高海拔地區(qū)肺部感染患兒血清維生素A水平變化及其與免疫細(xì)胞的關(guān)系

張軒，侯靜，冶秀蘭，袁馥梅，董允，劉成梅，王兆建，李建華，曹海霞，馬艷艷，

1 青海大學(xué)研究生院，西寧810000；2 青海大學(xué)附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室；3 青海大學(xué)附屬醫(yī)院兒科

肺部感染是兒童常見的感染性疾病之一，雖然相關(guān)臨床醫(yī)學(xué)研究取得了一定的進(jìn)步，但目前仍是導(dǎo)致5 歲以下兒童死亡的主要原因［1］。我國(guó)因肺部感染致死的病例占全世界的7%，死亡絕對(duì)數(shù)占西太平洋地區(qū)的2/3，其中75%的患兒是嬰幼兒，85%的患兒在農(nóng)村和邊遠(yuǎn)地區(qū)［2］。青海高寒、低氧的高海拔氣候特點(diǎn)、飲食習(xí)慣，使兒童肺部感染發(fā)生率較高，病程相對(duì)較長(zhǎng)、癥狀相對(duì)較重［3］。營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)是感染性疾病發(fā)生發(fā)展不可忽視的因素之一。孕期適量增加維生素A（VA）可降低低體質(zhì)量新生兒出生率［4］，也對(duì)維持呼吸道上皮細(xì)胞的完整性，肺組織的發(fā)育、損傷修復(fù)及機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能有重要作用［5］。VA 水平與兒童肺部感染及感染程度相關(guān)［6］，但高海拔地區(qū)患兒血清VA 水平及其與免疫細(xì)胞的關(guān)系報(bào)道較少。因此，本研究對(duì)此做了探討，為高海拔地區(qū)兒童肺部感染的預(yù)防和診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年11月—2020年5月就診于青海大學(xué)附屬醫(yī)院兒科并確診肺部感染的患兒21 例（肺部感染組），男8 例、女13 例，年齡0～14 歲，平均住院時(shí)間10 d。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合肺部感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②年齡0～14 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：貧血、營(yíng)養(yǎng)不良；合并其他呼吸系統(tǒng)疾病、自身免疫病、先天性遺傳代謝??；近3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)激素類藥物、丙種球蛋白及VA、VE制劑；合并心、肝、腎等其他系統(tǒng)嚴(yán)重急慢性疾病。同期選擇門診體檢兒童32例（正常對(duì)照組），男 20 例、女 12 例，年齡 0～14 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：近1個(gè)月內(nèi)未發(fā)生急慢性呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)感染性疾??；年齡 0～14 歲；近 3 個(gè)月內(nèi)未使用 VA、VE制劑。兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。兩組家屬均知情同意，本研究經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（P-SL-20190025）。

1.2 血清VA 檢測(cè) 采用高效液相色譜法。采集兩組空腹肘靜脈血2 mL，置于抗凝管中，室溫避光保存1 h，3 500 r/min 離心10 min（離心半徑為20 cm），取血清置于新的EP 管中，冷藏保存待測(cè)，采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件：XTerraTMRP18色譜柱3.9 mm×150 mm、5 μm，XTerraTMRP18 預(yù)柱3.9 mm×20 mm、5 μm；柱溫30 ℃；流動(dòng)相：甲醇—水90∶8；流速：1 mL/min；于292 nm和325 nm同時(shí)進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)；進(jìn)樣量20 μL。VA 缺乏的診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］：血清VA水平＜0.3 mg/L。

1.3 免疫細(xì)胞檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。采集兩組空腹肘靜脈血1 mL，置于抗凝管中冷藏保存待測(cè)。每個(gè)流式管中加入外周血樣本100 μL，分別加入抗體 CD3（20 μL）、CD4（20 μL）、CD8（5 μL）、CD19（5 μL）、CD16（5 μL）、CD56（5 μL）避光孵育15 min；每管加入紅細(xì)胞裂解液1 mL，混勻室溫避光孵育15 min；925 r/min離心5 min（離心半徑20 cm），棄掉上清液；加入PBS 清洗后用PBS 500 μL 重懸。用流式細(xì)胞儀檢測(cè) CD3+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD3-CD19+B 細(xì)胞、CD3-CD16+CD56+自然殺傷細(xì)胞（NK）百分比，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布用表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman線性相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清VA 水平比較 肺部感染組、正常對(duì)照組血清 VA 水平分別為（0.21 ± 0.07）、（0.34 ±0.06）mg/L，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；肺部感染組、正常對(duì)照組VA 缺乏分別為18 例（85.7%）、7 例（21.9%），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 兩組淋巴細(xì)胞亞群水平比較 兩組CD4+/CD8+、CD3-CD16+CD56+NK 細(xì)胞水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。與正常對(duì)照組比較，肺部感染組 CD4+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞水平低，CD3+T 細(xì)胞、CD3-CD19+B細(xì)胞水平高（P均＜0.05）。見表1。

表1 兩組淋巴細(xì)胞亞群水平比較（）

表1 兩組淋巴細(xì)胞亞群水平比較（）

組別肺部感染組正常對(duì)照組n 21 32 t P CD3+T細(xì)胞（%）62.19±11.74 51.50±14.77-2.787＜0.05 CD4+T細(xì)胞（%）36.46±9.05 48.93±9.42 4.786＜0.05 CD8+T細(xì)胞（%）26.86±11.83 37.35±8.84 3.687＜0.05 CD4+/CD8+1.56±0.61 1.41±0.50-0.987＞0.05 CD3-CD19+B（%）18.73±6.33 11.51±6.14-4.138＜0.05 CD3-CD16+CD56+NK（%）8.04±4.12 8.52±5.91 0.323＞0.05

2.3 肺部感染組血清VA 水平與淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)性 肺部感染組血清VA 水平與CD4+T 呈正相關(guān)（r=0.451，P＜0.05），與CD3+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+/CD8+、CD3-CD19+B 細(xì)胞、CD3-CD16+CD56+NK無(wú)相關(guān)性（r分別為-0.177、0.380、-0.114、-0.200、0.017，P均＞0.05）。

3 討論

肺部感染是兒童的常見病、多發(fā)病，反復(fù)肺部感染可引起多種并發(fā)癥，嚴(yán)重者可影響兒童的生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明，兒童肺部感染高發(fā)可能與兒童免疫調(diào)節(jié)功能發(fā)育不完善、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、環(huán)境污染等有關(guān)［9］。VA 作為促進(jìn)兒童生長(zhǎng)發(fā)育的重要營(yíng)養(yǎng)素，出生后未補(bǔ)充VA 的兒童發(fā)育遲緩風(fēng)險(xiǎn)是服用VA 補(bǔ)充劑兒童的2.402倍［10］。全球普遍存在VA 缺乏，我國(guó)VA 營(yíng)養(yǎng)狀況也不容樂(lè)觀，尤其是農(nóng)村及偏遠(yuǎn)地區(qū)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國(guó)農(nóng)村青少年及兒童VA 缺乏率為24.28%，邊緣缺乏率為18.75%［11］。四川甘孜州高原藏區(qū) 2～3 km 海拔高度 0～6 歲兒童 VA 缺乏率為43.34%［12］。本研究結(jié)果顯示，肺部感染組血清VA水平顯著低于正常對(duì)照組、VA缺乏率高于正常對(duì)照組。這提示VA 水平與兒童肺部感染有一定相關(guān)性，與既往研究［6］結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)，VA能夠性促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞增殖和分化，維持纖毛的正常皮表型和功能，對(duì)正常黏膜免疫功能有重要作用［13］。VA 缺乏會(huì)使呼吸道黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生角化和鱗狀化，使其生物完整性破壞，同時(shí)氣道黏膜產(chǎn)生分泌型IgA 減少，從而影響呼吸道局部防御功能［14］。此外，VA及其代謝產(chǎn)物能夠促進(jìn)肺泡、肺間質(zhì)的發(fā)育，肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白形成，并且在肺損傷修復(fù)中起重要作用［15］。肺部感染患兒急性期VA 消耗增加、視黃醇結(jié)合蛋白合成減少、尿中排泄增加，并且部分肺炎患兒伴有消化道癥狀，VA 攝入及吸收減少，使VA 水平進(jìn)一步降低形成惡性循環(huán)。因此，加強(qiáng)監(jiān)測(cè)肺部感染患兒VA 水平，及時(shí)補(bǔ)充VA有利于疾病恢復(fù)。

T 細(xì)胞免疫是機(jī)體清除病原微生物及體內(nèi)壞死細(xì)胞最有效的防御反應(yīng)。根據(jù)淋巴細(xì)胞表面抗原分子類型，T 淋巴細(xì)胞主要分為 CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞，CD4+T 細(xì)胞能夠通過(guò)分泌 IL-2 活化 Th1、Th2、CTL 及NK，同時(shí)在B 細(xì)胞的增殖活化、輔助體液免疫應(yīng)答中起重要作用［16］。CD8+T 細(xì)胞可以高效、特異性地殺傷病原體的細(xì)胞。CD4+/CD8+是反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)平衡的指標(biāo)［17］。研究發(fā)現(xiàn)，VA能夠增強(qiáng)T 細(xì)胞的增殖、分化、成熟，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞亞群以及促炎和抗炎免疫之間的平衡，同時(shí)可誘導(dǎo)B 細(xì)胞表達(dá)，并調(diào)控由B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫球蛋白產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體體液免疫［18］。肺部感染患兒CD4+T 細(xì)胞水平低于正常兒童，且VA 水平與CD4+T 細(xì)胞呈正相關(guān)，國(guó)內(nèi)研究［19］也證明了這一觀點(diǎn)。但本研究發(fā)現(xiàn)，肺部感染組CD3+T 細(xì)胞、CD3-CD19+B 細(xì)胞比例高于正常對(duì)照組，CD8+T細(xì)胞水平低于正常對(duì)照組，同時(shí)未發(fā)現(xiàn)VA 水平與CD3+T 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞及CD4+/CD8+的相關(guān)性。這與部分平原地區(qū)研究結(jié)果不一致，但目前關(guān)于高海拔地區(qū)VA 水平與兒童免疫功能相關(guān)性的臨床研究較少。以上結(jié)果差異可能與高海拔地區(qū)兒童生活環(huán)境有關(guān)，且本研究樣本量較少，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量或聯(lián)合多中心共同調(diào)查驗(yàn)證。臨床可通過(guò)測(cè)定免疫細(xì)胞水平評(píng)估患兒血清VA 水平，及時(shí)補(bǔ)充VA，提高兒童肺部感染的診斷率及治愈率。

綜上所述，青海地區(qū)肺部感染患兒血清VA 水平降低，這可能是高海拔地區(qū)兒童肺部感染發(fā)生率高的影響因素之一。建議在臨床中加強(qiáng)對(duì)肺部感染患兒血清VA、免疫細(xì)胞水平的監(jiān)測(cè)，為肺部感染患兒的預(yù)防、診斷及治療提供新的思路，提高治愈率。