叢枝菌根真菌(AMF)接種劑種類和接種時期對牡丹菌根化組培苗培養(yǎng)的影響

曾端香，袁 濤，王蓮英

（1國家林業(yè)和草原局管理干部學院，北京 102600；2北京林業(yè)大學園林學院，北京 100083）

0 引言

據(jù)報道80%以上的植物具有叢枝菌根(AM)共生體系，Cronquist統(tǒng)計90%的維管植物都能形成叢枝菌根。叢枝菌根真菌(AMF)不僅對植物的生長發(fā)育、營養(yǎng)狀況、抗逆性以及產量與品質等具有重要作用，并且在一定程度上改良土壤質地、減少土壤病害、減輕環(huán)境污染[1-7]。郭邵霞[8]通過對河南洛陽和山東菏澤地區(qū)的栽培牡丹根圍的AMF資源調查，發(fā)現(xiàn)AMF是牡丹上普遍存在的現(xiàn)象。

組織培養(yǎng)已經成為園藝園林植物產業(yè)化生產的重要環(huán)節(jié)和快速繁殖苗木的主要形式。組織培養(yǎng)是在無菌條件下進行的，因而種苗與菌根真菌接觸的機會大為減少，甚至到了苗圃馴化培育階段也還常得不到菌根真菌的幫助，導致苗木生長狀況較差，抵抗力較弱，成活率較低[9]。張桂花[10]以牡丹品種‘黑花魁’、‘豆綠’等的休眠芽為外植體進行組培研究，但沒有獲得生根苗；陳怡平等[11]以牡丹不同的器官為外植體，通過不同的途徑獲得了不定芽，但不定芽生根困難。牡丹組培中仍存在組培苗生根難、褐化和玻璃化現(xiàn)象嚴重、移栽階段植株感病嚴重和死亡率高等問題[12-14]，成為了牡丹組培的瓶頸。曾端香等[15]對牡丹2個雜交系進行胚培養(yǎng)得到胚根苗無菌體系，篩選出胚培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件組合，通過牡丹胚培養(yǎng)解決組培中褐化問題，縮短繁育周期[16-18]。Pieriek[19]認為菌根生物技術在克服組培苗逆境脅迫方面，向根際引入有益微生物是一種重要機制，由于組培植株生長在一個完全無菌的環(huán)境中，因此盡早對組培苗進行高效菌根真菌的人工接種，實現(xiàn)種苗菌根化，可減輕移栽對組培苗造成的脅迫并能在移栽或定植后發(fā)揮功能[20]，成為人們研究的熱點。接種AMF還可以抑制組培苗在未消毒土壤中被土傳病原菌侵染，所以在種苗生產上，培育菌根化脫毒苗將會成為發(fā)展趨勢[21-22]。Fortuna[23]對紅葉李組培苗、李敏等[24]對芋組織培養(yǎng)苗、任萌圃等[25]對金葉連翹組培苗在移栽階段接種AMF，可提高組培苗的移栽成活率；曾端香等[26-27]發(fā)現(xiàn)接種AMF可以顯著改善牡丹菌根化容器苗對礦質營養(yǎng)元素的吸收和促進其生長發(fā)育。

本研究對牡丹組培苗在瓶內和移栽時接種不同種類的AMF，探索AMF對組培苗菌根化侵染過程和對組培苗移栽成活率和生長發(fā)育等的影響，以期為培養(yǎng)牡丹菌根化組培苗提供實踐途徑和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試AMF菌種 由北京市農林科學院中國叢枝菌根真菌種質資源庫(BGC)提供，菌種1#為Glomus geosporum，BGC 507(GZ-01)；菌 種 2#為Glomus mosseae，BGC(XJ-01)。

1.1.2 供試植物材料 牡丹組培苗為組培試驗中‘烏龍捧盛’的休眠芽組培的根誘導苗和生根苗，以及‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’的胚培養(yǎng)的胚根苗。2月下旬—3月初分別從北京植物園牡丹園和北京回龍觀牡丹園采集牡丹休眠芽進行組培以獲得根誘導苗和生根苗，10—11月從牡丹芍藥育種基地（河南）采集雜交牡丹種子進行胚培養(yǎng)以獲得胚培養(yǎng)的胚根苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌條件下牡丹組培苗瓶內接種AMF試驗

（1）AMF孢子分離提取。用濕篩傾析法分離孢子，在體視解剖鏡下挑取大小一致、不帶連孢菌絲的孢子備用。

（2）AMF孢子的表面滅菌方法。參照董昌金[28]的差別滅菌法。①先用A液（2%氯胺-T+200 mg/L鏈霉素+100 mg/L慶大霉素）處理10 min，無菌水沖洗數(shù)次；②置于25～27℃培養(yǎng)3天，讓雜菌萌發(fā)；③再用A液滅菌10 min后無菌水沖洗，即重復步驟①。

（3）無菌條件下瓶內接種AMF孢子。將表面滅菌處理后的孢子進行瓶內接種。休眠芽組培苗分成未進行根誘導的休眠芽增殖芽、完成根誘導的休眠芽增殖芽、已經生根的休眠芽增殖芽3種類型接種。胚培養(yǎng)苗根據(jù)根長不同時期接種。將AMF孢子接種到瓶內組培苗莖段基部或根系附近，自然光培養(yǎng)。每株接種4～6個孢子，每處理15～20瓶，重復3次。每周觀察統(tǒng)計孢子侵染和萌發(fā)情況以及組培苗生長情況1次。

1.2.2 牡丹組培苗移栽時接種AMF試驗 移栽基質用草炭:珍珠巖=1:1的混合基質，有機質含量0.82%、可溶性氮含量24.46%、速效磷含量15.97 mg/L、速效鉀含量47.91 mg/L，pH 7.15，基質經高溫高壓(121℃，2 h)蒸汽滅菌后晾干7天后使用。

瓶內未接種的組培苗在移栽上盆時，先在盆中裝入1/3～1/2的基質，然后把AMF菌劑鋪上，放上植株，舒展根系使之與菌劑全面接觸，再填上基質。接種AMF菌種 1#Glomusgeosporum（簡稱 Gg）、菌種2#Glomusmosseae（簡稱Gm）及菌種1#和2#等比例混合的Glomusgeosporum+Glomusmosseae（簡稱Gg+Gm），其中不同接種劑用量以含相同孢子數(shù)量為原則來設計，每缽接種2～4 g菌劑，對照(CK)處理每缽加入等重的經121℃滅菌2 h的相應河沙。分別于移栽后1個月、2個月和6個月統(tǒng)計成活率。

1.2.3 菌根侵染指標測定 按照文獻[29-30]的墨水醋染色法進行根段染色制片，按Abbott[31]的方法測定菌絲長度，在Olympus顯微鏡100～400倍下觀察各制片中根段菌根的侵染情況，根據(jù)每條根系菌根結構的多少，按表1的分級標準記錄并計算。

表1 菌根侵染分級標準

式中，n5表示5級侵染的根段數(shù)，n4表示4級侵染的根段數(shù)，n3表示3級侵染的根段數(shù)，以此類推。

1.2.4 統(tǒng)計分析 采用DPS專業(yè)版統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，并采用Duncan進行多重比較和方差分析。

2 結果與分析

2.1 組培苗的瓶內AMF接種時期選擇

本研究采用董昌金[28]的差別滅菌法進行AMF孢子表面滅菌，然后分別對牡丹組培苗進行瓶內接種AMF。由表2得出，‘烏龍捧盛’根長2 cm以上的組培苗接種AMF，其侵染率、侵染強度、生根率、平均根長和平均根數(shù)均極顯著地高于其他處理，根長和根數(shù)分別比對照增長了49.29%和46.99%；對已經完成根誘導的組培苗的生根率和根的生長量有顯著的增效作用，其生根率比對照提高了18.27個百分點、根長增加了26.67%、根數(shù)增加了26.16%；對未完成根誘導的組培苗的生根無效，AMF不能促進不定根的誘導。

表2 ‘烏龍捧盛’休眠芽組培苗瓶內接種AMF時期選擇

由表3可看出，給‘Z1-10-3’不同生長階段的胚根苗接種AMF，其侵染率和侵染強度均極顯著(P=0.01)高于對照，各階段的胚根苗未接種AMF的對照均沒有侵染，胚根苗Ⅰ、胚根苗Ⅱ、胚根苗Ⅲ接種AMF的侵染率分別為35.23%、67.20%和90.25%，侵染強度分別為9.21、18.05和30.33，它們之間存在極顯著差異，其中根長≥2.0 cm的胚根苗Ⅲ此時期接種AMF的侵染率和侵染強度最高，極顯著優(yōu)于其他處理。因此，選擇該時期接種效果最好。

表3 ‘Z1-10-3’胚培養(yǎng)苗瓶內接種AMF時期選擇

2.2 瓶內接種不同種類AMF對牡丹組培苗菌根侵染的影響

菌根真菌對宿主植物雖然沒有表現(xiàn)出嚴格的專一性，但卻對宿主植物具有一定的選擇性[6]。由表4得出，‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’組培苗瓶內接種AMF均能實現(xiàn)侵染，而未接種的對照均沒有侵染；另外，不同品種的組培苗瓶內接種同一種AMF，其侵染率和侵染強度不同，而同一品種接種不同種類的AMF，其侵染率和侵染強度也不同。對于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接種的侵染率最高，達93.12%，極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm，同時Gm的侵染率也極顯著地高于Gg的侵染率(65.45%)；Gg+Gm的侵染強度最高為31.23，與Gm之間沒有顯著性差異，但均極顯著高于Gg和對照。

表4 AMF種類對牡丹組培苗菌根侵染的影響

對于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率和侵染強度最高，分別為95.96%和33.33，均極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm，Gg的侵染率和侵染強度均極顯著地大于Gm。與‘Z1-10-3’的表現(xiàn)相反?！疄觚埮跏ⅰ臃NGg的侵染率和侵染強度均最高，與Gg+Gm之間沒有顯著性差異，但極顯著大于Gm處理和對照；Gm的處理極顯著優(yōu)于對照。

以上試驗發(fā)現(xiàn)，不同的AMF對不同牡丹品種的侵染率和侵染強度存在顯著性差異。AM菌根是牡丹上普遍存在的現(xiàn)象，AM菌根的自然侵染率因品種、立地條件而異，在牡丹根圍發(fā)現(xiàn)Glomus屬大量存在，是牡丹的優(yōu)勢菌種，其中地球囊霉Glomusgeosporum和摩西球囊霉Glomusmosseae的寄主牡丹品種為‘鳳丹’、‘烏龍捧盛’、‘洛陽紅’和‘趙粉’等[8]。試驗發(fā)現(xiàn)雜交牡丹‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’也表現(xiàn)出了對AMF較高的侵染率和侵染強度，它們與混合菌種的共生關系最強。

2.3 AMF對牡丹組培苗移栽成活率的影響

從表5得出，接種AMF可以提高牡丹組培苗的移栽成活率，尤其是提高移栽初期的成活率，在移栽1個月時，瓶內提前接種侵染的組培苗移栽成活率最高達91.08%，極顯著(P=0.01)高于移栽時接種處理的成活率66.28%，因為移栽初期AMF侵染根系需要一定時間，在此之前沒有菌根的幫助成活率降低；移栽時接種AMF的處理又極顯著高于對照；在2個月和6個月時其變化趨勢基本一致，但在后期對成活率的降低有所減緩，在移栽生長6個月時，瓶內接種侵染之后移栽的、移栽時接種的和對照其成活率分別為86.16%、63.36%和40.28%，它們之間存在極顯著差異；瓶內接種AMF的組培苗移栽生長6個月時其成活率比對照提高了45.88個百分點。

表5 接種AMF對牡丹組培苗移栽成活率的影響

3 結論

（1）瓶內接種AMF能有效地完成侵染過程，最佳接種時期是組培苗根長≥2.0 cm時接種?！疄觚埮跏ⅰL2 cm以上的組培苗接種AMF，其侵染率、侵染強度最高，極顯著高于其他處理，分別比對照增長49.3%和39.4%；在未完成根誘導狀態(tài)下接種AMF無效，AMF不能促進不定根的誘導，但對已經完成根誘導的組培苗的生根率和根的生長量有顯著的增效作用?！甖1-10-3’胚根苗Ⅲ（根長≥2.0 cm）接種AMF(Gm)的侵染率均極顯著優(yōu)于胚根苗Ⅱ（0.5 cm≤根長≤1.0 cm）、胚根苗Ⅰ（根長≤0.5 cm）和對照。同時在試驗中10天內就觀測到了AM菌根的侵染。

（2）瓶內不同種類AMF接種對組培苗AMF侵染有顯著的影響。對于‘Z1-10-3’，Gg+Gm的混合孢子接種的侵染率最高，達93.12%，極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm；其侵染強度也最高(31.23)，但與Gm之間沒有顯著差異，均極顯著高于Gg和對照。對于‘Z1-WM’，Gg+Gm的侵染率和侵染強度最高，均極顯著(P=0.01)高于單一接種劑Gg和Gm，Gg的侵染率和侵染強度均極顯著大于Gm，與‘Z1-10-3’的表現(xiàn)相反?！疄觚埮跏ⅰ臃NGg的侵染率和侵染強度均與Gg+Gm之間沒有顯著差異，但極顯著大于Gm處理和對照。

（3）接種AMF且盡早接種更有利于提高移栽成活率，在移栽6個月時，瓶內接種AMF的比不接種AMF的對照提高成活率45.88個百分點。在移栽生長6個月時統(tǒng)計，瓶內接種AMF侵染之后移栽的、移栽時接種AMF的和對照CK，其成活率分別為86.16%、63.36%和40.28%。

4 討論

組織培養(yǎng)是在無菌條件下進行的，因而種苗與菌根真菌接觸的機會大為減少，甚至到了苗圃馴化培育階段也還常得不到菌根真菌的幫助，導致苗木生長狀況較差，成活率較低[9]。同時，由于在人工控制的條件下長期培養(yǎng)或由于培養(yǎng)基中外源激素的加入，組培苗喪失了調節(jié)生長素和細胞分裂素代謝的能力，這種代謝干擾在組培苗出瓶后繼續(xù)存在[32]。本試驗對牡丹組培苗瓶內接種后移栽和移栽時接種AMF，發(fā)現(xiàn)其能順利實現(xiàn)侵染，接種AMF且盡早（瓶內）接種AMF更有利于提高移栽成活率，比不接種對照提高成活率45.88個百分點，與盡早對組培苗進行高效菌根真菌的人工接種、實現(xiàn)種苗菌根化、減輕移栽對組培苗造成的脅迫、提高組織培養(yǎng)苗的移栽成活率[9,33]的結論一致。

本試驗發(fā)現(xiàn)，組培苗根長2 cm以上時為AMF接種的最佳時機，這可能是根的發(fā)育狀態(tài)對AMF的侵染敏感性有影響。未完成根誘導狀態(tài)下接種AMF無效，AMF不能促進不定根的誘導，但對已經完成根誘導的組培苗的生根率和根的生長量有顯著的增效作用，其生根率比對照提高了18.27個百分點，因為AM菌根是根系與AMF建立的共生體，沒有根系缺少寄主，共生關系將無法建立。

本試驗發(fā)現(xiàn)，不同牡丹品種對AMF的專一性選擇不同，‘烏龍捧盛’接種Gg的侵染率和侵染強度均最高，‘Z1-10-3’、‘Z1-WM’的Gg+Gm處理侵染率和侵染強度最高，Gg對‘Z1-WM’比Gm強，而‘Z1-10-3’的表現(xiàn)相反。這可能與不同牡丹品種的優(yōu)勢菌種不同有關。同時，AMF侵染根系提高了組培苗的移栽成活率，促進了生長發(fā)育和礦質營養(yǎng)元素的吸收，縮短了育苗進程，與前人研究[27,34-36]結論一致。

AM真菌在工廠化育苗、抗旱和抗病等抗性方面的功能和促進高產穩(wěn)產等方面具有較大的發(fā)展優(yōu)勢[26,37]。AM真菌在牡丹菌根化組培苗育苗和生產栽培上的應用大有潛力，希望擴大牡丹供試品種范圍、優(yōu)化AM真菌接種劑組合，進一步研究AM真菌對牡丹組培苗的生長發(fā)育的影響及其作用機理。