柱花草青貯早期發(fā)酵特性及3種植物蛋白酶活性動態(tài)研究

王 堅，李雪楓 ，郇樹乾

(1. 海南大學(xué) 動物科技學(xué)院，海南 ?？?570228；2. 海南大學(xué) 林學(xué)院，海南 ?？?570228)

柱花草(Stylosanthesguianensis)是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛種植的優(yōu)良豆科牧草，具有蛋白質(zhì)含量高、適口性好等特點(diǎn)，是熱帶、亞熱帶地區(qū)畜牧養(yǎng)殖的主要粗飼料[1]。熱帶地區(qū)雨季、旱季分明，柱花草的生物量也出現(xiàn)雨季生長旺盛、蓄積較多，而旱季生長緩慢、蓄積較少的季節(jié)性波動，導(dǎo)致動物對其利用存在雨季過剩、旱季短缺的不平衡現(xiàn)象。為確保能夠全年利用柱花草，以緩解動物飼草料供求不平衡，滿足動物生產(chǎn)實際需要，將旺盛生長期利用過剩的柱花草制備為青貯飼料是一條理想途徑[2]。牧草在青貯早期有大量蛋白質(zhì)降解，導(dǎo)致青貯飼料中的非蛋白氮增加，使動物對青貯飼料中氮的利用效率低，降低了青貯飼料的營養(yǎng)價值[3]。研究表明，植物酶對飼草料青貯早期含氮化合物的廣泛變化起主要作用[3]。

植物被收割后，體內(nèi)的生物合成反應(yīng)受到了限制，但青貯早期在有氧氣和有用底物的條件下，植物酶仍然承擔(dān)著呼吸作用和蛋白水解作用。McKersie[4]已經(jīng)證實，初花期紫花苜蓿中至少存在酸性蛋白酶、羧基肽酶和氨基肽酶等3種植物蛋白水解酶，這些酶在青貯中的活性變化引起牧草青貯過程中蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的水解，從而成為最終決定紫花苜蓿青貯飼料品質(zhì)的重要因素之一[3]。目前，對于柱花草青貯的研究，主要集中在柱花草與農(nóng)副產(chǎn)品混合青貯[2,5]、乳酸菌添加青貯[6-9]、青貯后有氧穩(wěn)定性[10]及溫度對其發(fā)酵品質(zhì)的影響等[11]方面，對柱花草在青貯早期的發(fā)酵特性及其青貯時植物蛋白酶活性變化情況的研究報道較少，使人們對柱花草青貯發(fā)酵進(jìn)程與發(fā)酵品質(zhì)相關(guān)的各指標(biāo)的變化動態(tài)尚不了解，對柱花草青貯飼料品質(zhì)的調(diào)控也缺乏具體理論支撐。因此，本試驗就柱花草不添加任何添加劑、也不與任何其它材料混合的情況下單獨(dú)青貯，對其青貯早期的發(fā)酵特性和羧基肽酶、氨基肽酶與酸性蛋白酶活性的變化情況進(jìn)行檢測分析，為熱帶地區(qū)豆科牧草青貯利用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

熱研2號柱花草(Stylosanthesguianensis(Aublet) Swartz cv. Reyan No. 2)種子于2018年3月1日播種于海南大學(xué)農(nóng)科基地，2018年8月2日刈割，此時為孕蕾期。柱花草的主要化學(xué)成分：干物質(zhì)238.17±9.95 g/kg鮮重，干物質(zhì)中粗蛋白、水溶性碳水化合物、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別為109.38±3.02、36.49±1.58、529.16±10.16和492.73±8.78 g/kg。

1.2 試驗設(shè)計

采用單因素隨機(jī)設(shè)計，將材料裝至聚乙烯袋，分別在青貯0.5、1、2、3、5、7和14 d后打開取樣，分析發(fā)酵品質(zhì)和酶活性，每個時間點(diǎn)3個重復(fù)。

1.3 試驗方法

1.3.1 青貯飼料制作 2018年8月2日用鐮刀刈割柱花草取樣，分裝后將柱花草鮮樣置于液氮中運(yùn)至實驗室，取少量柱花草鮮樣用于測定鮮草酶活，其余用鍘刀切短至2 cm左右，快速裝入18×22 cm的聚乙烯青貯袋中，每袋150 g，抽真空后室溫保存。

1.3.2 樣品處理 按照試驗設(shè)計在不同青貯時間點(diǎn)分別打開青貯袋，取出青貯料混勻，從中稱取10 g，轉(zhuǎn)入勻漿器，加入50 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(緩沖液pH 6.0，內(nèi)含5 mmol/L硫代硫酸鈉)勻漿。勻漿液經(jīng)2層紗布過濾，濾液于4 ℃下10 000×g離心10 min，棄沉淀，上清液為酶粗提液，置于液氮中保存用于測定羧基肽酶、氨基肽酶和酸性蛋白降解酶活性。

另外稱取35 g青貯料放入250 mL三角瓶，加入70 g去離子水置于冰箱4 ℃浸提24 h，收集濾液用來測定pH、乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)、丁酸(butyric acid，BA)、氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)。余下青貯飼料65 ℃烘干，用于測定總氮(total nitrogen，TN)。

1.3.3 測定指標(biāo)和方法 用pH計測定(pHS-3C，上海佑科儀器儀表有限公司)。高效液相色譜色譜儀(日立LC-2000)測定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸，測定條件參數(shù)見文獻(xiàn)[2]。氨態(tài)氮采用苯酚-次氯酸鈉法測定[12]，總氮采用凱氏定氮法測定[13]。

羧基肽酶活性測定[4]：酶粗提液0.1 mL和2 mL底物溶液(2 mmol/L羧基苯氧基-L-苯基-丙氨酸溶于50 mmol/L乙酸鈉緩沖液中，pH 5.2，含0.5 mmol/L EDTA)在40 ℃下培養(yǎng)2 h，將混合物在沸水中煮沸5 min。 冷卻后，反應(yīng)混合物中游離氨基酸按照Broderick和Kang[14]所述方法測定，酶活性表示為每克青貯飼料干物質(zhì)每小時釋放的游離氨基酸(μmol氨基酸釋放/(h·g DM))。

氨基肽酶活性測定[4]：2 mmol L-亮氨酸-4-硝基苯胺作為底物溶于5 mmol磷酸-檸檬酸緩沖液中。酶粗提液0.5 mL和2 mL底物溶液混合，在40 ℃下培養(yǎng)2 h，沸水中煮沸5 min。 冷卻后，在分光光度計上410 nm處測定吸收值。酶活性表示為每克青貯飼料干物質(zhì)每小時在410 nm處吸光值(units/h·g DM))。

酸性蛋白酶活性測定[15]：反應(yīng)混合物為0.3 mL 10 mg/mL的偶氮酪蛋白溶液，0.5 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.0)，0.2 mL的酶粗提液。將混合物在40 ℃下培養(yǎng)2 h，然后添加2 mL 12%的高氯酸終止反應(yīng)，反應(yīng)液4 ℃下10 000×g離心10 min，棄沉淀，上清液在分光光度計上350 nm處測定吸收值。酶活性表示為每克青貯飼料干物質(zhì)每小時在340 nm處吸光值(units/(h·g DM))。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

采用SAS 8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，采用Duncan法在P=0.05水平進(jìn)行多重比較。圖中3種酶活性均以占鮮樣酶活性百分含量表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱花草青貯飼料早期發(fā)酵動態(tài)變化

柱花草青貯早期發(fā)酵動態(tài)變化見表1。在柱花草青貯早期(青貯的前14 d內(nèi))，隨青貯時間增加，青貯飼料的pH雖然呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢，但不同青貯時間的pH差異并不顯著(P>0.05)。青貯第2天乳酸含量顯著增加(P<0.05)；第3～5天保持穩(wěn)定，第7天再次顯著增加(P<0.05)，第14天含量達(dá)最大值13.91 g/kg DM。青貯第0.5～1天，乙酸含量差異不顯著(P>0.05)，第2天顯著增加一直持續(xù)到青貯結(jié)束；整個青貯期間丙酸含量較低，但從青貯第2天開始顯著增加(P<0.05)，第14天其值為1.77 g/kg DM；青貯第1天有少量丁酸產(chǎn)生，第2天后丁酸含量顯著增加直到試驗結(jié)束(P<0.05)；隨著青貯時間的延長，LA/AA值逐漸降低，由第1天的1.11最后顯著降低到0.59(P<0.05)；氨態(tài)氮/總氮值從青貯第2天起顯著增加(P<0.05)，在青貯最后達(dá)181.16 g/kg TN。

表1 柱花草青貯早期發(fā)酵動態(tài)變化Table 1 Changes in fermentation qualities in Stylosanthes guianensis silage during the early stage of ensiling

2.2 柱花草青貯飼料中三種植物蛋白酶活性變化

柱花草青貯飼料中氨基肽酶、羧基肽酶和酸性蛋白酶活性檢測結(jié)果見圖1。

2.2.1 氨基肽酶的活性變化 柱花草青貯早期，隨青貯進(jìn)行，青貯飼料的pH呈下降趨勢，第0.5天時為6.09，第14天時降至5.48。隨pH降低，氨基肽酶活性(占鮮樣酶活性百分比)呈逐漸降低的趨勢(圖1)。柱花草鮮草的氨基肽酶活性為45.70 units/(h·g DM)，青貯0.5 d時其活性降低11.79%，1 d時的活性顯著降至鮮樣時的70.81%(P<0.05)，青貯2 d時的氨基肽酶活性與青貯1 d時無顯著差異(P>0.05)，但青貯3 d后氨基肽酶活性又顯著下降(P<0.05)，至青貯7 d時氨基肽酶的活性降為2.42 units/(h·g DM)，僅為其鮮樣活性的5.30%，第14天時氨基肽酶的活性為0(圖1)。

圖1 柱花草青貯早期3種植物蛋白酶活性變化同一種酶不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Fig. 1 Changes in activity of three plant proteinase in Stylosanthes guianensis silage during theearly stage of ensilingDifferent lowercase letters for the same enzymeindicate significant difference(P<0.05)

2.2.2 羧基肽酶的活性變化 青貯早期，柱花草青貯飼料的羧基肽酶的活性(占鮮樣酶活性百分比)隨pH的降低和青貯時間的延長逐漸降低。柱花草鮮草的羧基肽酶活性為每克干物質(zhì)每小時釋放游離氨基酸122.60 μmoL。青貯前3 d，羧基肽酶活性隨青貯進(jìn)程每天顯著降低(P<0.05)，至第3天時降至鮮草活性的56.32%；第3～5天時，羧基肽酶活性的減低趨勢減緩(P>0.05)；雖然青貯至第7天時羧基肽酶活性比第3天時降低14.21%，為鮮草活性的48.30%(P<0.05)，但之后其活性基本保持不變，至第14天時其活性為每克干物質(zhì)每小時釋放游離氨基酸56.15 μmoL(是鮮草活性的45.8%)(圖1)。

2.2.3 酸性蛋白酶的活性變化 青貯早期，柱花草青貯飼料的酸性蛋白酶的活性(占鮮樣酶活性百分比)也隨pH的降低和青貯時間的延長逐漸降低。柱花草鮮草的酸性蛋白酶活性為13.10 units/(h·g DM)。青貯0.5～1 d時，酸性蛋白酶活性變化顯著(P>0.05)，第2天和第3天時酸性蛋白酶活性持續(xù)顯著降低(P<0.05)，第3天時已降至鮮樣時的55.21%；之后酸性蛋白酶活性的降低趨勢減緩，至青貯第14天時其活性為5.6 units/ h·g DM，是鮮樣時的42.75%(圖1)。

3 討 論

3.1 柱花草青貯早期發(fā)酵特性

整個青貯早期，柱花草青貯飼料的pH均比較高(5.48～6.09)，推測是青貯早期沒有產(chǎn)生足夠的乳酸來降低pH，而較低的乳酸含量(2.59～13.91 g/kg DM)也印證了這一推測。乳酸產(chǎn)量較低的原因在于柱花草材料中水溶性碳水化合物含量僅為36.49 g/kg DM，遠(yuǎn)低于乳酸菌產(chǎn)酸的需要量(≥100 g/kg DM)[16]，這可能影響到青貯飼料的長期保存。本試驗中青貯早期的發(fā)酵產(chǎn)物以乙酸為主，這一結(jié)論與象草等其它熱帶牧草青貯的結(jié)果相似[17-18]，Pettersson 和Lindgren[19]的研究結(jié)果也表明青貯飼料含有高含量乙酸的原因與青貯材料的碳水化合物含量較低有非常緊密的關(guān)系。柱花草青貯第14天的丙酸和丁酸含量雖少，但與第7天相比較顯著增加，表明梭菌和丙酸菌的活性在第14天時還未得到完全抑制，可能是青貯前7 d 的pH仍然較高所致。Yokota等[17]和Miyagi等[20]認(rèn)為熱帶牧草青貯主要是乙酸型發(fā)酵，是由于其較低的碳水化合物含量和較高的緩沖能，盡管本試驗沒有測定柱花草青貯材料的緩沖能，但試驗中乳酸/乙酸(LA/AA)的值低于1表明柱花草青貯發(fā)酵是以乙酸型發(fā)酵為主，可推測青貯原料的低碳水化合物含量對其乙酸型發(fā)酵起著重要作用。隨著青貯進(jìn)行，丁酸和氨態(tài)氮/總氮(AN/TN)的值逐漸增加，特別是試驗結(jié)束時(第14天)氨態(tài)氮/總氮的值是好青貯飼料氨態(tài)氮/總氮值標(biāo)準(zhǔn)(≤80 g/kg TN)[21]的2.26倍，說明由于柱花草直接青貯時碳水化合物含量低，不能快速產(chǎn)生足夠的乳酸來降低pH，使有害微生物活性未得到有效抑制，形成了丁酸，并將蛋白質(zhì)降解為氨態(tài)氮[16]，導(dǎo)致青貯飼料品質(zhì)變差。

3.2 青貯早期植物酶蛋白酶活性變化情況

植物蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)對細(xì)胞蛋白質(zhì)循環(huán)和降解起著作用，在牧草飼料作物青貯時，由于收獲期間機(jī)械破壞或由于厭氧條件下細(xì)胞破裂，蛋白水解酶被釋放，將細(xì)胞質(zhì)蛋白水解為短鏈肽和游離氨基酸[4]。本試驗中，羧基肽酶和酸性蛋白酶在青貯14 d后仍然具有活性，說明它們是青貯早期水解柱花草青貯飼料蛋白質(zhì)的主要酶類。氨基肽酶在青貯第7天酶活僅為鮮樣的5.30%，14 d后酶活性為0，與Yuan等[22]在紫花苜蓿中得到的研究結(jié)果相似。 Guo等[23]的研究表明氨基肽酶在紫花苜蓿青貯第4天就失去了活性，而李旭嬌[24]的研究結(jié)果表明氨基肽酶在紫花苜蓿青貯35 d后仍具有非常低的活性，兩者研究結(jié)果與本試驗氨基肽酶失活時間的不一致，可能與青貯pH、溫度和處理時間有關(guān)[25-27]。隨青貯時間的延長，羧基肽酶和酸性蛋白酶活性逐漸降低，但羧基肽酶活性降低的速度較酸性蛋白酶和氨基肽酶慢(青貯結(jié)束后分別為鮮樣活性的45.8%、42.75%和0)，這與其他學(xué)者對紫花苜蓿青貯的研究結(jié)果相似[22-23，28]。pH是影響青貯飼料蛋白質(zhì)水解的主要因素之一，適合紫花苜蓿蛋白酶水解的最佳pH是5.5～6.0[26-27]；Heron等[29]研究發(fā)現(xiàn)意大利黑麥草中的蛋白酶在較寬的pH范圍內(nèi)仍保持活性，該pH范圍被認(rèn)為是代表了幾種具有不同最佳pH的蛋白酶的聯(lián)合活性。本試驗pH在6.09時，氨基肽酶、羧基肽酶和酸性蛋白酶均具有較高的活性(分別為鮮樣活性88.21%、90.07%和90.99%)；pH在5.92時，氨基肽酶活性已下降到9.69 units/(h·g DM)，僅為鮮樣活性的21.2% ，但羧基肽酶和酸性蛋白酶活性仍高于50%(分別為鮮樣活性的56.32%和58.63%)；在pH為5.48時，氨基肽酶活性已經(jīng)失活，而羧基肽酶和酸性蛋白酶還分別保持著鮮樣活性的45.8%和42.75%，說明每種酶活性的最佳pH和失活范圍不一樣。本試驗中3種植物蛋白酶活性均隨青貯時間的延長而下降，但每種蛋白酶活性在不同pH穩(wěn)定性不一樣，它們都是獨(dú)立下降，與McKersie和Buchanan-Smith[28]研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

柱花草青貯發(fā)酵早期pH高，乳酸含量低，氨態(tài)氮/總氮高，發(fā)酵品質(zhì)差；3種蛋白酶活性均隨青貯進(jìn)行而下降，氨基肽酶活性失活時間較羧基肽酶和酸性蛋白酶早，在進(jìn)行柱花草青貯時可考慮添加發(fā)酵促進(jìn)劑或蛋白酶抑制劑，以降低酶活性，減少蛋白分解，提高青貯飼料品質(zhì)。