ADRB2基因調(diào)控區(qū)多態(tài)性與兒童哮喘易感性的相關(guān)性研究

蔡明軒 魏兵 廖世峨 付金月 劉亞軍 李令雪

（中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，遼寧沈陽110016）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的異質(zhì)性疾病，也是兒童時(shí)期最常見的慢性氣道疾病之一［1］。哮喘的患病率呈逐年上升趨勢，我國兒童哮喘發(fā)病率從1990年的0.91%至2010年的3.02%［2-3］，近二十年間“翻了兩番”。2013年，一項(xiàng)國際研究發(fā)現(xiàn)6～7歲和13～14歲兒童哮喘的患病率已分別達(dá)到11.7%和14.1%［4］。哮喘已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，然而哮喘的發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為哮喘是由基因與環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用導(dǎo)致的多基因遺傳性疾病。越來越多的研究集中于哮喘的分子生物學(xué)和遺傳學(xué)上，預(yù)知基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）/單倍型與兒童哮喘易感性相關(guān)的研究成為熱點(diǎn)領(lǐng)域。

染色體5q31-q33是與哮喘有關(guān)的主要基因座之一，β2腎上腺素受體（β2-drenergic receptor，ADRB2）基因是一個(gè)由1 239個(gè)核苷酸組成的無內(nèi)含子區(qū)，其位于5q31-q32的哮喘易感片段內(nèi)［5］。該基因大部分功能性啟動子位于ATG起始密碼子上游549 bp片段內(nèi)，該片段呈現(xiàn)多種遺傳多態(tài)性［6］。目前，對ADRB2基因SNP與哮喘的相關(guān)性研究多是位于編碼區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的研究，對ADRB2基因調(diào)控區(qū)SNP研究較少。單個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)作為疾病遺傳學(xué)指標(biāo)有一定的局限性，單倍型的分析比單個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)更適合哮喘表型的相關(guān)研究，國內(nèi)外有關(guān)ADRB2調(diào)控區(qū)單倍型與兒童哮喘表型的研究未見報(bào)道。我們擬研究中國東北地區(qū)漢族兒童ADRB2基因調(diào)控區(qū)rs11168070（-468C/G）、rs17108803（-839T/G）、rs2053044（-1023G/A）、rs12654778（-654G/A）、rs11959427（-367T/C）、rs2895795（-1429T/A）位點(diǎn)SNP/單倍型與兒童哮喘易感的關(guān)系，從而進(jìn)一步探索兒童哮喘的發(fā)病機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象

本研究為前瞻性研究，選取2016年10月至2020年10月就診于本院的哮喘急性發(fā)作期患兒152例，去除信息填寫不詳者9例，共納入143例為哮喘組，均符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］。入組年齡5～12歲，平均年齡（7.1±1.4）歲；女52例，男91例。根據(jù)哮喘急性發(fā)作嚴(yán)重度分為輕度組61例，中重度組82例。對照組兒童選取同期于我院兒童保健診室體檢的健康兒童137例，年齡5～12歲，平均年齡（7.2±1.6）歲；女54例，男83例。所有入組兒童均為東北地區(qū)漢族兒童，三代內(nèi)無血緣關(guān)系，入組前4周無呼吸道感染史。哮喘組和對照組兒童年齡（t=0.781，P=0.435）和性別（χ2=0.277，P=0.599）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)［倫審Y（2020）054號］，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

應(yīng)用在線Primer3軟件設(shè)計(jì)引物，延伸引物用于單堿基延伸，引物信息見表1。

表1 引物信息

1.3 DNA提取

收集兩組受檢兒童靜脈血2 mL于EDTA抗凝管，存于-80℃冰箱待檢。DNA提取采用TIANGEN公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）。

1.4 目的基因SNP分型

采用SNaPshot SNP技術(shù)，對ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行等位基因的檢測，行三重PCR擴(kuò)增，取0.5 μL純化后的延伸產(chǎn)物，與0.5 μL片段化分析標(biāo)準(zhǔn)品及9 μL高度去離子甲酰胺混勻，于95℃變性5 min后放置于ABI3730XL測序儀上進(jìn)行測序，ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)電泳峰型見圖1～6，箭頭所指即為基因型所在位置，單個(gè)箭頭為純合型，兩個(gè)箭頭為雜合型。

圖1 rs2053044位點(diǎn)電泳峰型圖 A為GG基因型；B為GA基因型；C為AA基因型。

圖2 rs2895795位點(diǎn)電泳峰型圖 A為AA基因型；B為TA基因型；C為TT基因型。

圖3 rs12654778位點(diǎn)電泳峰型 A為GG基因型；B為GA基因型；C為AA基因型。

圖4 rs11168070位點(diǎn)電泳峰型圖 A為CC基因型；B為CG基因型；C為GG基因型。

圖5 rs11959427位點(diǎn)電泳峰型圖 A為TT基因型；B為TC基因型；C為CC基因型。

圖6 rs17108803位點(diǎn)電泳峰型圖 A為TT基因型；B為GT基因型。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)；應(yīng)用二元logistic回歸分析ADRB2基因6個(gè)位點(diǎn)SNP/單倍型與哮喘相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。連鎖不平衡及單倍型分析采用Haploview軟件。運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)以驗(yàn)證入組樣本的群體代表性，P＞0.05為群體代表性好。

2 結(jié)果

2.1 兩組群體代表性

應(yīng)用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)檢測兩組rs11168070、rs17108803、rs2053044、rs12654778、rs11959427、rs2895795位點(diǎn)的基因型頻率，哮喘組P值分別為1.000、1.000、0.448、0.448、1.000、0.377，對 照 組P值 分 別 為1.000、0.192、0.826、1.000、1.000、1.000，兩組研究樣本符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體代表性好。

2.2 ADRB2基因6個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因在哮喘組和對照組中的分布

rs2895795、rs2053044和rs12654778位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在兩組兒童中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），rs11168070、rs17108803和rs11959427位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在兩組兒童中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。進(jìn)一步經(jīng)二元logistic回歸分析顯示，rs2895795、rs2053044和rs12654778位點(diǎn)中攜帶A等位基因者患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)OR分 別 為0.443（95%CI：0.259～0.756）、2.124（95%CI：1.232～3.661）和2.087（95%CI：1.260～3.457）（表2）。

表2 ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因在兩組中的分布及l(fā)ogistic回歸分析［n（%）］

2.3 ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)基因型與兒童哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)系

6個(gè)位點(diǎn)基因型在哮喘輕度組和中重度組分布的分析顯示，rs2895795和rs11168070位點(diǎn)基因型在病情嚴(yán)重程度組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；rs2053044、rs12654778、rs17108803和rs11959427位點(diǎn)基因型在輕度組和中重度組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)基因型與兒童哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)系［n（%）］

2.4 ADRB2基 因 調(diào) 控 區(qū)rs2895795、rs2053044、rs17108803、rs12654778、rs11168070、rs11959427組成的單倍型分布與兒童哮喘的關(guān)系

經(jīng)Haploview軟件分析發(fā)現(xiàn)，哮喘組和對照組兒童ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)間均存在連鎖不平衡，連鎖強(qiáng)度見圖7，共構(gòu)成5種單倍型（表4），哮喘組中頻率最高的是TGTACT（42.7%）。單倍型TATGCT、TATGGC和AGTGCT的頻率在哮喘組和對照組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別χ2=6.554、5.403、11.297，均P＜0.05）；通過二元logistic回歸分析結(jié)果顯示，其中單倍型TATGCT和TATGGC患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)OR分別為1.792（95%CI：1.142～2.812，P＜0.05）和1.946（95%CI：1.102～3.438，P＜0.05）；單倍型AGTGCT患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)OR為0.523（95%CI：0.357～0.765，P＜0.05）。

表4 ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)單倍型與哮喘的logistic回歸分析［n（%）］

圖7 連鎖不平衡強(qiáng)度圖 白色小方框中數(shù)值為連鎖不平衡系數(shù)（D'）的百分?jǐn)?shù)，數(shù)值越大表示連鎖性越強(qiáng)，沒有數(shù)值表示D'=1，代表完全連鎖不平衡。數(shù)字1、3、4、5、6、7代表位點(diǎn)在基因片段上所在位置順序。

2.5 ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)單倍型在哮喘嚴(yán)重程度組中的分布

單倍型TATGCT和AGTGCT頻率在輕度組和中重度組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別χ2=6.075、4.858，均P＜0.05），其中單倍型TATGCT在中重度組分布頻率較輕度組高，為輕度組的1.885倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.075，P＜0.05）；單倍型AGTGCT在輕度組分布頻率較中重度組高，為中重度組的1.671倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.858，P＜0.05）；單倍型TATGGC、AGGGCT和TGTACT分布頻率在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表5 ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)單倍型在哮喘不同嚴(yán)重程度中的分布［n（%）］

3 討論

哮喘是一種病因復(fù)雜具有異質(zhì)性的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制被認(rèn)為是全球性醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)問題。伴隨研究的逐漸深入，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為哮喘是由遺傳因素和環(huán)境因素長期相互作用所致，其中遺傳因素約占48%～79%［7-8］。Khan等［9］針對雙胎和有兄弟姐妹的家庭進(jìn)行研究，結(jié)果顯示哮喘的遺傳方式不遵循孟德爾遺傳學(xué)定律，表現(xiàn)為家庭聚集的趨勢。ADRB2在肺組織、支氣管平滑肌細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中高度表達(dá)并調(diào)節(jié)肺功能，ADRB2基因SNP/單倍型可以改變ADRB2的功能［10-13］。ADRB2基因5’調(diào)控區(qū)內(nèi)含開放性閱讀框架，編碼ADRB2基因上游啟動子區(qū)的一個(gè)多肽，已證明該區(qū)域有個(gè)常見的SNP，即-47位點(diǎn)上的C突變?yōu)門，導(dǎo)致編碼的第19位精氨酸變?yōu)榘腚装彼幔?4］。

本研究分析ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)位點(diǎn)SNP與兒童哮喘易感性的關(guān)系，rs2895795位點(diǎn)檢測出TT、TA和AA 3種基因型，與Cai等［15］研究新疆哈薩克族和維吾爾族人群ADRB2調(diào)控區(qū)基因多態(tài)性結(jié)果一致，其中AA基因型在哮喘組中明顯低于對照組，提示rs2895795位點(diǎn)SNP與兒童哮喘易感相關(guān)，次等位基因A降低兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)，是兒童哮喘易感的保護(hù)性因素，我們推測可能由于次等位基因A參與了正向調(diào)節(jié)ADRB2基因啟動子活性，使ADRB2活性及表達(dá)增加。本研究rs2053044位點(diǎn)檢測出G和A兩種等位基因，次等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）在哮喘組和對照組兒童中有明顯差異，攜帶次等位基因A且為AA基因型時(shí)兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增高，提示次等位基因A與兒童哮喘易感相關(guān)，是兒童哮喘的危險(xiǎn)因素，與Skouen等［16］的研究結(jié)果相似，但de Souza Tesch等［17］對巴西人群ADRB2基因rs2053044位點(diǎn)SNP分析時(shí)未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)SNP改變ADRB2基因的表達(dá)，考慮結(jié)論差異可能與地域因素有關(guān)。本研究中rs17108803位點(diǎn)只檢測出TT和GT兩種基因型，未檢測到GG基因型，TT和TG基因型頻率在哮喘組和對照組分布無差異，提示該位點(diǎn)SNP與兒童哮喘易感不相關(guān)。rs12654778位于ADRB2基因上游654 bp處，存在GG、GA和AA 3種基因型，MAF分布在哮喘組和對照組兒童中有顯著差異，與Li等［18］研究結(jié)論相似，本研究提示rs12654778位點(diǎn)SNP與兒童哮喘易感相關(guān)，攜帶次等位基因A且為AA基因型時(shí)兒童患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)增高。rs11168070位點(diǎn)有CC、CG、GG 3種基因型，分析得出該位點(diǎn)SNP與兒童哮喘易感不相關(guān)，Sio等［19］研究316名亞洲人群中發(fā)現(xiàn)rs11168070位點(diǎn)G等位基因增強(qiáng)了ADRB2的表達(dá)，這與研究結(jié)果不一致，考慮可能與種族差異和樣本量大小有關(guān)。本研究rs11959427位點(diǎn)共檢測出TT、CT和CC 3種基因型，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)SNP與兒童哮喘易感相關(guān)。

本研究顯示rs2895795和rs11168070位點(diǎn)SNP在輕度組和中重度組有明顯差異，表明上述2個(gè)位點(diǎn)與哮喘病情嚴(yán)重程度相關(guān)。這與Ramphul等［20］關(guān)于毛里求斯、印度和中國3個(gè)不同地域的385名哮喘兒童ADRB2基因調(diào)控區(qū)SNP影響ADRB2啟動子的活性導(dǎo)致該基因差異性表達(dá)的研究結(jié)果相似。但不同的是，陳慧芬等［21］研究未發(fā)現(xiàn)ADRB2基因多態(tài)性位點(diǎn)與哮喘病情嚴(yán)重程度有關(guān)。一項(xiàng)基于歐洲人群的多中心縱向隊(duì)列研究通過隨訪604名哮喘患兒10年發(fā)現(xiàn)ADRB2基因SNP與哮喘病情嚴(yán)重程度有關(guān)［22］。本研究中rs11168070位點(diǎn)SNP與兒童哮喘易感不相關(guān)，進(jìn)一步分析時(shí)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)SNP與兒童哮喘病情程度相關(guān)，考慮該位點(diǎn)可能參與了某種未知的機(jī)制，從而改變了ADRB2基因的表達(dá)。本研究并未發(fā)現(xiàn)rs11959427、rs17108803、rs12654778和rs2053044位點(diǎn)SNP與哮喘病情程度有關(guān)。

連鎖不平衡又稱為等位基因關(guān)聯(lián)，是指同一條染色體上的兩個(gè)等位基因非隨機(jī)相關(guān)。目前對單倍型的研究較少，中國人群和其他種族人群之間與哮喘易感性有關(guān)的單倍型頻率存在差異［23-24］。一項(xiàng)針對墨西哥人群中421名哮喘兒童和430名健康兒童的病例對照研究發(fā)現(xiàn)ADRB2基因AGGACC、AGGAAG、TGAGAG、AGGAAC和AAGGAG單倍型與兒童時(shí)期哮喘易感性有關(guān)［25］。Liu等［26］基于中國漢族人群ADRB2基因研究得出單倍型CCGGC促進(jìn)了哮喘發(fā)生的結(jié)論。Akparova等［27］在哈薩克族人群中分析ADRB2基因16和27多態(tài)性位點(diǎn)組成的單倍型時(shí)發(fā)現(xiàn)Arg16Gly/Gln27Gln和Arg16Gly/Gln27Glu單倍型在哈薩克族哮喘患者中更為常見。Chung等［28］針對2 979例白種人的病例對照研究顯示ADRB2基因上11個(gè)位點(diǎn)中有3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)存在連鎖不平衡，構(gòu)成的單倍型ATA和AGG與哮喘易感性有關(guān)。Tian等［29］對298例哮喘兒童和304例健康兒童研究發(fā)現(xiàn)ADRB2基因47和79位點(diǎn)SNP構(gòu)成的單倍型可能增加兒童哮喘的易感性。Shah等［30］研究112例南印度人群ADRB2基因SNP與哮喘的發(fā)生時(shí)發(fā)現(xiàn)GGCG單倍型致哮喘的發(fā)生增加了3.1倍，GGCG單倍型與哮喘風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。本研究對ADRB2基因調(diào)控區(qū)6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)成的單倍型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)單倍型TATGCT、TATGGC和AGTGCT與兒童哮喘易感相關(guān)，其中單倍型TATGCT是兒童哮喘的危險(xiǎn)因素，且TATGCT者患中重度哮喘較多，單倍型AGTGCT是兒童哮喘的保護(hù)因素，進(jìn)一步分析病情程度時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶AGTGCT單倍型者患哮喘的程度較輕，表明TATGCT和AGTGCT與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)。

ADRB2基因多態(tài)性廣泛存在于不同地域、不同種族人群中，其變異的復(fù)雜性和潛在性可能決定著哮喘的大量或部分表型，本研究發(fā)現(xiàn)ADRB2基因調(diào)控區(qū)SNP/單倍型與中國東北地區(qū)兒童哮喘易感性相關(guān)，其構(gòu)成的單倍型TATGCT和TATGGC是兒童哮喘的危險(xiǎn)因素，為探討中國哮喘遺傳機(jī)制提供了循證醫(yī)學(xué)依據(jù)。但本研究樣本量相對較小，需加大樣本量做進(jìn)一步研究。此外，本研究僅檢測了ADRB2基因調(diào)控區(qū)的6個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，并未對其他位置多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析和完整單倍型的研究，其他位置可能存在某些具有功能性的多態(tài)性位點(diǎn)，多基因聯(lián)合研究對哮喘遺傳機(jī)制的揭示有重要的意義，或許可成為以后的研究方向。