基于流式細(xì)胞術(shù)的可測量殘留病對(duì)兒童急性髓系白血病預(yù)后意義的前瞻性研究

霍婭 管賢敏 竇穎 溫賢浩 郭玉霞 沈亞莉 安曦洲 于潔

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院血液腫瘤科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心/兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400014）

兒童急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤性疾病。目前整體長期無事件生存（event-free survival，EFS）率僅為40%～60%［1］。兒童AML的早期治療反應(yīng)評(píng)估是決定預(yù)后的重要因素。既往對(duì)治療反應(yīng)的評(píng)估主要基于骨髓細(xì)胞學(xué)是否達(dá)到完全緩解（complete relief，CR）。然而，AML患兒經(jīng)化療或異基因造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell transplantation，HSCT）治療后，雖然骨髓形態(tài)學(xué)達(dá)到CR狀態(tài)，但仍可檢測到持續(xù)存在并可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)的白血病細(xì)胞群。可測量殘留?。╩easurable residual disease，MRD），既往也被稱作微小殘留病，能在更精確的水平上為AML治療反應(yīng)評(píng)估提供更精準(zhǔn)的信息，具有更高的預(yù)后價(jià)值［2-3］。

近年來，國際上多個(gè)兒童AML協(xié)作組針對(duì)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multiparameter flow cytometry，MFC）監(jiān)測MRD進(jìn)行相關(guān)研究，均證實(shí)MRD對(duì)預(yù)測預(yù)后有重要價(jià)值［1，4-6］。同時(shí)有更多的研究報(bào)道了基于MRD為導(dǎo)向的風(fēng)險(xiǎn)分層治療方案及結(jié)果，但目前尚無確切結(jié)果顯示這一分層措施是否能改善MRD陽性患兒的預(yù)后［7-8］。國內(nèi)已報(bào)道的兒童AML文獻(xiàn)中，尚無以MRD作為風(fēng)險(xiǎn)分層因素的相關(guān)研究。因此本中心自2015年開始，借鑒美國兒童腫瘤學(xué)組-兒童AML化療方案的基本框架［9］，制定了2015-AML-03方案。該方案中利用MFC動(dòng)態(tài)監(jiān)測MRD，將MRD水平作為評(píng)估治療反應(yīng)和風(fēng)險(xiǎn)分層的指標(biāo)。截至2019年10月，該方案前瞻性地納入93例接受治療的AML患兒，本研究將重點(diǎn)分析該組AML患兒治療過程中MRD的預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

從2015年1月至2019年10月，本研究共納入93例AML患兒，均符合下列診斷標(biāo)準(zhǔn)：骨髓原始細(xì)胞≥20%，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)染色及免疫學(xué)標(biāo)志符合髓系特點(diǎn)［10］。根據(jù)法美英（French-Ameri‐can-British，F(xiàn)AB）分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行形態(tài)學(xué)分型，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)及分子遺傳學(xué)檢測。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）初診年齡0～18歲；（2）初診AML；（3）納入2015-AML-03方案接受規(guī)律治療。排除急性早幼粒細(xì)胞白血病、AML合并唐氏綜合征或其他惡性腫瘤、骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syn‐drome，MDS）相關(guān)AML、先天性白血病及失訪患兒。本研究獲重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［（2021）年倫審（研）第（101）號(hào)］，所有患兒監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 MRD檢測方法

采用MFC監(jiān)測骨髓MRD（北京康圣環(huán)球公司）。所有標(biāo)本在初診時(shí)尋找確定的白血病相關(guān)免疫 表 型（leukemia associated immunophenotype，LAIPs）特定標(biāo)記，若無合適LAIPs標(biāo)記，則監(jiān)測標(biāo)本中與正常人不同的任何免疫表型（different from normal，DfN）。初診時(shí)有標(biāo)記的標(biāo)本，MRD陽性定義為每1 000個(gè)骨髓有核細(xì)胞中出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)白血病細(xì)胞（≥0.1%）；初診時(shí)無標(biāo)記的標(biāo)本，MRD陽性定義為白血病細(xì)胞≥0.01%［11］。分別在初診、誘導(dǎo)治療Ⅰ、誘導(dǎo)治療Ⅱ及強(qiáng)化治療Ⅰ后和HSCT前后進(jìn)行骨髓及骨髓MRD檢查，評(píng)估患兒治療反應(yīng)。

1.3 2015-AML-03診療方案

初診時(shí)通過細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征將患兒分為低危、中危、高危3個(gè)組別，其中合并t（8；21）-AML1/ETO、inv（16）/t（16；16）-CBFβ/MYH11、CEBPA突變不伴FLT3-ITD、NPM1/IDH突變不伴FLT3-ITD為低危；合并t（6；9）、t（8；16）、t（6；21）、-7/7q-、-5、inv（3）/t（3；3）-RPN1/EVI1、FLT3-ITD突變?yōu)楦呶?；非低危及高危者為中危?2］。

93例患兒均接受2015-AML-03方案化療（圖1）。在誘導(dǎo)治療Ⅰ結(jié)束后（第28天）進(jìn)行骨髓評(píng)估，根據(jù)骨髓形態(tài)學(xué)及MFC-MRD結(jié)果重新調(diào)整風(fēng)險(xiǎn)分層：若骨髓形態(tài)學(xué)達(dá)到CR（定義為骨髓正常造血恢復(fù)，原始細(xì)胞＜5%，無髓外白血病，外周血中性粒細(xì)胞絕對(duì)值＞1×109/L，血小板＞80×109/L，不依賴紅細(xì)胞輸注）且MRD陰性，則不調(diào)整風(fēng)險(xiǎn)分層；若骨髓形態(tài)學(xué)未達(dá)到CR和/或MRD陽性，則升級(jí)風(fēng)險(xiǎn)分層（即低?；純荷?jí)為中危，中?；純荷?jí)為高危）。調(diào)整后不同風(fēng)險(xiǎn)分層患兒接受不同方案及強(qiáng)度化療，其中找到合適供者的中高?；純涸趶?qiáng)化治療Ⅰ后接受HSCT［12］。

圖1 2015-AML-03治療方案 ［誘導(dǎo)治療Ⅰ-ADE］阿糖胞苷200 mg/(m2·d)×10 d+柔紅霉素50 mg/(m2·d)×3 d+依托泊苷100 mg/(m2·d)×5 d；［誘導(dǎo)治療Ⅱ-ADE］阿糖胞苷200 mg/(m2·d)×8 d+柔紅霉素50 mg/(m2·d)×3 d+依托泊苷100 mg/(m2·d)×5 d；［AM］阿糖胞苷2 g/(m2·d)×4 d+米托蒽醌12 mg/(m2·d)×4 d/去甲氧柔紅霉素10 mg/(m2·d)×2 d；［AE］阿糖胞苷2 g/(m2·d)×5 d+依托泊苷150 mg/(m2·d)×5 d；［AL］阿糖胞苷6 g/(m2·d)×4 d+左旋門冬酰胺酶6 000 U/m2×2 d（阿糖胞苷后42 h使用）；［LR］低危；［IR］中危；［HR］高危；［BM］骨髓細(xì)胞學(xué)；［MRD］可測量殘留病。因部分患兒未找到合適供者，無法按期行HSCT；誘導(dǎo)治療Ⅰ及強(qiáng)化治療Ⅰ后5例移植患者未納入強(qiáng)化治療Ⅰ后風(fēng)險(xiǎn)分層。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

OS定義為從入組之日起至因任何原因死亡為止。EFS指從入組之日起直至治療失敗、疾病復(fù)發(fā)或因任何原因死亡。CIR定義為從入組之日起至治療失敗或復(fù)發(fā)。持續(xù)緩解、生存的患兒以最后一次隨訪時(shí)間（2021年3月1日）為截點(diǎn)。非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)（范圍）表示，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)，生存率的比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用Cox回歸模型分析影響CIR率、EFS率和OS率的因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒臨床特征

93例AML患兒中，中位初診年齡5.5（范圍：0.6～14.3）歲，中位初診WBC計(jì)數(shù)18.15（范圍：0.85～305.09）×109/L；59例（63%）患兒在初診時(shí)檢測到LAIPs標(biāo)記。初診時(shí)低危者48例（52%），中高危者45例（48%）；誘導(dǎo)治療Ⅰ后調(diào)整為低危者32例（34%），中高危者61例（66%）。93例患兒中共有29例（31%）接受了HSCT，誘導(dǎo)治療Ⅱ后移植1例，強(qiáng)化治療Ⅰ后移植3例，強(qiáng)化治療Ⅱ后移植12例，治療失敗（治療失敗定義為誘導(dǎo)治療Ⅱ后連續(xù)兩次骨髓細(xì)胞學(xué)均≥5%）移植2例，復(fù)發(fā)后移植11例。其他初診時(shí)臨床特征見表1。

表1 93例AML患兒的臨床特征［例（%）］

2.2 生存與復(fù)發(fā)

93例AML患兒的中位隨訪時(shí)間為30（范圍：5～63）個(gè)月，治療反應(yīng)評(píng)估的主要終點(diǎn)為3年EFS率、OS率，次要終點(diǎn)為3年CIR率。93例患兒中，3例（3%）治療失敗，其中2例死亡，1例存活。39例（42%）患兒復(fù)發(fā)，中位復(fù)發(fā)時(shí)間是11（范圍：2～32）個(gè)月，3年CIR率為（48±6）%。本組死亡患兒共30例（32%），復(fù)發(fā)死亡27例（29%），其中有4例為移植后復(fù)發(fā)死亡；另外3例死亡原因?yàn)橹委熯^程中合并感染和出血。3年OS率為（65±6）%，3年EFS率為（50±5）%。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)MRD的對(duì)預(yù)后的影響

誘導(dǎo)治療Ⅰ后MRD陽性患兒32例（34%），其3年EFS率和OS率低于MRD陰性患兒，3年CIR率高于MRD陰性患兒（P＜0.05），見表2。

低危組和中高危組患兒的3年CIR率、EFS率及OS率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。將93例患兒中誘導(dǎo)治療Ⅰ后根據(jù)MRD及骨髓形態(tài)學(xué)調(diào)整為中危的16例患兒與始終為低危的32例患兒進(jìn)行預(yù)后比較，其3年CIR率、EFS率及OS率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

93例患兒中有89例在誘導(dǎo)治療Ⅱ后進(jìn)行了MFC-MRD評(píng)估，17例（19%）患兒MRD≥0.1%。MRD陽性患兒3年CIR率高于MRD陰性患兒，EFS率低于MRD陰性患兒（P＜0.05）；但兩組患兒3年OS率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

誘導(dǎo)治療Ⅰ后MRD陽性患兒3年CIR率高于MRD陰性患兒，3年EFS率、OS率低于MRD陰性患兒（P＜0.05）。32例MRD陽性患兒接受高強(qiáng)度化療，在誘導(dǎo)治療Ⅱ后轉(zhuǎn)陰19例（59%），持續(xù)陽性者13例（41%）。將兩次均陽性與誘導(dǎo)治療Ⅱ后轉(zhuǎn)陰的患兒進(jìn)行預(yù)后比較，其3年CIR率、EFS率和OS率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

強(qiáng)化治療Ⅰ后共79例患兒獲得了MRD結(jié)果，陽性患兒14例（18%）。MRD陽性患兒3年EFS率、OS率低于MRD陰性患兒，3年CIR率高于MRD陰性患兒（P＜0.05）。見表2。

常見初診臨床特征，包括年齡、WBC計(jì)數(shù)、遺傳學(xué)異常（CBF-AML、KIT突變、CEBPA突變等）及最終風(fēng)險(xiǎn)分層對(duì)3年CIR率、EFS率、OS率無影響（均P＞0.05），見表2。

表2 （續(xù)）

表2 93例AML患兒遠(yuǎn)期預(yù)后的單因素分析

2.4 93例AML患兒遠(yuǎn)期預(yù)后的多因素分析

以P＜0.3為納入標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)多因素分析顯示，初診年齡、KIT突變、CEBPA突變、CBF-AML、誘導(dǎo)治療Ⅱ后BM及強(qiáng)化治療Ⅰ后MRD是3年CIR率的影響因素（P＜0.05）；初診年齡、KIT突變、CBFAML及強(qiáng)化治療Ⅰ后MRD是3年EFS率的影響因素（P＜0.05）；強(qiáng)化治療Ⅰ后MRD陽性是3年OS率的獨(dú)立不良預(yù)后因素（P＜0.05）。見表3～5。

表3 93例AML患兒3年CIR率的多因素Cox分析

表4 93例AML患兒3年OS率的多因素Cox分析

表5 93例AML患兒3年EFS率的多因素Cox分析

3 討論

目前兒童AML的風(fēng)險(xiǎn)分層主要基于細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)因素。包括提示良好預(yù)后的t（8；21）-AML1/ETO、inv（16）/t（16；16）-CBFβ/MYH11、CEBPA突變、NPM1突變等和提示不良預(yù)后的t（6；9）、-7/7q-、-5、FLT3-ITD突變等［12］。

已有的各個(gè)兒童AML協(xié)作組方案在藥物劑量、新藥選擇及HSCT率等方面有所差異，但總體構(gòu)架類似：包括2個(gè)療程的誘導(dǎo)治療聯(lián)合2～3個(gè)療程的強(qiáng)化治療或HSCT。近年來，有許多新藥在兒童AML治療中開展臨床研究，如吉妥珠單抗（gemtuzumab ozogamicin，GO）、氟妥珠單抗、地西他濱、FLT3-ITD抑制劑索拉非尼等［13-15］。

基于優(yōu)化風(fēng)險(xiǎn)分層及治療方案的目標(biāo)，國內(nèi)外多個(gè)協(xié)作組已經(jīng)嘗試應(yīng)用更精確的風(fēng)險(xiǎn)分層方法，主要包括以MRD為基礎(chǔ)的風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)向治療。Rubnitz等［8］在AML02試驗(yàn)中報(bào)道了232例AML兒童基于MRD為導(dǎo)向的分層治療，根據(jù)誘導(dǎo)治療Ⅰ后的MRD結(jié)果，在MRD陽性組和陰性組患兒中分別采用聯(lián)合和不聯(lián)合GO的ADE（阿糖胞苷+柔紅霉素+依托泊苷）方案進(jìn)行誘導(dǎo)Ⅱ化療，結(jié)果顯示MRD陽性提示預(yù)后更差，分層后加強(qiáng)治療的總OS率（71%）并未得到顯著改善。關(guān)于移植策略的選擇，Zhu等［7］在國內(nèi)的AML05成人多中心試驗(yàn)中，利用PCR監(jiān)測AML1-ETO，接受2個(gè)療程誘導(dǎo)及鞏固治療后，將MRD陽性患者分組，接受HSCT的患者3年無病生存率高于僅接受化療的患者（61.7% vs 9.6%）。歐洲腫瘤治療研究組織（EORTC）白血病研究組和歐洲80個(gè)醫(yī)學(xué)研究中心（GIMEMA）的AML-10和AML-12試驗(yàn)結(jié)果也表明，中危組患兒可從MRD導(dǎo)向的移植策略選擇中獲益［16］。

本研究根據(jù)誘導(dǎo)治療Ⅰ后MRD及骨髓細(xì)胞學(xué)結(jié)果調(diào)整風(fēng)險(xiǎn)分層及治療，通過對(duì)初診時(shí)低危患兒是否根據(jù)MRD調(diào)整風(fēng)險(xiǎn)分層進(jìn)行預(yù)后比較顯示，初診時(shí)低危的MRD陽性患兒調(diào)整化療強(qiáng)度后，其3年OS率（63%±12% vs 73%±9%）、EFS率（49%±13%vs 55%±9%）與MRD陰性患兒類似，表明治療策略調(diào)整消除了MRD陽性導(dǎo)致的不良影響，提示誘導(dǎo)治療Ⅰ后MRD指導(dǎo)的風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)向治療可能改善預(yù)后，得出了與AML02試驗(yàn)相似的結(jié)論［8］。但3年EFS率和OS率（50%±5%、65%±6%）低于AML02試驗(yàn)（63%、71%）。導(dǎo)致這種差異的原因與多個(gè)因素相關(guān)：首先本方案中僅采用傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物；其次中高?；純阂驘o法匹配到合適的供者及經(jīng)濟(jì)條件等因素，無法按計(jì)劃進(jìn)行HSCT，使得最終復(fù)發(fā)前HSCT治療率為19%（18/93）；而AML02試驗(yàn)中在傳統(tǒng)化療藥物的基礎(chǔ)添加了分子靶向藥物GO，其中高?；純旱腍SCT率為37.8%［8］，顯著高于本研究，這些因素導(dǎo)致療效和預(yù)后的差異。

本研究采用標(biāo)準(zhǔn)ADE方案誘導(dǎo)化療，對(duì)于中高危者在誘導(dǎo)治療Ⅱ調(diào)整為AM（阿糖胞苷+米托蒽醌/去甲氧柔紅霉素）方案，最終結(jié)果顯示誘導(dǎo)治療Ⅰ及強(qiáng)化治療Ⅰ后MFC-MRD陽性均與更差的預(yù)后相關(guān)，而誘導(dǎo)治療Ⅱ后MRD對(duì)預(yù)后的預(yù)測價(jià)值相對(duì)較低。誘導(dǎo)治療Ⅰ后MRD陽性作為早期的治療反應(yīng)信息，反映了AML細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提示高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)后續(xù)治療強(qiáng)度的調(diào)整具有重要意義。而誘導(dǎo)治療Ⅱ后MRD狀態(tài)受到治療方案調(diào)整的影響，不能準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)后；且誘導(dǎo)治療Ⅰ后MRD陽性患者即使誘導(dǎo)治療Ⅱ后轉(zhuǎn)陰仍不能改善預(yù)后。

強(qiáng)化治療Ⅰ后MRD仍陽性的患兒有14例（18%），包括兩種情況：持續(xù)陽性、誘導(dǎo)治療Ⅱ或強(qiáng)化治療Ⅰ后轉(zhuǎn)陽；兩種情況均體現(xiàn)出高復(fù)發(fā)率。這提示晚期MRD結(jié)果仍是預(yù)測復(fù)發(fā)/難治性AML的有力因素，其對(duì)于指導(dǎo)強(qiáng)化后治療策略（如HSCT）選擇的重要意義在其他研究已經(jīng)得到證實(shí)［16-17］。

本研究多因素分析證實(shí)強(qiáng)化治療Ⅰ后MFCMRD是最有價(jià)值的獨(dú)立預(yù)后因素。在基于FAB分型、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)等的多變量分析中，MRD體現(xiàn)出更高的預(yù)后預(yù)測價(jià)值，為將MRD作為風(fēng)險(xiǎn)分層因素的相關(guān)研究提供了重要數(shù)據(jù)支持。

本研究中，在基于初診臨床特征、細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)等因素的多變量分析結(jié)果中顯示，僅有強(qiáng)化治療Ⅰ后MFC-MRD是最有價(jià)值的獨(dú)立預(yù)后因素，強(qiáng)化治療Ⅰ后MRD的預(yù)后價(jià)值高于早期時(shí)間點(diǎn)。國際多個(gè)兒童AML協(xié)作組研究結(jié)果同樣證實(shí)了MRD的獨(dú)立預(yù)后意義［1，4-5，18-19］，但在最佳檢測時(shí)間點(diǎn)的選擇上略有差異：北歐兒童血液腫瘤學(xué)會(huì)應(yīng)用AIET（阿糖胞苷+依托泊苷+6-巰基嘌呤+去甲氧柔紅霉素）、AM誘導(dǎo)治療方案，其中未獲得CR的患兒增加FLAG（氟達(dá)拉濱+阿糖胞苷+粒細(xì)胞集落刺激因子）方案，研究結(jié)果表明僅有鞏固治療前MFC-MRD陽性是獨(dú)立不良預(yù)后因子［18］，原因可能與增加了針對(duì)難治性AML的FLAG方案，對(duì)早期MRD的預(yù)后意義形成干擾相關(guān)。而意大利兒童血液腫瘤學(xué)會(huì)的研究中，所有患兒均采用標(biāo)準(zhǔn)的2個(gè)療程ICE（伊達(dá)柔比星+阿糖胞苷+依托泊苷）誘導(dǎo)治療，多因素分析結(jié)果表明僅有誘導(dǎo)治療Ⅰ后MRD是獨(dú)立預(yù)后因素［1］，驗(yàn)證了早期MRD狀態(tài)的重要價(jià)值。這些差異與治療方案與風(fēng)險(xiǎn)分層方法的不同、流式細(xì)胞術(shù)分析方法學(xué)的差異，以及納入多變量模型的因素各不相同有關(guān)。但綜合來說，多個(gè)研究均表明MRD是最強(qiáng)的預(yù)后預(yù)測因子之一，體現(xiàn)出相對(duì)于骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)異常更高的預(yù)后價(jià)值，為使用MRD作為風(fēng)險(xiǎn)分層因素的相關(guān)研究提供了重要數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，誘導(dǎo)治療Ⅰ及強(qiáng)化治療Ⅰ后MFCMRD陽性均與更差的遠(yuǎn)期預(yù)后相關(guān)。在基于初診年齡、初診WBC計(jì)數(shù)、最終風(fēng)險(xiǎn)分層、誘導(dǎo)治療Ⅱ后BM、遺傳學(xué)異常和MRD的多因素分析中，僅有強(qiáng)化治療Ⅰ-MRD陽性是3年OS率的獨(dú)立不良預(yù)后因素。基于MRD的風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)向治療可能改善患兒的整體預(yù)后。

然而，本研究尚存在一定的局限性，如初診患兒中有合適LAIPs標(biāo)記的患兒比例（63%）顯著低于其他研究（＞90%），使MRD檢測方法不能統(tǒng)一，可能導(dǎo)致偏倚。需要進(jìn)一步研究無標(biāo)記患兒比例增高的原因，提高樣本量，統(tǒng)一檢測方法，進(jìn)行更多前瞻性大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)。