基于海綿共附生放線菌的抗結(jié)核活性物質(zhì)篩選

王亞月，褚亞東，吳佩春，曹旭鵬，薛松，馬郁芳

(1.商丘師范學(xué)院 生物與食品學(xué)院，河南 商丘 476000；2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所 生物技術(shù)部，遼寧 大連 116023；3.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024;4.大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044)

結(jié)核病(Tuberculous，TB)是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，被認(rèn)為是世界上最大的威脅之一[1,2].WHO報(bào)道，2015 年全世界有1040萬人患有結(jié)核病，180萬人死于該病(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/zh/).同時(shí)由于治療不當(dāng)，不適當(dāng)或錯(cuò)誤使用抗結(jié)核病藥物，或使用劣質(zhì)藥物導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對(duì)抗結(jié)核藥的耐藥性不斷增長[3].例如耐多藥結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核，前者它是由至少對(duì)異煙肼(isoniazid)和利福平(rifampicin)這兩種最為有效的一線(或標(biāo)準(zhǔn))抗結(jié)核藥物沒有反應(yīng)的細(xì)菌引起的.后者是由對(duì)異煙肼和利福平以及任何氟喹諾酮(fluoroquinolone)和任何二線抗結(jié)核病注射藥物硫酸卷曲霉素(capreomycin sulfate)、卡那霉素(kanamycin)或阿米卡星(amikacin)具有耐藥性的病原體引起的一種結(jié)核病形式.2015年，結(jié)核病患者中近5%患耐多藥結(jié)核病[4].然而，現(xiàn)有抗結(jié)核藥物對(duì)耐多藥結(jié)核病患者的有效性甚低，治愈率僅為40%-70%.因此，更安全、高效的抗結(jié)核生物藥物的開發(fā)成為當(dāng)前的迫切需求，而多年的新藥開發(fā)歷程表明，海洋因其生境與陸地差異較大，成為了重要的新結(jié)構(gòu)化合物的來源，而其中貢獻(xiàn)位于首位的是最低等的多細(xì)胞濾食動(dòng)物——海綿[5,6].

自上世紀(jì)60年代開始，海綿一直是海洋新結(jié)構(gòu)化合物最大來源，根據(jù)Nature Product Reports的統(tǒng)計(jì)，貢獻(xiàn)了約1/3的海洋來源新結(jié)構(gòu)化合物，而其多樣的新結(jié)構(gòu)化合物的產(chǎn)生，據(jù)推測(cè)很大一部分來自其相關(guān)微生物(共生、附生).在這些微生物中放線菌占據(jù)了重要地位[5,7,8].因此，如果能夠有效地對(duì)海綿相關(guān)放線菌進(jìn)行探索，將有可能再尋找到新的抗結(jié)核藥物或前體化合物.

本研究正是基于這一思路，以涵蓋黃渤海、南海和南極地區(qū)海綿的2000余株海綿相關(guān)放線菌資源庫為出發(fā)點(diǎn)，建立安全、高通量的篩選技術(shù)，通過對(duì)其中近500株放線菌進(jìn)行活性評(píng)估，確定這一資源庫在開發(fā)新型拮抗結(jié)核藥物方面的優(yōu)勢(shì)和價(jià)值.篩選高活性組分，為開發(fā)抗結(jié)核藥奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試放線菌菌株由本實(shí)驗(yàn)分離自大連黃渤海、南海和南極的海綿樣品，保存于國家海洋局海洋藥源生物種質(zhì)資源庫.放線菌菌株及代謝物抗結(jié)核活性表型篩選模式菌恥垢分枝桿菌(Myobacterium smegmatis str.mc2155)菌株惠贈(zèng)于美國科羅拉多州立大學(xué)微生物系分枝桿菌研究室.

1.1.2 培養(yǎng)基

恥垢分枝桿菌培養(yǎng)基(LBT)：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L,10% 吐溫80：5 mL/L，調(diào)整pH值為7.0.

放線菌培養(yǎng)基(ISP-2):麥芽浸粉 10 g/L，酵母粉 4 g/L，葡萄糖 4 g/L，調(diào)整pH值為7.2.每個(gè)試管中加入5 mL，滅菌備用；配置ISP-2固體培養(yǎng)基，滅菌后稍涼至60 ℃左右，倒入無菌培養(yǎng)皿中(約30 mL)，制成固體平板備用.

1.1.3 試劑與儀器

刃天青(阿拉丁)，DMSO(SIGMA)，LA Taq酶(TaKaRa)，DL2000 DNA Marker(TaKaRa)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純.16s rDNA的引物對(duì)：8f:5＇-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3＇，1492r:5＇-CGG CTA CCT TGT TAC GAC-3＇，由Takara公司合成.高壓蒸汽滅菌器，培養(yǎng)箱，搖床，一次性96孔板，熒光分光光度計(jì)(Agilent Cary Eclipse)，GeneQuant Pro(Bio-Rad)PCR 儀(GeneAmp 2700，AB).

1.2 方法

1.2.1 恥垢分枝桿菌(Msm)培養(yǎng)

將在LB固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)2 d的Msm挑取單菌落接種于裝有5 mL LBT培養(yǎng)基的20 mL試管內(nèi)，置于37 ℃搖床(220 r/min)中培養(yǎng)約24 h；測(cè)定Msm在600 nm處的吸光度(OD600)，當(dāng)其OD600范圍在0.7～1.0之間，計(jì)算要使用的Msm菌液體積為7/OD(μL)；將計(jì)算好的Msm菌液加入25 mL LBT培養(yǎng)基內(nèi)吹打均勻配成Msm菌工作液，并涂板計(jì)數(shù)其濃度為2×105CFU·mL-1.

1.2.2 放線菌培養(yǎng)

菌種復(fù)蘇是選取-20 ℃冰箱(或-70 ℃超低溫冰箱)保存的菌株，室溫融化，無菌條件下取一環(huán)菌懸液，在平板上劃線復(fù)蘇菌株，放置28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d.期間，每天觀察菌落大小變化，及時(shí)從固體培養(yǎng)基上挑出一環(huán)單菌落接種于含5 mL/15 mL ISP-2培養(yǎng)基的試管中，置于30 ℃搖床(220 r/min)培養(yǎng)3～5 d.擴(kuò)大培養(yǎng)為是試管中培養(yǎng)的放線菌取1 mL接種于裝有150 mL ISP-2培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于30 ℃搖床(220 r/min)培養(yǎng)7 d，每種菌接種10瓶.

1.2.3 抗Msm菌的放線菌菌株活性篩選樣品處理

EF1樣品是將菌液6500 r/min(9916 g)離心，收集菌體，按菌體濕重∶水∶丙酮=1∶2∶2萃取24 h，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥后制得.EF2樣品是將菌液6500 r/min(9916 g)離心，收集上清液，按上清液∶乙酸乙酯=1∶4萃取24 h后，由分液漏斗留下乙酸乙酯相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥后制得.不同濃度梯度樣品制備是于96孔板上設(shè)置樣品梯度孔即每孔加入50 μL LBT，第一孔加入50 μL 樣品(EF1或EF2樣品)吹打均勻，并向下一孔等比稀釋到所需孔數(shù).由于EF1樣品在水溶液中的溶解度高于EF2溶解度，故對(duì)于兩種來源的工作液，設(shè)置不同的測(cè)試濃度梯度(見表1).

1.2.4 確定刃天青顯色法最佳試驗(yàn)條件

活細(xì)胞中的乳酸脫氫酶能將刃天青 (藍(lán)色)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)試鹵靈(粉紅色)，產(chǎn)生熒光信號(hào).試鹵靈會(huì)繼續(xù)被細(xì)胞還原為無熒光的物質(zhì)二氫試鹵靈(白色)，使熒光信號(hào)下降，無活性的或死亡的細(xì)胞喪失了代謝能力而不能還原刃天青，也就不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，所以該法能特異性檢測(cè)活性細(xì)胞(McMillian,M.K.，2002).通過其顏色變化判定藥物MIC值.稱取90.2 mg亞硫酸鈉加入到2 mL去離子水中，加入刃天青顯色劑10 μL(1 mg/mL)，待溶液變?yōu)榉凵?/10稀釋后用安捷倫熒光分光光度計(jì)測(cè)定最佳發(fā)射波長和測(cè)量波長。

1.2.5 DMSO對(duì)Msm菌生長的影響

在LBT中加入終濃度為0.0015%～2%(v/v)DMSO，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)Msm 24 h，每孔加入20 μL 刃天青工作液，再放回37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)5 h，于熒光分光光度計(jì)測(cè)定，激發(fā)波長573 nm，檢測(cè)波長586 nm，檢測(cè)DMSO濃度對(duì)Msm生長的影響，當(dāng) DMSO 濃度為2%時(shí)，Msm菌的存活率仍在80%以上.因此在篩選抗Msm菌活性菌株時(shí)，確定2% DMSO為起始濃度濃度進(jìn)行等比稀釋.

1.2.6 抗Msm菌活性測(cè)定

利用孔板等比稀釋法測(cè)定樣品Msm活性，并分為初篩、精篩、高活比較三級(jí)測(cè)定.如表1，于96孔板上另設(shè)置空白孔4個(gè)；陰性對(duì)照孔6個(gè)；觀察孔2個(gè)；陽性梯度孔初篩、精篩12個(gè)，高活比較16個(gè)；樣品梯度孔初篩6個(gè)，精篩12個(gè)，高活比較16個(gè).空白孔為100 μL LBT培養(yǎng)基，陰性對(duì)照孔為 50 μL LBT培養(yǎng)基+50 μL Msm菌工作液，觀察孔為 50 μL LBT培養(yǎng)基+50 μL Msm菌工作液+20μL 刃天青工作液；陽性梯度每孔加入50 μL LBT，初篩，精篩第一孔加入50 μL氨芐青霉素(Amp)工作液，高活比較第一孔加入50 μL乙胺丁醇(ethambutol，EB)工作液，吹打均勻并向后等比稀釋，最后每孔加入50 μL Msm菌工作液；樣品梯度孔每孔加入50 μL LBT，第一孔加入50 μL樣品液吹打均勻并向后等比稀釋中最后加入50 μL Msm菌工作液.96孔板封口膜封邊后至于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h.培養(yǎng)20 h后觀察96孔板內(nèi)觀察孔，當(dāng)觀察孔為紫紅色時(shí)將96孔板內(nèi)除觀察孔外其余孔每孔加入20 μL 刃天青工作液，再放回37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)5 h，于熒光分光光度計(jì)測(cè)定，激發(fā)波長573 nm，檢測(cè)波長586 nm.在測(cè)定后發(fā)現(xiàn)有跳孔或有染菌嫌疑的樣品孔，需要重新培養(yǎng)測(cè)定.以測(cè)得的熒光值發(fā)生跳變的孔前一孔的樣品濃度作為此樣品的MIC值.考慮到EF1與EF2樣品的處理方式不同，故按不同抑制濃度，對(duì)樣品抗Msm活性進(jìn)行分級(jí).對(duì)EF1樣品，將MIC在1250～5000，156.3～625.0，19.5～78.1,2.4～9.8 μg/mL范圍內(nèi)的樣品被認(rèn)為分別具有低，中，高，強(qiáng)的抗Msm活性.對(duì)EF2樣品，將抑制濃度在250.0～1000.0，15.6～125.0，1.8～7.8，0.1～1.0 μg/mL范圍內(nèi)的樣品被認(rèn)為分別具有低，中，高，強(qiáng)的抗Msm菌活性.

表1 EF1與EF2樣品與陽性對(duì)照藥物的濃度梯度設(shè)置Table 1 The concentration gradient table of positive control drugs，EF1 and EF2 samples

續(xù)表1

1.2.7 EF1與EF2組分薄層層析(TLC)分離

將萃取獲得的EF1與EF2組分，EF1用丙酮和水(1∶1)溶解，EF2用二氯甲烷和甲醇(1∶1)溶解，通過TLC板，將兩組分內(nèi)各物質(zhì)進(jìn)行分離.EF1組分展開劑為二氯甲烷、甲醇和冰醋酸(比例為2∶1∶0.1)；EF1組分展開劑為石油謎、乙酸乙酯和冰醋酸(比例為10∶3∶0.1).顯色劑為茴香醛、硫酸、冰乙酸和甲醇(比例為1∶10∶20∶170).

1.2.8 16S rDNA 序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析

用PCR擴(kuò)增16S rDNA的引物與擴(kuò)增條件同文獻(xiàn)[9].所測(cè)得的 16S rDNA 序列提交 NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫，與其中已有的序列進(jìn)行比較分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).從數(shù)據(jù)庫中得到相關(guān)種屬的有效發(fā)表序列的 16S rDNA 序列信息.使用 MEGA v6軟件進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.

2 結(jié)果和分析

2.1 抗Msm菌活性的放線菌菌株篩選

篩選的461株放線菌中，394株具有抗Msm菌活性，這些菌株主要來自于大連灣潮間帶，大連淩水潮間帶，大連20～30 m深處分離的海綿中及旅順海底，拮抗Msm陽性率為85.5%，遠(yuǎn)高于從南海海域的海綿中篩選出的放線菌菌株拮抗結(jié)核活性陽性率(為1.4%)[11]，表明了本文所選擇的放線菌資源庫以抗結(jié)核為目標(biāo)呈現(xiàn)較高的陽性篩選效率，可作為尋找新的抗結(jié)核藥物先導(dǎo)化合物的重要資源之一.在抑Msm菌的組分中，EF2組分比EF1組分量高出8%，表明菌株活性組分更傾向于分布在培養(yǎng)液的乙酸乙酯萃取物中，這些脂溶性的活性組分更易穿過分枝桿菌富脂的疏水性外壁，從而滲入菌體內(nèi)，發(fā)揮更好地抗結(jié)核活性.EF1與EF2組分同時(shí)表現(xiàn)出抗Msm活性菌株占陽性菌株的32%(127株)(圖1)，表明這些菌株可產(chǎn)生多樣性的抗結(jié)核活性成分，實(shí)現(xiàn)了菌株資源的充分利用.

圖1 具抗Msm菌活性的菌株活性組分與級(jí)別分布Figure 1 The active components and activity level of anti-Msm strain

獲得26株高強(qiáng)抑菌活性菌株中，菌株編號(hào)772與D98菌體和培養(yǎng)液提取物均表現(xiàn)出高抗Msm菌活性(表2).菌體丙酮提物中抑菌活性最高的菌株為D98，MIC為19.5 μg/mL.培養(yǎng)液萃取物中活性最高的菌株為772，596和DL238，MIC均為0.24 μg/mL，低于目前所使用的異煙肼(16 μg/mL)[12]，利福平(16 μg/mL)[12]，卷曲霉素(4 μg/mL)[13]，阿米卡星(1 μg/mL)[13]等抗結(jié)核藥物.通過薄層色譜法對(duì)來自不同菌株粗提物EF1與EF2組分進(jìn)行初級(jí)分離，如圖2，可觀察到粗提物EF1與EF2組分中含有多種成分(圖2)，表明了篩選出的陽性菌株中有效的抗Msm活性成分含量更低，實(shí)際MIC值要低于粗提物MIC值，可見這些菌株具有進(jìn)一步挖掘新型抗結(jié)核藥物的潛力.

圖2 不同菌株EF1與EF2組分的薄層層析分離Figure 2 The components of EF1 and EF2 from different strains were separated by thin-layer chromatography (TLC) and visualized by iodine vapor

2.2 抑Msm菌活性菌株分子鑒定

將23株高強(qiáng)抑菌活性菌株的16S rDNA序列信息分別輸入至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，與其中已有的序列進(jìn)行比較，進(jìn)行屬一級(jí)歸類.如表2，這些高強(qiáng)抗Msm活性菌株均來自于鏈霉菌屬(Streptomyces).其中菌株HVG29與Streptomycesmicroflavus(GeneBank：EU570571.1)，D116與Streptomycesgriseoplanus(GeneBank：KR476418.1)，D224與Streptomycesrutgersensis(GeneBank：KJ488980.1)，H72與Streptomycesparvus(GeneBank：JX976304.1)及D170與Streptomyceslavendulae(GeneBank：KC626003.1)間的同源性至少為99%,故認(rèn)為菌株HVG29，D116，D224，H72與D170分別屬于S.microflavus,S.griseoplanus,S.rutgersensis,S.parvus與S.lavendulae.

表2 高抗Msm活性菌株活性組分，MIC，種屬分布及已報(bào)道抗生素種類Table 2 The active component,MIC,species of the strains with highly antimicrobial activity and the reported antibiotics produced by corresponding species

在菌株772與D23可能所屬的鏈霉菌的一些種里，雖然已報(bào)道可以產(chǎn)生具有抗結(jié)核分枝桿菌活性的核苷類抗生素[14]，然而不同來源的鏈霉菌，其次級(jí)代謝產(chǎn)物可能不同.海洋由于其高壓、高鹽、寡營養(yǎng)、低溫等特點(diǎn)，被認(rèn)為是生命活動(dòng)的極端環(huán)境.生活在這一特殊環(huán)境中的放線菌，其生理生化特征及其次級(jí)代謝途徑與陸生放線菌有很大的區(qū)別，可以產(chǎn)生具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)和獨(dú)特生理功能的代謝產(chǎn)物[15].因此，這也正說明了菌株772與DL238的高抑菌活性.同理菌株596與D98可能所屬的鏈酶菌的一些種里，雖已有產(chǎn)生多肽類抗生素如卷曲霉素可抑制結(jié)核分枝桿菌的報(bào)道[16,17]，然而菌株596與D98高的抑菌活性意味著其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)可能不同于已有報(bào)道.

2.3 與抗結(jié)核藥物活性比較

抗Msm菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為以乙胺丁醇為對(duì)照，其MIC值為0.24 μg/mL，來自菌株編號(hào)596,772與DL238的EF2組分的MIC與對(duì)照相同，對(duì)Msm菌有較強(qiáng)的抑制作用.乙胺丁醇對(duì)結(jié)核分枝桿菌與恥垢分枝桿菌的MIC值分別為0.47 μg/mL和0.25 μg/mL，為二線抗結(jié)核藥，可用于經(jīng)其他抗結(jié)核藥治療無效的病例[10].來自于菌株編號(hào)596,772與DL238的EF2組分含有多種物質(zhì)，因此其抗Msm菌活性成分比目前廣泛應(yīng)用的抗結(jié)核藥物乙胺丁醇具有更低的MIC值，表明了在這些菌株中，很有潛力分離出新型抗結(jié)核藥物.

3 結(jié) 論

本研究通過以抗Msm菌活性為導(dǎo)向，評(píng)價(jià)了來源于大連周邊海綿中放線菌對(duì)于抗分枝桿菌的陽性率非常高，提供了拮抗結(jié)核藥物的先導(dǎo)物儲(chǔ)備資源庫；從海綿共附生放線菌中篩選出26株來自于鏈霉菌屬的高抑菌活性的菌株，為新型抗結(jié)核藥物的研發(fā)提供新的目標(biāo).