“金花”菌分離鑒定及其對茯茶化學(xué)成分的影響

冉莉莎 劉寶貴 陳崇俊 唐 倩 張 樟 朱洺志,3 傅冬和,3 王坤波,3

1（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室 長沙 410128）

2（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心 長沙 410128）

3（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 長沙 410128）

4（中茶湖南安化第一茶廠有限公司 安化 413500）

核技術(shù)的快速發(fā)展、通訊工具的高度發(fā)達(dá)、以及環(huán)境的惡劣導(dǎo)致人們長期處于輻射狀態(tài)下，輻射使人體產(chǎn)生過量的自由基，自由基引發(fā)一系列直接或間接效應(yīng)損傷機(jī)體，嚴(yán)重危害人類健康［1］。茶葉里含有多種抗氧化活性及清除自由基能力的化合物，包括多酚、黃酮、多糖、糖苷等［2］。茯茶是一類特殊的微生物發(fā)酵茶，發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量“金花”菌，“金花”菌能使茶葉中多酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有更強(qiáng)的抗氧化活性以及清除自由基能力的茶色素類物質(zhì)［3］。歐陽梅等［4］將“金花”菌接種至炒青綠毛茶上，使茶黃素及茶紅素含量提高，清除自由基能力及抗氧化活性增強(qiáng)。許靖逸等［5］研究發(fā)現(xiàn)茶褐素對60Co γ輻射損傷小鼠有一定的防護(hù)作用。

“發(fā)花”是茯茶特有的加工工藝，通過控制一定的溫濕條件，促使“金花”菌生長繁殖并成為優(yōu)勢微生物，最終在茯茶內(nèi)部產(chǎn)生大量金黃色閉囊殼，俗稱“金花”［6］?！敖鸹ā本亩嗌偈桥袛嘬虿杵焚|(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)［7］。但到目前為止，“金花”菌的鑒定主要依靠形態(tài)學(xué)觀察或ITS區(qū)序列比對分析，導(dǎo)致鑒定結(jié)果存在爭議，出現(xiàn)“一菌多名”的現(xiàn)象［8］。彭曉赟等［9］通過形態(tài)觀察將湖南茯磚茶中“金花”菌鑒定為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。胡治遠(yuǎn)等［10］通過形態(tài)觀察將湖南地區(qū)不同茯磚茶樣中的“金花”菌鑒定為冠突散囊菌、謝瓦氏散囊菌（Eurotium chevalieri）、肋狀散囊菌（Eurotium cortiforme）、蠟葉散囊菌（Eurotium herbariorum）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）。根據(jù)最新國際植物命名法規(guī)，散囊菌屬（Eurotium）內(nèi)菌種被移入曲霉屬（Aspergillus）［11］。黃浩等［6］通過形態(tài)觀察與ITS區(qū)序列對比分析將不同茶類中的“金花”菌鑒定為冠突散囊菌。呂嘉櫪等［12］通過ITS區(qū)序列比對分析將陜西茯茶中“金花”菌鑒定為針刺曲霉（Aspergillus spiculosus）、阿 姆 斯 特 丹 曲 霉(Aspergillus amstelodami)、謝瓦曲霉(Aspergillus chevalieri)。最新研究表明，鈣調(diào)蛋白基因（Calmodulin；caM）及RNA聚合酶II基因（RNA polymeraseⅡ；RPB2）可用于曲霉屬（散囊菌屬）真菌的區(qū)分和鑒定［11,13］。王磊等［14］通過多基因系統(tǒng)發(fā)育分析將湖南茯磚茶中分離的“金花”菌鑒定冠突曲霉。

本研究通過形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、ITS區(qū)序列比對分析和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析等多種鑒定手段，對“金花”菌進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。然后將該“金花”菌株接種至滅菌黑毛茶進(jìn)行茯茶散茶快速“發(fā)花”，探究“金花”菌單菌對茯茶化學(xué)物質(zhì)的影響。本研究可為茯茶品質(zhì)形成機(jī)理提供相關(guān)依據(jù)，為“金花”菌的開發(fā)利用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚茶由中茶湖南安化第一茶廠有限公司提供。參照趙仁亮的方法［15］配制察氏培養(yǎng)基（CZ），包括20%察氏培養(yǎng)基（CZ20）、察氏酵母瓊脂培養(yǎng)基（CYA）、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（MEA）和麥芽汁酵母瓊脂培養(yǎng)基（M40Y）。

1.2 儀器與設(shè)備

Scope.A1顯微鏡，德國卡爾·蔡司股份有限公司；掃描電子顯微鏡，JSM-6380LV，日本電子株式會社；UV-2550紫外分光光度計，日本島津。

1.3 方法

“金花”菌分離純化、菌落形態(tài)觀察、基因測序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建參照文獻(xiàn)[14]實(shí)驗方法，引物序列如表1所示。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建采用最大簡約法（Maximum，MP），選擇全部位點(diǎn)構(gòu)建系統(tǒng)樹，自展值（Bootstrap）1000次檢驗。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Table1 Primers used for PCR amplification

茯茶散茶“發(fā)花”參照文獻(xiàn)[6]實(shí)驗方法進(jìn)行，“發(fā)花”茯茶水浸出物含量測定參照（GB/T8305―2013）[16]；茶多酚總量測定參照國標(biāo)（GB/T8313―2018）[17]；可溶性糖總量測定采用蒽酮硫酸法；黃酮總量測定采用三氯化鋁比色法[6]；游離氨基酸總量測定參照（GB/T8314―2013）[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用MEGA-X軟件進(jìn)行多基因進(jìn)化樹的構(gòu)建，利用GraphPad Prism8.0進(jìn)行相關(guān)圖繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離純化及鑒定

2.1.1 不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征

圖1為菌株ACF-1的形態(tài)特征觀察，察氏培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7d（圖1（a）），菌落直徑20～22mm，呈近圓形；菌落中間緊密，有金黃色顆粒狀閉囊殼，菌絲輻射狀淺黃色至白色，干燥粗糙無滲出液，色素擴(kuò)散至基質(zhì)中，背面呈深褐色。37℃培養(yǎng)7d（圖1（f）），菌落直徑2～10mm，有橄欖綠分生孢子頭，菌絲致密無光澤。20%察氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d（圖1（b）），菌落直徑25mm左右，其他形態(tài)與察氏培養(yǎng)基上基本相似。37℃培養(yǎng)7d（圖1（g）），菌落直徑25mm左右，菌落近圓形呈土黃色，未見閉囊殼，表面干燥粗糙無滲出液，色素擴(kuò)散至基質(zhì)中，背面呈深褐色。察氏酵母瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7d（圖1（c）），菌落直徑20～25mm，菌落中央菌絲致密呈土黃色，邊緣淺黃偏白，未見閉囊殼，干燥粗糙無滲出液，色素擴(kuò)散至基質(zhì)。37℃培養(yǎng)7d（圖1（h）），菌落直徑10mm左右；菌落呈黃灰色至黃褐色，中央凹陷，褶皺狀表面粗糙干燥，色素擴(kuò)散至基質(zhì)中，背面呈深褐色。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7d（圖1（d）），菌落直徑25mm左右，菌落呈深黃色未見閉囊殼，表面干燥粗糙無滲出液，未見擴(kuò)散色素。37℃培養(yǎng)7d（圖1（i）），菌落直徑5～10mm，菌落中間呈橙黃至紅，凸起生長，表面干燥粗糙無滲出液，未見擴(kuò)散色素。麥芽汁酵母瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7d（圖1（e）），菌落直徑40～50mm，菌落中心奶黃色邊緣呈白色，菌絲較厚致密且絮狀氣生菌絲，表面干燥粗糙無滲出液，未見擴(kuò)散色素。37℃培養(yǎng)7d（圖1（j）），菌落直徑40～45mm，菌落中央黃褐色，邊緣金黃色。菌絲致密，干燥粗糙無滲出液，未見擴(kuò)散色素。通過菌落形態(tài)特征分析，可初步判斷ACF-1菌株為曲霉屬內(nèi)具有黃色閉囊殼的真菌菌株，但具體形態(tài)與王磊等［14］的研究有一定差異，而趙仁亮、王文濤等［15，23］研究發(fā)現(xiàn)同種不同來源的“金花”菌在形態(tài)特征上可能存在一定差異。

圖1 菌株ACF-1的形態(tài)特征(a)～(e)依次為CZ、CZ20、CYA、MEA及M40Y培養(yǎng)基上的菌落特征(28℃，7d)；(f)～(j)依次為CZ、CZ20、CYA、MEA及M40Y培養(yǎng)基上的菌落特征(37℃，7d)；(k)為子囊果；(l)為發(fā)育中子囊果；(m)為破裂的子囊果；(n)為茯茶上閉囊殼；(o)為分生孢子頭；(p)～(q)為分生孢子頭及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；(r)為閉囊殼及其中子囊；(s)為子囊；(t)～(w)為子囊孢子Fig.1 Morphological characteristics of Aspergillus cristatus strain ACF-1.(a)～(e):colony on CZ,CZ20,CYA,MEA,and M40Y respectively(28°C,7d);(f)～(j)colony on CZ,CZ20,CYA,MEA,and M40Y,respectively(37°C,7d);(k):ascocarp;(l):developing ascocarp;(m):ruptured ascocarp;(n):conidia;(o):cleistothecium in Fu tea;(p)～(q):conidial heads;(r):a cleistothecium with asci(s):asco;(t)～(w):ascospore

2.1.2 光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)特征

ACF-1在光學(xué)顯微鏡下子囊果呈球形或近球形（圖1（k）），存在大量有隔菌絲，大量子囊果纏繞混生于菌絲中（圖1（l））。子囊果里含大量子囊，在生長后期破裂釋放子囊，子囊成熟后釋放子囊孢子（圖1（m））。分生孢子在菌株培養(yǎng)5d左右（培養(yǎng)初期）開始出現(xiàn)，分生孢子頭成熟后呈輻射狀，分生孢子梗光滑且較長（圖1（o）～（p）），分生孢子瓶梗位于頂囊上，頂囊近似球形，孢子小梗單層，分生孢子串生，分生孢子呈橢球形或球形（圖1（q））。根據(jù)光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)特征，這與黃浩［6］的研究結(jié)果吻合，可初步斷定ACF-1菌株為曲霉屬真菌。已有研究表明冠突曲霉與謝瓦氏曲霉、肋狀曲霉形態(tài)特征十分相似，這幾種真菌均能產(chǎn)生黃色的閉囊殼［11］。冠突曲霉與謝瓦氏曲霉的差別僅在于后者子囊孢子凸面光滑，但這可能與冠突曲霉子囊孢子發(fā)育成熟度有關(guān)［9］。

2.1.3 電子顯微結(jié)構(gòu)特征

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ACF-1菌株的子囊果成熟后逐漸破裂（圖1（r）），釋放子囊。子囊近球形，大小10μm左右，每個子囊含有8個子囊孢子（圖1（s））。子囊破裂釋放子囊孢子，子囊孢子大小（4～5）μm×（5～6）μm。子囊孢子雙凸鏡狀，表面粗糙，具有疣狀突起，“赤道”部分有兩道明顯的雞冠狀突起（圖1（t）～（w））。ACF-1菌株的子囊孢子電子顯微鏡結(jié)構(gòu)特征，與前人對冠突曲霉的子囊孢子的描述一致［6］。因此，可初步斷定ACF-1菌株為冠突曲霉。雖然子囊孢子對曲霉屬內(nèi)物種的分類鑒定有一定作用，但真菌形態(tài)特征與環(huán)境有關(guān)，也與發(fā)育成熟度有關(guān)［9］，僅憑形態(tài)特征無法進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，有必要結(jié)合其他手段進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2.1.4 ITS序列比對分析和多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

將ACF-1菌株ITS區(qū)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示該菌ITS區(qū)序列與針刺曲霉、阿姆斯特丹曲霉、謝瓦曲霉具有99%以上同源性。這與呂嘉櫪等［12］研究結(jié)果一致。趙仁亮等［15］研究發(fā)現(xiàn)僅通過形態(tài)學(xué)及ITS區(qū)來鑒定曲霉屬曲霉組內(nèi)物種可能出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。因此ACF-1菌株的ITS區(qū)序列比對結(jié)果只能確定該菌屬于曲霉屬真菌（散囊菌屬），但無法在種水平上進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，需要進(jìn)一步測定其他基因位點(diǎn)，再結(jié)合ITS區(qū)序列比對結(jié)果與形態(tài)特征觀察進(jìn)行鑒定。對ACF-1菌株的β-tubulin、caM、RPB2基因序列進(jìn)行測序分析，然后將ACF-1菌株β-tubulin、caM、RPB2基因序列測序結(jié)果分別與曲霉屬曲霉組內(nèi)（散囊菌屬）標(biāo)準(zhǔn)菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行Clusta W比對，然后將比對結(jié)果合并后構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖2所示。ACF-1菌株與冠突曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株NRRL4222聚為一支，且自展支持率為100%。這與王磊等［14］對湖南茯茶中“金花”菌的多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化結(jié)果一致。

圖2 基于β-tubulin、caM、RPB2基因最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（樹分支上的值為自展支持率）Fig.2 A phylogenetic tree constructed based on the maximum likelihood method of β-tubulin,caM,and RPB2genes(Value on the tree branch is the self-expanding support rate)

因此，綜合菌落形態(tài)特征、光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)特征、掃描顯微結(jié)構(gòu)特征、ITS區(qū)序列比對、以及基于β-tubulin、caM、RPB2基因序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，最終將ACF-1鑒定為冠突曲霉菌。

2.2 散茶“發(fā)花”及其對茯茶主要化學(xué)物質(zhì)的影響

黑毛茶是生產(chǎn)茯茶的原料［15］。本研究首先對黑毛茶進(jìn)行高溫滅菌處理，然后將ACF-1菌株接種到滅菌的黑毛茶作為處理組（ACF-1組），以不接種ACF-1菌株的滅菌黑毛茶作為對照組（CK組），進(jìn)行快速散茶“發(fā)花”實(shí)驗。圖3為兩種不同處理散茶“發(fā)花”茶樣觀察，處理組接種的ACF-1菌僅4d后在滅菌黑毛茶表面大量繁殖，肉眼可見大量金黃色顆粒，達(dá)到散茶“發(fā)花”對金花顆粒數(shù)量的要求（圖3（a））；而對照組的黑毛茶表面未有肉眼可見的微生物生長（圖3（b））。已有研究表明，目前茯茶散茶“發(fā)花”一般需要10d以上［6］，而本研究僅4d即可實(shí)現(xiàn)茯茶散茶“發(fā)花”。因此，本研究實(shí)現(xiàn)了快速散茶“發(fā)花”，從而有助于縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約生產(chǎn)成本。

圖3 散茶“發(fā)花”茶樣：（a）接種ACF-1菌茶樣；（b）未接種ACF-1菌茶樣Fig.3 “flowering”tea samples of loose tea:(a)tea samples inoculated with ACF-1fungus;(b)tea samples not inoculated with ACF-1fungus

為了探究“發(fā)花”對茯茶主要化學(xué)品質(zhì)的影響，將菌株ACF-1菌株接種至黑毛茶進(jìn)行“發(fā)花”處理，在“發(fā)花”結(jié)束后測定主要化學(xué)成分的變化，如圖4所示，與CK組相比，ACF-1組的茶多酚含量下降11.3%。造成這種變化的原因可能是“發(fā)花”過程中冠突曲霉菌分泌出多種氧化酶類將茶多酚轉(zhuǎn)化為茶紅素、茶褐素等色素類物質(zhì)，從而使茶湯橙紅明亮［24］；同時由于濕熱作用等非酶促作用一直在進(jìn)行，使茶多酚發(fā)生異構(gòu)、降解等反應(yīng)，使茶湯口感醇和、減少苦澀滋味［25］。與CK組相比，ACF-1組水浸出物含量增2.55%，游離氨基酸總量下降17.3%，可溶性糖含量下降11.9%，黃酮含量下降了33.8%。這可能是因為冠突曲霉分泌的胞外酶將茶葉中的大分子物質(zhì)分解為多種小分子水溶性物質(zhì)，從而使茶葉水浸出物含量增加。微生物利用氨基酸進(jìn)行生長繁殖，造成氨基酸含量下降。微生物發(fā)酵消耗可溶性糖，同時濕熱條件下糖類物質(zhì)可與氨基酸等發(fā)生反應(yīng)形成香氣等成分，導(dǎo)致可溶性糖含量下降［24］。黃酮可能在濕熱和酶的作用下發(fā)生水解等反應(yīng)；同時咖啡堿也會與黃酮類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成新的絡(luò)合物，改善茶湯的滋味［25］。在散茶“發(fā)花”實(shí)驗中，與CK組相比，ACF-1組的水浸出物含量略微增加，而茶多酚、黃酮、可溶性糖、游離氨基酸含量都不同下降，這與黃浩［6］的研究結(jié)果基本吻合。

圖4 ACF-1菌株散茶“發(fā)花”對黑毛茶主要化學(xué)成分的影響（**p＜0.01，*p＜0.05，與CK組相比）Fig.4 Influence of ACF-1strain artificial loose tea“flowering”on the main chemical components of primary dark tea(**p＜0.01,*p＜0.05,compared with CK group)

3 結(jié)論

本研究從湖南茯磚茶中分離出一株“金花”菌，通過菌落形態(tài)特征、光學(xué)顯微結(jié)構(gòu)特征、掃描顯微結(jié)構(gòu)特征、ITS區(qū)序列比對、以及基于βtubulin、CaM、RPB2基因序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，最終將該“金花”菌鑒定為冠突曲霉菌。采用該冠突曲霉菌進(jìn)行茯茶散茶“發(fā)花”，實(shí)現(xiàn)了茯茶散茶快速“發(fā)花”；并發(fā)現(xiàn)冠突曲霉菌“發(fā)花”使茶葉水浸出物含量上升，茶多酚、可溶性糖、黃酮、游離氨基酸總量下降。本研究可為茯茶品質(zhì)形成機(jī)理提供相關(guān)依據(jù)，為“金花”菌的開發(fā)利用提供指導(dǎo)。