羅漢果土傳病害拮抗細(xì)菌的篩選及鑒定

王瑞昊 鄧業(yè)成 陳廣桂 張澤 張燕玲 鄧志勇 藍(lán)福生 郭麗霞 張川梅 梁保明 駱海玉 張明良

摘要：【目的】從羅漢果根際土壤中篩選分離出對白絹病（southern blight）與根腐?。╮oot rot）有抑制作用的拮抗細(xì)菌，為羅漢果土傳病害生物防治提供合適菌株。【方法】采用稀釋涂布法和劃線法從羅漢果果園土壤中分離純化出拮抗細(xì)菌114株。隨后對分離出的拮抗細(xì)菌采用平板對峙法進(jìn)行抑菌活性篩選。通過16S rDNA序列分析，結(jié)合菌落形態(tài)特征，生理生化特征對菌株進(jìn)行鑒定?！窘Y(jié)果】22株細(xì)菌對至少1種羅漢果土傳病原真菌表現(xiàn)出小同程度的抑制作用。其中5株細(xì)菌即TYX-2、TYX-3、TYX-4、TYX-7和TYX-8對根腐病與白絹病抑制作用最為明顯，對羅漢果根腐病菌的抑制率分別為67.53%、57.50%、64.17%、60.00%和66.67%。對羅漢果白絹病菌的抑制率分別為83.03%、87.58%、53.3 1%、82.27%和86.67%。經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，確定TYX-2、TYX-7和TYX-8為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezia），TYX-3為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），TYX-4為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。貝萊斯芽孢桿菌TYX-2、枯草：芽孢桿菌TYX-3和解淀粉芽孢桿菌TYX-4發(fā)酵液對2種羅漢果病原真菌電有較好的抑制作用，對羅漢果根腐病菌的抑菌率分別為47.83%、48.67%和45.83%，對羅漢果白絹病菌的抑菌率分別為5 2.00%、50.42%和55.83%。【結(jié)論】分離鑒定出的TYX-2、TYX-3和TYX-4分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，具有較高的生防應(yīng)用價值，為進(jìn)一步研制復(fù)合生防菌劑，防治羅漢果土傳病害奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：羅漢果;根腐病菌;白絹病菌;分離鑒定;拮抗細(xì)菌

中圖分類號：S 435

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-03 84（ 2021） 080927-09

Antagonistic Bacteria against Soil-borne Diseases on Siraitia grosvenornWANGRuihao 1. DENGYecheng 1*， CHENGuanggui 1， ZHANGZe 1. ZHANGYanling 2， DENGZhiyong 1， LANFusheng 2，GUO Lixia 2. ZHANG Chuanmei 2. LIANGBaoming 2， LUO Haiyu 1， ZHANGMingliang 2（I. College of Life Sciences， Guangxi Normal University. Guilin， Guangxi 54 1004， China;2. Guilin GFS Monk Fruit Crop， Guilin， Guangxi 541006. China ）

Abstract： 【Object】Microbes with potential of being used as biological control agents against the southern blight and rootrot diseases on Siraitia grosvenorii were screened and identified from the thizosphere soil in the field. 【Method】A total of114 strains of presumably antagonistic microorganisms were isolated from the soil at a S. grosvenorii orchard by means ofdilution coating and streaking. The isolates were screened for their antibacterial activity using the plate confrontation method.and subsequently， identified by 16S rDNA sequence analysis along with observations on the colony morphology and microbialphysiochemical characteristics. 【Result】Twenty-two isolated strains displayed varying degrees of inhibition effect on one orboth root rot and southern blight pathogens. They included the bacteria under the coded names of TYX-2. TYX-3. TYX-4.TYX-7. and TYX-8 with inhibition rates on the root rot of 67. 53 %， 57.50%. 64.17%， 60.00%. and 66.67%， respectively， and onthe southern blight with the rates of 83.03%. 87.58%. 53.3 1%. 82.27%， and 86.67%， respectively. TYX-2， TYX-7. and TYX-8were identified to be Bacillus velezia. TYX-3 B. subtilis. and TYX-4 B. amyloliquefaciens. The fermentation broths of TYX-2.TYX-3， and TYX-4 also showed significant inhibition rates on the root rot pathogen at 47.83%. 48.67%. and 45.83%.respectively， and 52.00%. 50.42%. and 55.83% on the southem blight. 【Conclusion】 The isolated B. velez， B. subtilis'. and B.amyloliquefaciens strains displayed significant inhibitory effects on the root rot and southern blight of S. grosvenorii. Theycould be studied further for a potential application as agents for biocontrol on the diseases.

Key words： Siraitia grosvenorii; root rot; southern blight; isolation and identification： biocontrol bacteria

0 引言

【研究意義】羅漢果Siraitia grosvenorii （Swingle）C.Jeffrey為葫蘆科Cucurbitaceae羅漢果屬Siraitia多年生草質(zhì)藤本宿根植物，又名漢果、長壽果、神仙果，是我國特有甜料及珍貴藥用植物。羅漢果果實富含人體所需的多種氨基酸、維生素及多種糖類物質(zhì)，具有清心潤肺、止咳消喘、清熱解毒、潤腸通便、祛痰補(bǔ)血、益肝、健脾、鎮(zhèn)靜及降壓等功效，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、飲料和調(diào)味品等領(lǐng)域[1]。羅漢果的藥用部位不僅是果實，根和葉也可入藥，對治療消化系統(tǒng)疾病，降低血壓功效顯著;羅漢果甜素具有甜度高，不含熱量，無毒等優(yōu)點，符合目前食品市場對低熱量甜味劑的需求，在保健食品領(lǐng)域發(fā)展前景廣闊[2]。但以白絹病、根腐病為主的羅漢果土傳病害嚴(yán)重影響果實產(chǎn)量。僅2003 2005年桂林羅漢果種植區(qū)因病害死亡共計234789株，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)586.97萬元。白絹病病菌能危害100多科的500多種植物，主要通過侵染植物幼苗近地面的根莖部發(fā)病[3]，發(fā)病植株根部產(chǎn)生白色菌絲持續(xù)蔓延，在后期可形成褐色菌核。羅漢果根腐病發(fā)病癥狀表現(xiàn)在地上、地下2個部分。地下部分：須根少并完全腐爛，主根呈黑色逐漸腐爛。地上部分：植株矮小，底葉變黃枯落，最后整株葉片萎蔫、枯死[4]。土傳根系病害發(fā)生除與病原菌有關(guān)外，還常伴隨根際土壤微生物區(qū)系異常，有害微生物數(shù)量增加，有益微生物數(shù)量減少，嚴(yán)重影響植物健康[5]。因此，如何全面有效地防治這類土傳病害已經(jīng)成為植物生產(chǎn)上的當(dāng)務(wù)之急?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】拮抗菌的篩選鑒定是植物生物防治中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有研究表明從健康草莓根際土壤中分離出的多粘類芽孢桿菌可使草莓根腐病菌尖孢鐮刀菌菌絲畸形生長[6]。Sid Ahmed等[7]從甜椒根基組織中分離出4株芽孢桿菌，可有效降低疫霉菌侵害，與對照組相比根系腐爛情況降低80%。季倩茹等[8]將巨大芽孢桿菌B213、多粘類芽孢桿菌B207和枯草芽孢桿菌B204 3種芽孢桿菌聯(lián)合施用后在盆栽實驗中可有效抑制黃瓜枯萎病的發(fā)生。這些研究結(jié)果表明從植物根系土壤中分離鑒定的拮抗菌具有良好的生防效果，在生物防治中發(fā)揮重要作用?！颈狙芯壳腥朦c】目前生防微生物的研究多集中在辣椒、草莓等大面積種植的作物，對羅漢果土傳病害拮抗菌的研究較少，因此本研究從健康羅漢果根系土壤中分離純化拮抗細(xì)菌，對其進(jìn)行抑菌效果測定，對效果較好的菌株進(jìn)行鑒定并探究其發(fā)酵產(chǎn)物活性?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選出的拮抗菌株，進(jìn)一步開展利用拮抗微生物防治羅漢果土傳病害的研究，旨在探討有效的羅漢果土傳病害綠色防控新技術(shù)，解決目前該類病害危害嚴(yán)重、防治困難以及因化學(xué)防治造成的羅漢果產(chǎn)品農(nóng)藥殘留問題，為羅漢果產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展提供有效的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料與試劑

病原菌：腐皮鐮孢菌（Fusarium solani），羅耳阿太菌（Athelia rolfsii）均從桂林市臨桂區(qū)羅漢果種植園內(nèi)采集具有羅漢果根腐病與白絹病典型癥狀的病株中分離得到。

拮抗細(xì)菌：從桂林市臨桂區(qū)羅漢果種植園內(nèi)健康羅漢果根際土壤中分離得到。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，去離子水1000 mL，pH 7.0。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，用去離子水定容至1000 mL，pH 7.0。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉膏3 9，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。

1.2試驗儀器

主要儀器：超凈工作臺ZHJH-C1112C，上海智城;恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)泰宏醫(yī)療器械;恒溫?fù)u床LY2-2102C，上海龍躍;紫外可見光分光光度計UV-1200，上海美普達(dá)。

1.3試驗方法

1.3.1土壤拮抗細(xì)菌的分離 選取自然狀態(tài)下生長較為粗壯的羅漢果苗，緩慢抖落根部土壤后取附著在根際表面的土壤，參考柳慧麗[9]的方法，將10 g健康羅漢果根際土壤樣品放入裝有90 mL無菌水的250 mL滅菌三角瓶中，將三角瓶置于37℃，200r·mm_1搖床振蕩20 min，使之充分懸浮后在80℃水浴條件下加熱10 min后用無菌水稀釋至10-3、10-4、10-5、10 6等4個濃度梯度。分別吸取100 uL土壤懸液用涂布法接于牛肉膏培養(yǎng)基上，每種濃度梯度重復(fù)3次，置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24-48 h，定時觀察并挑取單菌落進(jìn)行平板劃線純化。將平板置于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.3.2土壤拮抗細(xì)菌對羅漢果土傳病原真菌的抑菌活性測定 采用平板對峙法測定土壤細(xì)菌對羅漢果根腐病菌和白絹病菌的抑菌活性。在無菌操作臺內(nèi)用直徑為4 mm的打孔器在恒溫28℃，培養(yǎng)3d的病原菌落邊緣打孔，用無菌接種針將菌餅接于PDA平板中央，同時在病原菌兩側(cè)2.5 cm處用接種環(huán)取分離菌株劃線，對照組只接病原菌而不接種拮抗細(xì)菌（ CK）。每個處理重復(fù)3次。28℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)7d后測量病原真菌菌落半徑，計算抑菌率[1O]。

抑菌率/% -[（對照菌落半徑處理菌落短半徑）/（對照菌落半徑0.2 cm）]×100

1.3.3拮抗菌株鑒定 形態(tài)觀察：將活化后的菌株用劃線法接入平板，30℃培養(yǎng)24h，觀察菌落的生長情況、顏色和形態(tài)特征。生理生化檢測：將篩選的拮抗菌于LB液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)24h后用于生理生化的測定，測定指標(biāo)包括革蘭氏染色、VP（ Voges-Proskauer）實驗、接觸酶實驗、吲哚產(chǎn)生實驗、明膠液化實驗、甲基紅實驗、阿拉伯糖發(fā)酵實驗、甘露醇發(fā)酵實驗、麥芽糖發(fā)酵實驗、木糖發(fā)酵實驗、葡萄糖發(fā)酵實驗、蔗糖發(fā)酵實驗。具體方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]。分子鑒定：采用細(xì)菌通用物27f： AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R： TACGGYTACCTTGTTACGACTT對其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系30 uL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃5 min. 95℃30 s，55℃30 s，72℃1min，35個循環(huán)，72℃10 min，12℃終止反應(yīng)。送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行檢測純化及測序。登錄NCBI網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov）利用Blast軟件將獲得基因序列與GenB ank中已知的序列進(jìn)行同源性比對分析，選擇同源性相近的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，序列先進(jìn)行多重比對，然后用MEGA6軟件采用鄰接法（Kimura's 2-parameter模型，bootstrap 1000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)地位。

1.3.4拮抗細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果土傳病原真菌的抑菌活性測定 以在1.3.2中抑菌效果較好的拮抗細(xì)菌作為復(fù)篩菌株。將NA培養(yǎng)基上活化好的拮抗細(xì)菌接于裝有NA液體培養(yǎng)基200 mL/500 mL三角瓶中，在溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，在無菌操作臺中用微孔無菌濾膜過濾后備用。采用濾紙片法測定發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果土傳病原真菌的抑菌活性：在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中倒入10mLPDA培養(yǎng)基，在平板中心放入滴加4 uL拮抗細(xì)菌濾液的濾紙片（直徑為6 mm），在濾紙片兩邊2.5 cm處放入用打孔器打取的病原真菌（直徑為4mm），以只接無菌水的濾紙片組為對照，每個處理3個重復(fù)，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定時觀察，待對照組菌落長至濾紙片邊緣時測量菌落半徑（處理菌落測量生長短半徑），按1.3.2中的公式計算抑菌率。

2結(jié)果與分析

2.1土壤拮抗細(xì)菌的分離

通過稀釋涂布與劃線法分離純化細(xì)菌菌株，共從羅漢果根際土壤中共分離出細(xì)菌144株，其中有拮抗活性的22株，編號分別為TYX一1至TYX一22。

2.2土壤細(xì)菌對羅漢果土傳病原真菌的拮抗活性

由表1與圖1可知TYX一2、TYX一3、TYX一4、TYX一7、TYX一8對2種病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率均在50%以上，其中TYX一2對根腐病的抑菌效果最好，達(dá)67.53%，對白絹病病抑制效果最好的為TYX一3，達(dá)87.58%。

2.3拮抗菌株鑒定

2.3.1拮抗菌株的形態(tài)特征與生理生化特征 根據(jù)篩選出的5株效果較好的生防細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，將分純后的生防菌平板用接種環(huán)取1/5環(huán)用劃線法接入牛肉膏固體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)48h后結(jié)果如表2與圖2所示，在平板上觀察到TYX一4菌株表面粗糙，呈網(wǎng)形菌落，稍有淡黃色，TYX一3菌株菌落呈不規(guī)則圓形，表面干燥，菌落呈乳白色;TYX一2、TYX一8、TYX一7等3株菌株生長速度較快，菌落呈乳白色規(guī)則圓形，表面濕潤黏稠。通過形態(tài)學(xué)初步觀察，除TYX一4菌株在生長速度、顏色、菌落表面有細(xì)微差異外，5種生防細(xì)菌在形態(tài)方面相似，初步判斷5種生防細(xì)菌為同屬。生理生化鑒定結(jié)果由表3可知，根據(jù)常見細(xì)菌鑒定手冊檢索初步鑒定TYX一3為枯草芽孢桿菌，TYX一4為解淀粉芽孢桿菌，TYX一2、TYX一8、TYX一7等3株皆為貝萊斯芽孢桿菌。

2.3.2拮抗菌株的16S rDNA測序結(jié)果 將5株細(xì)菌的16S rDNA分子鑒定結(jié)果經(jīng)過MEGA6.0軟件對相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，菌株TYX一2（登錄號MW019947）經(jīng)過BLAST對比后顯示與編號為MT626060.1的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezia）相似度為99.91%（圖3）。菌株TYX一3（登錄號MW019964）經(jīng)過BLAST對比后顯示與編號為KP184705.1的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相似度高達(dá)99.69%（圖4）。菌株TYX-4（登錄號MW019964）經(jīng)過BLAST對比后顯示與編號為KF836523.1的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amiyloliquefaciens）相似度達(dá)到100%（圖5）。TYX-7與編號為MT645702.1159-1283的貝萊斯芽孢桿菌相似度達(dá)到99.92%（圖6），TYX-8與編號為CP054714.1的貝萊斯芽孢桿菌相似度達(dá)l00%（圖7）。確定了TYX-3為枯草芽孢桿菌，TYX-4為解淀粉芽孢桿菌，TYX-2、TYX-8、TYX-7均為貝萊斯芽孢桿菌。

2.4拮抗細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果土傳病原真菌的抑菌活性

篩選出對羅漢果根腐病與白絹病均有抑制作用且不同種的3種生防細(xì)菌TYX-2、TYX-3、TYX-4進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性試驗。由表4與圖8可知，3種生防菌發(fā)酵產(chǎn)物對2種病原菌都有較好的抑制作用，對白絹病菌抑制率分別為52.00%、50.42%、55.83%，對根腐病菌抑制率分別為47.83%、48.67%、45.83%。其中TYX-4發(fā)酵產(chǎn)物對白絹病的抑制作用最好，達(dá)55.83%。試驗結(jié)果表明3種細(xì)菌生防發(fā)酵產(chǎn)物能夠有效防治羅漢果土傳病害，在生物防治中有一定潛力。

3討論與結(jié)論

現(xiàn)階段對土傳病害的防治主要從物理、化學(xué)、生物3個方面進(jìn)行。如物理防治方面，多采用輪作，太陽光消毒，換土等方法防治植物莖腐病。在化學(xué)防治方面，任鳳山等[12]篩選出70%惡霉靈與70%甲基硫菌靈可濕粉劑組合防治番茄莖腐病效果最佳，達(dá)95.57%。生物防治方面，高琳娜等[13]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵液進(jìn)行灌根后對板藍(lán)根根腐病防治效果達(dá)到72.97%，防效明顯的同時還具有一定的增產(chǎn)作用。目前，絕大部分化學(xué)藥劑和抗病品種只針對少數(shù)的土傳病害有效，對多數(shù)病害防效甚微，且土壤施入農(nóng)藥時除農(nóng)藥易被土壤吸附固定，被土壤微生物降解降低防效，用藥量大、效果差外，長期使用極易引起農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、植物毒性以及病原菌的抗藥性等問題[14]。生物防治由于克服了上述弊病，且大量的研究和實踐證明其對大部分土傳病害防治方面效果顯著[15]。芽孢桿菌作為近年來開發(fā)應(yīng)用最為成功的生防菌劑具有易獲得，價格低廉，抗逆性強(qiáng)，人畜無害等特點，有研究表明芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)已成功應(yīng)用在生物防治領(lǐng)域[16]。但目前有關(guān)羅漢果土傳病害生物防治的研究較少，本研究從羅漢果根際土壤中分離篩選chu 5株對羅漢果土傳病害有抑制效果較好的生防細(xì)菌，經(jīng)菌株形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA分子生物學(xué)鑒定，確定了TYX-2、TYX-7、TYX-8為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezia）、TYX-3為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、TYX-4為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。其中TYX-2對羅漢果根腐病抑菌效果最好，達(dá)67.5 3%。TYX-3對白絹病抑制效果最好，達(dá)87.58%。菌株TYX-2、TYX-3、TYX-4均是有較好應(yīng)用前景的生防菌株，為后續(xù)深入研究3株生防菌混合制成生防菌劑奠定理論基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：林海清）

收稿日期：2021-0201初稿;2021-0503修改稿

作者簡介：王瑞吳（ 1995-），男，碩士生，主要從事天然產(chǎn)物研究（E-mail： 429567099@qq.com）

*通信作者：鄧業(yè)成（ 1965-），男，博士，教授，主要從事天然產(chǎn)物及植物保護(hù)研究（E-mail： dyecheng@163.com）

基金項目：廣西重點研發(fā)計劃項目（桂科ABl850025）：桂林市重點研發(fā)計劃項目（20190211—19）