喉癌組織中ATF4、RPL41表達(dá)變化及意義

要兆旭，彭麗娜，馬海斌

邯鄲市中心醫(yī)院耳鼻喉科，河北邯鄲056000

2018 年全球喉癌的新發(fā)、死亡病例數(shù)約為17.7萬人、9.5 萬人，嚴(yán)重影響公眾生命健康［2］。喉癌早期臨床癥狀隱匿，大多數(shù)患者確診時(shí)處于晚期，錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致患者預(yù)后不理想。提高喉癌早期檢出率對(duì)降低喉癌病死率具有重要意義［3］。轉(zhuǎn)錄激活因子4（ATF4）是線粒體應(yīng)激調(diào)控的重要蛋白，參與氧化應(yīng)激、糖代謝等過程，其異常高表達(dá)與乳腺癌、前列腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［4-5］。核糖體蛋白L41（RPL41）屬于核糖體蛋白家族成員，在蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)翻譯后修飾中起調(diào)節(jié)作用。在宮頸癌和肝內(nèi)膽管癌中RPL41 表達(dá)異常，并且與宮頸癌和肝內(nèi)膽管癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)［6-7］。本研究觀察喉癌組織中ATF4 與RPL4 的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集 2012 年 4 月—2016 年 4 月本院診治的喉癌患者120 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：初診，經(jīng)病理學(xué)檢查確診；臨床病理資料完整；無放化療治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他器官惡性腫瘤；肝腎功能障礙；全身性感染性疾病；喉癌復(fù)發(fā)?；颊吣?9 例，女51例；年齡45～78（63.81 ± 12.49）歲；聲門上型70 例，聲門型50 例；腫瘤組織低分化34 例，中高分化86例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75 例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期81 例，Ⅲ期39 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)?；颊呔炇鹬橥鈺?。

1.2 喉癌組織及其癌旁組織中ATF4、RPL41 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。收集術(shù)中切除的喉癌組織及其癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞3 cm），用中性甲醛固定，乙醇梯度脫水，生物組織包埋機(jī)進(jìn)行石蠟包埋；脫蠟水化，置于37 ℃濕盒，3%H2O2孵育20 min，高壓鍋抗原修復(fù)，封閉液于37 ℃孵育0.5 h；滴加Anti-ATF4抗體或Anti-RPL41抗體（Abcam生物科技有限公司，稀釋比例1∶300），24 h后加二抗（艾美捷科技有限公司，稀釋比例1∶500），37 ℃孵育0.5 h；DAB 法顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明和固定，倒置生物顯微鏡（×400，美國(guó)賽默飛公司），觀察染色結(jié)果。

結(jié)果判定：陽性細(xì)胞百分比≤5%計(jì)0 分，5%＜陽性細(xì)胞百分比＜25%計(jì)1 分，25%≤陽性細(xì)胞百分比＜50%計(jì)2 分，50%≤陽性細(xì)胞百分比＜75%計(jì)3 分，陽性細(xì)胞百分比≥75%計(jì)4 分；染色強(qiáng)度無色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3 分。以上兩項(xiàng)評(píng)分乘積0～4為陰性，5～12為陽性［8］。

1.3 隨訪 以患者出院為起點(diǎn)，采用電話、門診復(fù)查等方式進(jìn)行隨訪，隨訪60 個(gè)月或復(fù)發(fā)、死亡時(shí)隨訪結(jié)束。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，ATF4蛋白與RPL41蛋白表達(dá)的相關(guān)性用Spearman 法進(jìn)行分析，ATF4 蛋白與RPL41 蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系用Kaplan-Meier 法進(jìn)行分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉癌組織及其癌旁組織中ATF4、RPL41 蛋白表達(dá)比較 喉癌組織及其癌旁組織中ATF4 蛋白陽性表達(dá)率分別為 75.83%（91/120）、20.00%（20/120），RPL41 蛋白陽性表達(dá)率分別為 26.67%（32/120）、79.17%（95/120）。與癌旁組織比較，喉癌組織中ATF4蛋白陽性表達(dá)率高，RPL41蛋白陽性表達(dá)率低（P均＜0.05）。

2.2 喉癌組織中ATF4 蛋白與RPL41 蛋白表達(dá)的相關(guān)性 喉癌組織中ATF4 蛋白與RPL41 蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.809，P＜0.05）。

2.3 ATF4、RPL41 蛋白表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系 ATF4蛋白陽性表達(dá)率與喉癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)，RPL41蛋白陽性表達(dá)率與喉癌組織分化程度、TNM分期有關(guān)（P均＜0.05）。見表1。

表1 ATF4、RPL41蛋白陽性表達(dá)率與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系［例（%）］

2.4 喉癌組織中ATF4、RPL41 蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 ATF4 蛋白表達(dá)陽性與陰性的喉癌患者5 年生存率分別為 59.34%（54/91）、79.31%（23/29），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。RPL41 蛋白表達(dá)陽性與陰性的喉癌患者5 年生存率分別為78.13%（25/32）、59.09%（52/88），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

喉癌是多因素、多機(jī)制共同作用的結(jié)果，細(xì)胞異常增殖、轉(zhuǎn)移在喉癌的癌變、惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9-10］。尋找與喉癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的分子靶標(biāo)并用于喉癌的病理特征判斷、改善患者預(yù)后具有重要意義。

研究發(fā)現(xiàn)，ATF4 通過增加谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤血管新生，為腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［11］；且腫瘤細(xì)胞可以借由腫瘤血管進(jìn)行遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移［12-13］。因此在喉癌組織中ATF4 蛋白表達(dá)上調(diào)能夠誘導(dǎo)腫瘤血管新生，使腫瘤細(xì)胞得到更多的營(yíng)養(yǎng)供給，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)大量增殖；同時(shí)部分高轉(zhuǎn)移性的喉癌細(xì)胞能夠以新生腫瘤血管為通道，隨血液循環(huán)進(jìn)入鄰近組織或遠(yuǎn)處組織，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)ATF4 能夠激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［14］。由于E-鈣黏蛋白和膠原蛋白等胞外基質(zhì)蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞間黏附的作用，因此在喉癌組織中ATF4表達(dá)上調(diào)會(huì)抑制胞外基質(zhì)的形成，導(dǎo)致喉癌細(xì)胞之間及其與正常組織細(xì)胞之間的黏著性降低，進(jìn)而腫瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)，更易發(fā)生轉(zhuǎn)移［15］。而喉癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是患者不良預(yù)后的影響因素［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中ATF4蛋白陽性表達(dá)率明顯升高，ATF4蛋白陽性表達(dá)率在高TNM分期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中明顯較高，ATF4蛋白表達(dá)陽性的患者5年生存率低于表達(dá)陰性患者。分析其原因可能是由于ATF4參與腫瘤血管新生和細(xì)胞黏附蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)。

目前腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制主要包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬，其中細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞死亡的主要機(jī)制，細(xì)胞凋亡過程中形成大量凋亡小泡，將腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞器和大分子蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解［17-18］。耿雯等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，RPL41 能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，因此筆者推測(cè)喉癌患者RPL41 蛋白陽性表達(dá)率下降后，其促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡的作用明顯減弱，使得喉癌細(xì)胞可以大量增殖，病灶增大，壓迫患者頭頸部神經(jīng)、血管，最終導(dǎo)致患者死亡。腫瘤分化程度與腫瘤增殖能力密切相關(guān)，低分化的腫瘤細(xì)胞往往具有較強(qiáng)的增殖能力。RPL41能夠抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。由于ERK 信號(hào)通路是細(xì)胞周期進(jìn)程的重要調(diào)節(jié)通路，其下游靶基因中的細(xì)胞周期蛋白D1和細(xì)胞周期蛋白B1 等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白均參與腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)節(jié)，因此推測(cè)喉癌中RPL41 表達(dá)下調(diào)會(huì)促進(jìn)ERK 信號(hào)通路活化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程，使得腫瘤細(xì)胞增殖能力提高。本研究發(fā)現(xiàn)，在喉癌組織中RPL41 蛋白陽性表達(dá)率明顯下降，并且RPL41 蛋白陽性表達(dá)率在高TNM 分期、組織低分化的喉癌患者中明顯降低，其表達(dá)陽性患者預(yù)后優(yōu)于陰性患者。分析其原因可能是由于RPL41參與腫瘤增殖和凋亡的過程。

本研究還發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中ATF4 蛋白表達(dá)與RPL41蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。分析其原因可能是由于ATF4在喉癌中起到促癌基因的作用，而RPL41則起到抑癌基因的作用，二者在喉癌發(fā)生發(fā)展中具有一定拮抗作用。

綜上所述，喉癌組織中ATF4 呈高表達(dá)，而RPL41 呈低表達(dá)，ATF4 表達(dá)與腫瘤 TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)，RPL41 表達(dá)與TNM 分期、分化程度及預(yù)后相關(guān)，二者對(duì)喉癌患者的預(yù)后評(píng)估有一定臨床價(jià)值。