)構(gòu)清晰分明；B 組胎盤組織分層模糊，存在細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞布局紊亂；C 組、D 組胎盤組織分布逐漸清晰，間隙縮小，細(xì)胞整齊。

2.4 各組胎盤組織中 IGF2BP2、NF-κB 表達(dá)比較見表3。

表3 各組胎盤組織中IGF2BP2、NF-κB表達(dá)比較（）

表3 各組胎盤組織中IGF2BP2、NF-κB表達(dá)比較（）

注：與A組比較，*P＜0.05；與B組比較，#P＜0.05。

組別n 9 9 9 9 A組B組C組D組IGF2BP2 mRNA 1.00±0.00 1.89±0.18*1.33±0.14*#1.30±0.09*#蛋白1.33±0.15 3.28±1.05*2.01±0.82*#1.96±0.90*#蛋白0.65±0.04 2.30±0.58*1.57±0.20*#1.49±0.31*#NF-κB mRNA 1.00±0.00 2.16±0.65*1.69±0.28*#1.56±0.33*#

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病的產(chǎn)生與臟腑功能失調(diào)、脾氣虛弱等因素相關(guān)。孕后飲食不節(jié)，血?dú)馐д{(diào)，沖任損傷，脾失健運(yùn)，胎水腫滿等均會(huì)導(dǎo)致GDM［7］。中醫(yī)藥治療糖尿病已有幾千年歷史?！吨T病源候論》認(rèn)為GDM 產(chǎn)生與機(jī)體“胎間水氣，子滿體腫者，脾胃虛弱，臟腑之間有停水”有關(guān)，故應(yīng)采用氣陰雙補(bǔ)、脾腎兼治的治療方法。GDM 與糖尿病的發(fā)病機(jī)制存在一致性，均表現(xiàn)為糖脂代謝紊亂、血糖升高能及機(jī)體胰島素抵抗能力異常［8］。GDM 患者存在胰島β細(xì)胞增生，可損傷胰島素功能，抑制胰島素水平，促使血糖升高［9］。臨床治療GDM 以藥物為主，西醫(yī)降糖藥物主要是二甲雙胍類藥物，但其會(huì)滲透到胎盤，影響胎兒發(fā)育［10］。

桃仁紅花煎由桃仁、紅花、當(dāng)歸、香附、延胡索、赤芍、川芎、丹參、青皮、生地黃十味藥物組成。以桃仁、紅花為君藥，可通絡(luò)行氣、活血化瘀；以延胡索、川芎、丹參等為臣藥滋陰養(yǎng)血［11］。桃仁配伍紅花活血祛瘀效果強(qiáng)，延胡索為辛散溫通藥物，與桃仁合用能夠改善氣滯。川芎行氣，生地養(yǎng)陰，二者配伍調(diào)和陰陽(yáng)。諸藥合用有活血化瘀、行氣之功效。桃仁紅花煎中桃仁、紅花為黃酮類物質(zhì)能夠改善微循環(huán)，發(fā)揮抗炎、改善胰島素抵抗等作用［12］。GDM 大鼠存在高胰島素等癥狀，影響胎鼠的結(jié)局，主要表現(xiàn)為胚胎存活數(shù)減少、胎鼠出生體質(zhì)量增加［13］。高糖能夠增加子代胎鼠糖脂代謝，導(dǎo)致脂肪堆積、幼鼠出生體質(zhì)增加，進(jìn)而降低生存率［14］。研究表示，桃仁抗炎解毒，促進(jìn)子宮內(nèi)殘留組織排出。川芎、紅花能夠通過(guò)促進(jìn)胰島素分泌，分解糖分降低血糖，降低子代胎鼠體質(zhì)量及病死率［15-16］。本研究結(jié)果顯示，C 組及 D 組FPG 及胰島素水平降低，說(shuō)明桃仁紅花煎具有調(diào)節(jié)糖代謝的作用。

IGF2BP2 廣泛存在于人體多個(gè)組織器官中，具有刺激胰島素分泌的作用。研究證實(shí)，IGF2BP2 與糖尿病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，參與胰島β 細(xì)胞功能損傷，增加胰島素抵抗，進(jìn)而促進(jìn)糖脂代謝紊亂［17-18］。在 GDM 中 IGF2BP2 表達(dá)升高，是 GDM 發(fā)生的易感基因。NF-κB 激活能夠促進(jìn)糖尿病發(fā)生發(fā)展。NF-κB 作為原始信號(hào)能夠?qū)е录?xì)胞紊亂及損傷。陳秦莉等［19］研究證實(shí)，GDM 患者外周血中 NF-κB 表達(dá)升高能夠激活大量炎癥介質(zhì)，促進(jìn)胰島素抵抗。本研究結(jié)果表示，桃仁紅花煎能夠通過(guò)抑制IGF2BP2 及NF-κB 表達(dá)而降低GDM 大鼠的血糖。這與林峰等［20］研究結(jié)果相似，但是桃仁紅花煎抑制IGF2BP2及NF-κB表達(dá)的機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

綜上所述，桃仁紅花煎能夠降低GDM 大鼠血糖及胰島素水平，提高其子代胚胎成活率，改善胎盤組織病理，其作用機(jī)制可能與抑制IGF2BP2 及NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究也存在不足，由于時(shí)間及成本影響樣本受限，干預(yù)時(shí)間及干預(yù)次數(shù)還需完善，在今后的研究中可增加更多實(shí)驗(yàn)方法為GDM 的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。