多功能脫氧核酶用于生物醫(yī)學(xué)分析的研究進展

王 慶，何雨秋，王富安

（武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院,武漢430072）

核酸一直被認為是存儲和傳遞遺傳信息的分子［1~3］.隨著科研工作者對核酸研究的不斷深入，功能核酸的出現(xiàn)打破了人們對核酸的傳統(tǒng)認知［4~7］.功能核酸主要包括兩大類：（1）能夠特異性識別并結(jié)合目標分子的核酸分子，這類RNA或者DNA稱為核酸適配體（Aptamer）［8~10］；（2）具有酶活性，依賴特定的金屬離子或者生物分子進行催化反應(yīng)的核酸分子，這類RNA或者DNA稱為核酶或脫氧核酶（RNAzyme/DNAzyme）［11~14］.

1982年，Cech等［15］首次發(fā)現(xiàn)四膜蟲線粒體中的前體rRNA具有催化活性，能夠?qū)崿F(xiàn)自我剪切，他們將這種具有催化功能的RNA稱為核酶（Ribozyme或RNAzyme）.這一發(fā)現(xiàn)對所有酶都是蛋白的傳統(tǒng)觀念提出了挑戰(zhàn).隨后，科學(xué)家們迅速發(fā)現(xiàn)了多個天然核酶，其在核酸加工、病毒復(fù)制、肽鍵形成和基因調(diào)控等過程中發(fā)揮著重要作用.1994年，Breaker等［16］發(fā)現(xiàn)了一個短的單鏈DNA同樣可以催化RNA磷酸二酯鍵水解斷裂，首次提出了脫氧核酶的概念.隨后，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了種類繁多、功能各異的DNAzyme.根據(jù)功能的不同，DNAzyme主要分為以下5種類型：（1）具有RNA或DNA切割活性的DNAzyme［17，18］；（2）具有DNA連接酶活性的DNAzyme［19，20］；（3）具有卟啉金屬化酶和過氧化酶活性的DNAzyme［21，22］；（4）具有DNA激酶活性的DNAzyme［23］；（5）具有DNA戴帽活性的DNAzyme［24］.

在所有的DNAzyme中，具有RNA剪切能力的脫氧核酶更具有生物學(xué)意義［25］，研究最為廣泛（圖1）.這類DNAzyme不僅可以切割特定RNA的位點，還可以切割破壞細胞中的mRNA，下調(diào)蛋白的表達，從而調(diào)控細胞的功能.在這一類DNAzyme中，研究和利用最為廣泛的是8-17 DNAzyme［26］（從約1×1014個隨機序列體外篩選時第8輪循環(huán)第17個克?。┖?0-23 DNAzyme［27］（從約1×1014個隨機序列體外篩選時第10輪循環(huán)第23個克隆），由Santoro等［28］在1997年從DNA文庫中篩選得到，以二價金屬離子作為輔因子.這2種脫氧核酶都是由催化核心和兩側(cè)的底物結(jié)合臂構(gòu)成的，催化核心的堿基序列高度保守，其突變將導(dǎo)致DNAzyme活性發(fā)生明顯變化.圖2（A）給出8-17 DNAzyme和10-23 DNAzyme的結(jié)構(gòu)，其中8-17 DNAzyme包含1個小的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和下游未配對的4~5個堿基區(qū)域及兩邊的短臂，可催化底物的5′-G↓rA-3′位點斷裂.10-23 DNAzyme由1個環(huán)狀催化中心和兩邊的臂組成，能夠識別并催化RNA底物的5′-R↓Y-3′位點斷裂，其中R為A/G堿基，Y為C/U堿基，其對底物切割效率為AU=GU=GU>>AC.10-23 DNAzyme對Mg2+表現(xiàn)出較高的催化活性，由于其具有對RNA底物高效的切割能力，已廣泛應(yīng)用于生物治療領(lǐng)域.而8-17 DNAzyme最早發(fā)現(xiàn)對Pb2+表現(xiàn)出很高的催化活性，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其對很多二價金屬離子也表現(xiàn)出較高的催化活性，如Zn2+和Mn2+［29，30］.目前篩選出來的大部分脫氧核酶均需要特定的金屬離子作為輔因子，其作用機理為：兩端的臂通過Watson-Crick堿基互補配對與底物鏈雜交在一起，當金屬離子存在時，DNAzyme催化中心折疊形成具有催化活性的特定二級結(jié)構(gòu)，DNA?zyme被激活，進而催化底物鏈中RNA堿基水解斷裂［31，32］.

2009年，Chandra等［33］篩選出可以剪切DNA底物的DNAzyme，共篩選出9個新的DNAzyme，在Zn2+和Mn2+的作用下，這些DNAzyme能夠作用于底物DNA上的磷酸二酯鍵［圖2（B）］.與RNA嵌合的DNA底物相比，這種全DNA底物在復(fù)雜環(huán)境下更穩(wěn)定.

Fig.1 Schematic representation of the cleavage of RNA?chimeric DNA substrate by DNAzyme[25]

Fig.2 Composition of the 8?17 and 10?23 catalytic motifs(A)[28]and cleavage sites within the substrate for nine unique new DNAzymes(B)[33]

DNAzyme的發(fā)現(xiàn)為分析化學(xué)在生命科學(xué)領(lǐng)域的拓展和應(yīng)用提供了巨大潛力，目前，DNAzyme已經(jīng)被應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、生物傳感及臨床診斷等多個領(lǐng)域，其主要優(yōu)勢如下：（1）性質(zhì)穩(wěn)定.熱穩(wěn)定性和耐酸堿性比傳統(tǒng)的蛋白酶更好，可常溫運輸保存，即使在高溫條件下也有較好的穩(wěn)定性；變性可逆，即使經(jīng)過熱變性后再復(fù)性，仍能保持活性，可反復(fù)使用［34］.（2）靶標分子廣泛.靶標可以是各種金屬離子、小分子，也可以是大分子蛋白［35］.（3）DNA的化學(xué)標記成熟，且質(zhì)量穩(wěn)定，批次間差異小.一旦篩選得到一個成熟的脫氧核酶序列信息，便可以通過化學(xué)合成來批量生產(chǎn)、純化，并且其產(chǎn)量大、純度高.（4）結(jié)構(gòu)的可預(yù)測性和易于裁剪.其分子量小，使用更方便，應(yīng)用更廣.（5）篩選周期短，在體外完成，不需要進行動物實驗，可實現(xiàn)自動化和規(guī)?；?采用最常見的指數(shù)富集式配體系統(tǒng)進化技術(shù)（SELEX）一般篩選輪數(shù)為8~15輪，約1~2月可以得到靶標特異性響應(yīng)的核酶序列［36］.（6）高效催化性.DNAzyme的催化效率Kcat/Km約為109mol·L?1·min?1.

1 脫氧核酶的體外篩選

目前所用的脫氧核酶都是通過體外篩選得到的，至今還未發(fā)現(xiàn)自然界中存在天然的脫氧核酶.脫氧核酶通過SELEX篩選得到，其篩選流程如圖3所示［37］：（1）設(shè)計模板序列，建立DNA庫，文庫總量可達1014~1015，然后優(yōu)化和確定篩選條件；（2）進行體外篩選，將隨機文庫與目標在特定緩沖液中混合孵育，然后分離被切割的核酸序列和未切割的核酸序列，并收集被切割的核酸；（3）將被切割的核酸序列作為模板進行PCR擴增，形成次級文庫，獲得特異性更強的DNA文庫，再進行第二輪篩選；如此循環(huán)往復(fù)，進行多輪篩選.隨著篩選次數(shù)的增加，核酸分子對目標物的特異性越來越高；當隨機序列與目標物的特異性達到飽和時，完成篩選；（4）對篩選得到的核酸序列進行測序，并用最終篩選得到的DNA對目標物進行活性和特異性檢測，最終選擇活性高、特異性好的DNA作為該目標物的DNAzyme序列.通常需要經(jīng)過8~15輪的篩選最終得到高特異性的序列［36］.

Fig.3 Schematic demonstration of the selection of DNAzyme molecules using the conventional Systemic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment(SELEX)process[37]

2 脫氧核酶的活性調(diào)控

2.1 金屬輔因子激活DNAzyme

通過輔因子調(diào)節(jié)DNAzyme活性是一種最簡單、最有效的手段.Wang等［38］利用含鋅離子的金屬有機框架ZIF-8納米材料負載10-23 DNAzyme進入細胞，在腫瘤細胞酸性環(huán)境下，ZIF-8納米材料被降解，釋放出游離的Zn2+和DNAzyme，Zn2+作為DNAzyme的輔因子，能夠激活DNAzyme在細胞內(nèi)的剪切活性，對Egr-1 mRNA進行靶向切割，下調(diào)Egr-1基因（圖4）.Qu等［39］合成了一種Zn2+/Cu2+雙金屬有機框架（MOF）材料.一旦進入癌細胞，MOF就會在溶酶體的酸性環(huán)境中分解并釋放出Zn2+，Cu2+和DNAzyme.Zn2+充當激活DNAzyme剪切活性的輔因子；Cu2+在還原為Cu+后，可催化藥物的合成.激活的DNAzyme通過靶向和裂解癌基因底物，以抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移.

Fig.4 The pH?triggered release of DNAzyme and the corresponding Zn2+?ion cofactors for efficient gene silencing therapy by 10?23 DNAzyme[38]

此外，還有很多工作都是基于含金屬輔因子的納米材料，納米材料進入細胞之后釋放游離的金屬離子，解決了細胞中相應(yīng)金屬離子濃度較低的問題，提高了DNAzyme的剪切活性［40~42］，但這些納米材料的生物安全性仍是需要重點考慮的問題.隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，科研工作者們對納米材料的生物效應(yīng)和安全性問題更為重視.未來有望開發(fā)一些生物安全性高的納米材料及篩選活性更高的DNAzyme，降低其對金屬輔因子的濃度要求，并建立準確的納米材料生物安全性評估方法，以便更好地將納米材料用于DNAzyme領(lǐng)域，在充分發(fā)揮納米材料功能的同時，盡可能減少對健康的不利影響.

2.2 核酸調(diào)節(jié)DNAzyme結(jié)構(gòu)重組

通過細胞內(nèi)核酸對DNAzyme的結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)而恢復(fù)DNAzyme活性是DNAzyme活性調(diào)控最為普遍的一種方式.

Wang等［43］構(gòu)建了一種金納米顆粒上miRNA以調(diào)節(jié)DNAzyme構(gòu)型轉(zhuǎn)換激活其活性，用于細胞內(nèi)miRNA-141的成像分析方法［圖5（A）］.他們在金納米顆粒表面連接上多個包含DNAzyme序列的發(fā)卡探針，發(fā)卡5′端修飾熒光團FAM，熒光被金納米顆粒猝滅.初始狀態(tài)下該發(fā)卡探針將DNAzyme的臂封閉在發(fā)卡的莖端，而在miRNA-141的存在下，miRNA-141與發(fā)卡探針雜交，使發(fā)卡探針發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)換，形成完整的DNAzyme和底物雜交結(jié)構(gòu)，此時DNAzyme可以將底物剪切，釋放含F(xiàn)AM的寡核苷酸片段，使FAM遠離金納米顆粒，熒光得以恢復(fù)；同時，目標物miRNA也被釋放，可以與鄰近的發(fā)卡探針繼續(xù)雜交，實現(xiàn)循環(huán)利用.所以該探針可以靈敏地監(jiān)測細胞內(nèi)miRNA-141的含量.

Wang等［44］還設(shè)計了金納米顆粒上劈裂的DNAzyme結(jié)構(gòu)重組用于監(jiān)測miRNA-21［圖5（B）］.將10-23 DNAzyme的催化中心分為兩部分，分別包含在DNAzyme 1和DNAzyme 2中，這2條DNAzyme通過堿基互補配對與修飾在金納米顆粒表面的底物鏈雜交，此時底物鏈上修飾的FAM熒光團被金納米顆粒和DNAzyme 2上的猝滅基團（Quencher）猝滅.在目標物miRNA-21的存在下，DNAzyme 1和DNAzyme 2被拉攏到一起，形成完整的10-23 DNAzyme結(jié)構(gòu)，催化剪切底物，釋放熒光團產(chǎn)生熒光.該探針體外檢測miRNA-21的檢測限達到10 pmol/L.

為了進一步提高體系的靈敏度，科研人員設(shè)計了一系列核酸調(diào)控DNAzyme活性的信號擴增新體系.Wu等［45］將雜交鏈式反應(yīng)（Hybridization chain reaction，HCR）與DNAzyme信號擴增結(jié)合，實現(xiàn)了外泌體中miRNA的靈敏檢測［圖6（A）］.他們提出的信號擴增體系由HCR1，HCR2和DNAzyme放大器3個模塊組成.體系包含6個發(fā)卡（H1—H6）和1個雙標底物（一端標記FAM，一端標記BHQ-1）.在目標I存在時，H1和H2發(fā)生第一級HCR反應(yīng)（HCR1），生成的雙鏈產(chǎn)物上包含多個重復(fù)序列Trigger（T）；它作為HCR2模塊的引發(fā)劑，引發(fā)發(fā)卡H3—H6發(fā)生第二級的HCR反應(yīng)，由于發(fā)夾H3和H5末端分別包含一半的DNAzyme序列，因此最終生成長的雙鏈HCR2產(chǎn)物上可以形成多個完整的DNAzyme結(jié)構(gòu).這些DNAzyme構(gòu)成了DNAzyme放大器模塊，模塊中每個DNAzyme可以催化剪切多個底物，使熒光團FAM和猝滅團BHQ-1分離，產(chǎn)生熒光信號.在該體系中，1個目標物I可以引發(fā)HCR1產(chǎn)生多個T序列，1個T序列可以引發(fā)HCR2產(chǎn)生多個DNAzyme，1個DNAzyme剪切多個底物，實現(xiàn)了N×n信號放大.此外，該體系可以用于不同目標miRNA的檢測，只需要根據(jù)目標序列設(shè)計1個輔助發(fā)卡，將引發(fā)鏈I序列封閉在輔助發(fā)卡中，當目標miRNA與輔助發(fā)卡雜交，釋放出單鏈狀態(tài)的I，即可進行上述的級聯(lián)HCR反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號.該體系對目標物的檢測限達到0.3 pmol/L，且實現(xiàn)了腫瘤細胞外泌體中miR-21的成像分析.

Fig.5 Working mechanism of the AuNP?based hairpin?locked?DNAzyme probe for miRNA detection(A)[43]and working mechanism of the AuNP loaded split?DNAzyme probe for amplified miRNA detection in living cells(B)[44]

Fig.6 Schematic illustration of the target DNA initiate DNAzyme?amplified two?stage cascaded hybridization chain reaction(CHCR?DNAzyme)circuit(A)[45]and scheme reaction procedure of the target DNA initiate replicating catalytic DNA machinery consisting of hybridization chain reaction(HCR)and DNAzyme biocatalysis(B)[46]

Wei等［46］提出了HCR和DNAzyme交叉的激活策略.由圖6（B）可見，體系包含4個發(fā)卡（H1—H4）和封閉的底物鏈（S/L），底物鏈S上包含引發(fā)鏈T（a*-b*）序列.當加入引發(fā)鏈T時，會觸發(fā)發(fā)卡H1，H2，H3和H4發(fā)生HCR反應(yīng)，在生成長的雙鏈HCR產(chǎn)物上，熒光團FAM和TAMRA相互靠近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），產(chǎn)生FRET信號.同時，生成的HCR產(chǎn)物鏈上包含多個DNAzyme，可以剪切底物S/L復(fù)合物，釋放S鏈的a*-b*（與引發(fā)鏈T序列一致）部分，該片段又作為引發(fā)鏈T繼續(xù)引發(fā)HCR反應(yīng)，達到交叉激活的效果.在該體系中，1個引發(fā)鏈T可產(chǎn)生多個DNAzyme，催化剪切封閉底物鏈，生成多個引發(fā)鏈T，補充新的目標物，實現(xiàn)了Nn信號放大.該體系對目標物的檢測限達到5.9 pmol/L，實現(xiàn)了細胞中不同miRNA水平的成像分析.此外，Wang等［47］結(jié)合HCR，CHA和DNAzyme，通過miRNA引發(fā)HCR和CHA雙重信號放大，生成了具有活性的DNAzyme，可剪切雙標底物產(chǎn)生熒光信號，用于高靈敏的細胞內(nèi)miRNA監(jiān)測成像.

另外，還有諸多類似的利用核酸調(diào)控DNAzyme結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化用于生物傳感的研究［48~52］.該方法的優(yōu)勢在于適用性廣，根據(jù)不同的核酸檢測目標物即可設(shè)計出相應(yīng)的DNAzyme探針.但這種將DNAzyme分為兩個片段重新組合在一起的策略會降低DNAzyme的原本活性，且設(shè)計相對復(fù)雜.針對核酸調(diào)節(jié)DNAzyme結(jié)構(gòu)重組中提到的DNAzyme結(jié)構(gòu)重組影響其原有活性問題，在這些傳感體系中DNAzyme的結(jié)構(gòu)完整性通常是重要的一環(huán)，涉及信號輸出的效率，因此，DNAzyme的活性對體系的靈敏度有重要影響.在設(shè)計響應(yīng)性DNAzyme探針時，應(yīng)堅守不拆分DNAzyme原本結(jié)構(gòu)及盡量不加入額外序列干擾的原則，因此目前的研究趨勢是利用響應(yīng)性官能團修飾的方法來封閉DNAzyme，這種無損、干擾小的策略將極大地保留DNAzyme的原本活性.

2.3 小分子激活DNAzyme活性

Li等［53］發(fā)展了一種利用三磷酸腺苷（ATP）調(diào)控DNAzyme活性的方法.該方法將DNAzyme與滾環(huán)擴增（Rolling circle amplification，RCA）相結(jié)合，提高了ATP調(diào)控的DNAzyme體系檢測的靈敏度.如圖7（A）所示，將ATP的適配體與DNAzyme整合到一條核酸鏈上，當存在ATP時，ATP小分子嵌入適配體序列，使DNAzyme催化中心形成具有活性的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；DNAzyme可以切割底物鏈，釋放5′端核酸片段，釋放的片段作為滾環(huán)擴增的引物primer，在聚合酶的作用下沿著模板發(fā)生滾環(huán)擴增反應(yīng)，生成長DNA單鏈.然后，該產(chǎn)物與短的互補鏈PNA雜交，此時熒光染料DiSC2（5）將會嵌入雙鏈中，生成紫色溶液，通過肉眼即可判斷初始溶液中ATP的含量，從而實現(xiàn)ATP的可視化檢測.但這種將核酸適配體與脫氧核酶結(jié)合的策略需要精心設(shè)計和篩選核酸的序列，體系的廣譜性較差.

Fig.7 Schematic representation of the colorimetric detection of ATP by using an RNA?cleaving allosteric DNAzyme(A)[53]and schematic representation of aptazyme?gold nanoparticle sensor for ATP probing in living cells(B)[54]

Wang等［54］設(shè)計了一個基于ATP激活的適體酶探針（將DNAzyme與適配體整合在一起）用于細胞內(nèi)ATP的成像檢測.如圖7（B）所示，將巰基修飾的底物連接在金納米顆粒表面，適體酶單鏈DNA通過堿基互補配對與底物雜交，此時DNAzyme沒有切割底物的能力.當ATP存在時，ATP小分子嵌入適配體序列，使DNAzyme催化中心形成穩(wěn)定而致密的核酸二級結(jié)構(gòu)，在DNAzyme金屬輔因子Mg2+的存在下，DNAzyme具有剪切活性，可切割底物鏈使TAMRA熒光團標記的片段從金顆粒表面脫離，產(chǎn)生熒光信號.該探針可以用來檢測細胞內(nèi)的ATP和Mg2+的含量.

此外，Ikeda等［55］發(fā)展了一種利用連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）或O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）激活DNAzyme的策略.由圖8（A）可見，對8-17 DNAzyme催化活性中心10號位G堿基進行了4-硝基芐基修飾（GNB），此時DNAzyme的活性被封閉.在還原試劑Na2S2O4作用下，GNB被還原為正常的G堿基，或者在MGMT作用下使GNB脫去4-硝基芐基，DNAzyme恢復(fù)原本的結(jié)構(gòu)而被激活.

Fig.8 Schematic illustration of Na2S2O4?or MGMT?induced activation of DNAzyme(A)[55]and schematic of H2O2?activated phenylboronate(BO)modified DNAzyme(B)[56]

Xiao等［56］發(fā)展了一種更加直接的利用過氧化氫（H2O2）調(diào)控DNAzyme活性的方法，其原理是對8-17 DNAzyme催化中心的3個關(guān)鍵堿基進行苯硼酸基團修飾，修飾后的DNAzyme失去了切割底物的活性，在H2O2存在下，核酸上的苯硼酸基團被氧化移除，DNAzyme恢復(fù)原始的切割能力［圖8（B）］.將該苯硼酸修飾的DNAzyme和底物轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，由于腫瘤細胞內(nèi)H2O2含量較高，可以激活DNAzyme探針，從而實現(xiàn)細胞內(nèi)H2O2的成像分析.但該探針對H2O2的響應(yīng)性不是很靈敏，即使加入100μmol/L的H2O2，DNAzyme的活性并不能很好地恢復(fù)到原始水平.

2.4 蛋白酶調(diào)控DNAzyme活性

利用蛋白酶調(diào)控DNAzyme活性的基本原理是先用核酸對DNAzyme序列進行雜交封閉，然后在特定核酸內(nèi)切酶的作用下破壞雜交部分，使DNAzyme得到釋放，恢復(fù)原本結(jié)構(gòu)而具有活性，該方法的核心理念也是通過重組DNAzyme結(jié)構(gòu)而使其恢復(fù)原本活性.但不同于利用核酸調(diào)控DNAzyme結(jié)構(gòu)重組方法的普適性，該方法能應(yīng)用到的蛋白酶十分有限.

Lu等［57］首次提出了一種由蛋白酶調(diào)控DNAzyme活性的新策略，設(shè)計了2種DNAzyme探針.由圖9（A）可見，第一種DNAzyme探針是將8-17 DNAzyme催化中心2.1位點的胸腺嘧啶T堿基換成尿嘧啶U堿基，此時DNAzyme具有剪切活性，在尿嘧啶DNA糖基酶（UNG）作用下，催化尿嘧啶和糖之間的N-糖苷鍵水解，U堿基脫去尿嘧啶，留下1個無嘧啶位點，DNAzyme失去活性.第二種DNAzyme探針是在DNAzyme催化中心13號位和14號位之間加入1個U堿基，此時DNAzyme失去活性，然后在UNG作用下脫去尿嘧啶，DNAzyme恢復(fù)活性，剪切雙標記（同時標記熒光團和猝滅團）的底物產(chǎn)生熒光.但該研究并未進一步將該探針用于細胞內(nèi)UNG的檢測，可能存在的原因是：（1）第一種DNAzyme探針在UNG存在下，DNAzyme由活性狀態(tài)變成無活性狀態(tài)，無法剪切底物產(chǎn)生熒光信號，屬于信號“OFF”策略，不適用于細胞成像監(jiān)測；（2）第二種DNAzyme探針在其催化活性中心額外加入1個U堿基，即使在UNG作用下去掉U堿基上的尿嘧啶，激活DNAzyme，但這個額外加入的無嘧啶位點可能會影響原本的DNAzyme結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致其活性發(fā)生變化；且引入的U堿基位于8-17 DNAzyme催化中心關(guān)鍵的13和14位點之間，該高度保守的5′-CG-3′序列可能因為無尿嘧啶位點的插入使DNAzyme活性受到一定程度的抑制；（3）由于RNA更容易被降解，在DNAzyme中引入1個RNA堿基，會導(dǎo)致DNAzyme在復(fù)雜環(huán)境下不穩(wěn)定.

Lu等［58］進一步發(fā)展了一種利用在釀酒酵母中表達的歸位內(nèi)切酶（I-SceI）激活DNAzyme用于檢測細胞內(nèi)鎂離子的方法.由圖9（B）可見，首先設(shè)計一種三鏈體核酸探針（S1-S2-S3），DNAzyme（S2）的5′端部分與底物（S1）雜交，3′端部分與含有I-SceI內(nèi)切酶位點的短鏈（S3）雜交，此時DNAzyme被S3鏈封閉.底物3′末端修飾的熒光團（Cy5）的熒光被DNAzyme 5′末端修飾的猝滅基團（IAbRQ）猝滅.當細胞內(nèi)存在I-SceI時，DNAzyme與S3雜交部分位點被I-SceI識別并剪切，釋放出單獨的DNAzyme和底物，DNAzyme恢復(fù)其原有結(jié)構(gòu)和活性，并根據(jù)堿基互補配對原則與底物重新雜交.此時，在鎂離子作用下，DNAzyme可以剪切底物，釋放出熒光團Cy5，產(chǎn)生熒光信號.該方法利用蛋白酶激活DNAzyme，降低了傳統(tǒng)的一直處于“ON”狀態(tài)的DNAzyme在未達到腫瘤細胞內(nèi)部時產(chǎn)生的信號泄露，且該設(shè)計沒有改變DNAzyme原本的序列，在酶剪切之后可以得到完整的DNAzyme結(jié)構(gòu)，不會對其活性造成影響.但該研究中報道的I-SceI內(nèi)切酶是由質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞表達的，未能真正做到由細胞內(nèi)重要蛋白酶響應(yīng)激活.

Fig.9 Schematic illustration of UNG?induced deactivation and activation of DNAzyme(A)[57],schematic of I?Sce I protein activation of the 10?23 DNAzyme for intracellular imaging of Mg2+(B)[58]and design of the APE1?activatable DNAzyme sensor for cancer?cell?selective sensing of Zn2+(C)[59]

針對以上研究中存在的問題，科研人員做出了進一步改進，利用腫瘤細胞中高表達的堿基修復(fù)酶激活DNAzyme，實現(xiàn)了細胞內(nèi)金屬離子的監(jiān)測和堿基修復(fù)酶的成像.由圖9（C）可見，Li等［59］發(fā)展了一種利用腫瘤細胞內(nèi)源性存在的脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶（APE1）激活DNAzyme的探針，用于細胞內(nèi)鋅離子的檢測.該DNAzyme的3′端臂（與底物雜交的部分）因與一段延伸出來的環(huán)形序列雜交而被封閉，而5′端則與雙標記的底物雜交.DNAzyme 3′端封閉區(qū)域含有一個缺嘌呤/嘧啶位點，可特異性地被腫瘤細胞質(zhì)中表達的APE1酶識別并剪切，從而使DNAzyme的3′端呈單鏈狀態(tài)，與底物雜交形成具有催化活性的結(jié)構(gòu).在細胞內(nèi)鋅離子的作用下，DNAzyme可以剪切底物，產(chǎn)生熒光信號.但該設(shè)計的弊端是沒有充分利用DNAzyme作為酶的催化能力，每個被激活的DNAzyme只能剪切一個底物，降低了體系檢測的靈敏度.

Zhao等［60］設(shè)計了3個探針分別用于檢測堿基切除修復(fù)過程中的3種蛋白，最終被激活的DNAzyme可以實現(xiàn)多次剪切循環(huán)，產(chǎn)生放大的檢測信號，提高了體系檢測的靈敏度，有利于細胞中含量較低的腫瘤標志物的高效檢測.如圖10所示，Zhao等［60］分別設(shè)計了含2個脫氧尿嘧啶位點的核酸序列用于檢測尿嘧啶-DNA糖苷酶（hSMUG1）、含有2個8-羥基鳥嘌呤位點的核酸序列用于檢測8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶（hOGG1）及含有缺嘌呤/嘧啶位點的核酸序列用于檢測脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶（APE1）.將這3種含有受損堿基的探針分別與DNAzyme雜交形成雙鏈，由二氧化錳納米片負載這3種雙鏈和熒光雙標記的DNAzyme作用底物，此時DNAzyme被封閉，不能與底物雜交.進入細胞后，二氧化錳被腫瘤細胞中高表達的GSH降解，釋放二價錳離子（Mn2+），同時釋放探針.在腫瘤細胞內(nèi)hSMUG1，hOGG1和APE1酶的共同作用下，受損堿基最終被切除斷裂，釋放出DNAzyme.呈單鏈狀態(tài)的DNA?zyme恢復(fù)原本活性，形成有效的折疊構(gòu)象，通過兩邊的臂與底物雜交，在輔因子Mn2+的作用下剪切雙標記的底物，從而產(chǎn)生熒光.同時，DNAzyme又被釋放進入下一個剪切循環(huán)，并在多次循環(huán)中保持高效的催化效率，提供了至少40倍的放大信號.該設(shè)計實現(xiàn)了活細胞內(nèi)參與堿基修復(fù)過程的蛋白酶成像分析.

但以上這些利用細胞內(nèi)APE1激活DNAzyme的方法都是間接的激活方式，需要預(yù)先將DNAzyme的催化中心或兩邊的臂進行封閉，這要求較為精密的核酸設(shè)計和優(yōu)化過程，且探針進入細胞后在核酸內(nèi)切酶的作用下會剪切釋放多余無用的核酸，未能實現(xiàn)各組分的高效利用.基于此，本課題組［61］設(shè)計了一種更加簡單、直接、高效地利用m6A去甲基化酶調(diào)控DNAzyme活性的方法.由圖11（A）可見，將DNAzyme催化活性中心的A堿基甲基化修飾后，DNAzyme活性幾乎被完全抑制，在高表達去甲基化酶的腫瘤細胞內(nèi)，甲基化的DNAzyme脫甲基恢復(fù)原始活性，剪切雙標記的底物而產(chǎn)生熒光信號.同時設(shè)計了一個發(fā)卡結(jié)構(gòu)的底物S2［圖11（B）］，將具有基因沉默作用的一段反義寡核苷酸（ASO）封閉在發(fā)卡的莖部.當探針進入腫瘤細胞內(nèi)，去甲基化酶激活DNAzyme后，DNAzyme在剪切底物產(chǎn)生熒光信號的同時釋放ASO［圖11（B）中紅色DNA片段］，ASO可以靶向結(jié)合去甲基化酶FTO蛋白的mRNA，下調(diào)腫瘤細胞中FTO蛋白的表達，最終導(dǎo)致腫瘤細胞的凋亡.這種設(shè)計簡單、酶響應(yīng)之后對DNAzyme不會造成任何影響的無損甲基封閉策略，不僅可以檢測去甲基化酶，而且剪切產(chǎn)生的底物信號鏈還可以進行再利用，作為基因藥物調(diào)控細胞行為.這一策略為開發(fā)更加簡單高效的DNAzyme調(diào)控新方法提供了新的思路.

Fig.10 Illustration of repair enzyme activation of DNAzyme for versatile monitoring of BER pathways in living cells[60]

Fig.11 Schematic illustrations of the demethylase?stimulated DNAzyme activation via the efficient FTO?mediated removal of N6?methyladenine(m6A)modification(A)and the self?motivated FTO?initiated DNAzyme gene?silencing platform(B)[61]

2.5 光、熱調(diào)控DNAzyme活性

利用光激活DNAzyme的研究相對較多，最早是利用光敏基團調(diào)控Ribozyme活性，后續(xù)發(fā)展為用于調(diào)控DNAzyme活性.常用的光敏基團主要包括6-硝基苯氧基甲基（NPOM）和鄰硝基芐基類基團.

Deiters等［62］將10-23 DNAzyme催化中心的1個T堿基修飾上NPOM光敏基團，使DNAzyme失去活性，在365 nm紫外光照下DNAzyme將脫去NPOM基團，恢復(fù)剪切活性［圖12（A）］.

Fig.12 Schematic illustration of UV irradiation?activated DNAzyme(A)[62],scheme of the decaging process for the photolabile Na+?specific DNAzyme(B)[63],design of a light activated DNAzyme?catalytic hair?pin assembly probe for amplified detection of endogenous Na+in living cells(C)[64]and illustration of the near?infrared activated?DNAzyme nanoprobe for Zn2+detection(D)[65]

Lu等［63］也提出了一系列光響應(yīng)的DNAzyme探針用于細胞內(nèi)可控分析檢測.他們直接在底物剪切位點rA堿基上修飾光敏基團，以阻斷DNAzyme對底物的切割.由圖12（B）可見，在rA的糖環(huán)2號位羥基上修飾1個鄰硝基芐基光敏基團，修飾后的底物無法被DNAzyme剪切.在365 nm紫外光源照射下，鄰硝基芐基從rA上斷裂脫離，底物恢復(fù)原來的結(jié)構(gòu)，此時DNAzyme能夠剪切底物，導(dǎo)致底物兩端修飾的熒光基團和猝滅基團分離，產(chǎn)生熒光信號.為了將該光控DNAzyme用于細胞內(nèi)可控的高靈敏度鈉離子檢測［圖12（C）］.他們結(jié)合催化發(fā)卡自組裝反應(yīng)（Catalyzed hairpin assembly，CHA），利用光激活DNAzyme剪切底物所釋放的底物片段作為CHA的引發(fā)鏈（I），在I的作用下，催化發(fā)卡H1和H2發(fā)生CHA反應(yīng)，得到大量的H1-H2產(chǎn)物，由于發(fā)夾H2被打開，其兩端修飾的相鄰熒光團和猝滅基團分離，產(chǎn)生熒光信號，同時引發(fā)鏈I被釋放出來，重新進行CHA反應(yīng)，實現(xiàn)了信號放大的效果［64］.

上述利用365 nm紫外光激活DNAzyme的方法不適于細胞或活體內(nèi)DNAzyme探針的激活，這是因為紫外光的穿透深度十分有限.為了解決此問題，Lu等［65］借助鑭系元素摻雜的上轉(zhuǎn)換納米材料（UCNP），將980 nm的近紅外光（具有更深的組織滲透性）轉(zhuǎn)換成365 nm的紫外光，用于激活鄰硝基芐基修飾的DNAzyme.由圖12（D）可見，DNAzyme和底物雜交鏈通過DNAzyme一端的延伸單鏈與修飾在UCNP上的短鏈雜交，將DNAzyme和底物結(jié)合在UCNP表面.在980 nm激光照射下，UCNP將其轉(zhuǎn)化為365 nm光源，促使DNAzyme上的鄰硝基芐基光敏基團脫離，然后在Zn2+離子存在下激活DNAzyme剪切底物，釋放熒光團FAM修飾的DNA片段，產(chǎn)生熒光信號.該方法被成功用于活細胞和斑馬魚胚胎中Zn2+的檢測成像.該策略利用980 nm的近紅外光，提高了探針的空間分辨率.

另外，Lu等［66］還設(shè)計了另外一種光調(diào)控核酸解鏈的方法，用于DNAzyme活性調(diào)控.將DNAzyme用一段DNA雜交封閉，在光熱作用下達到封閉鏈與DNAzyme的解鏈溫度而使雙鏈分離，恢復(fù)DNA?zyme活性.由圖13（A）可見，DNAzyme的催化中心和臂與金納米顆粒表面的短鏈（Linker）雜交，使DNAzyme不能與底物雜交，其活性被封閉.在808 nm光照條件下，金納米顆粒將光能轉(zhuǎn)換成熱能，達到DNAzyme和Linker雜交部分的解鏈溫度，被封閉的DNAzyme得以釋放并迅速與底物穩(wěn)定雜交，在Zn2+作用下剪切底物釋放熒光團Cy5，產(chǎn)生熒光信號.該策略需要較嚴謹?shù)奶结樤O(shè)計過程，以保證初始狀態(tài)DNAzyme和Linker穩(wěn)定雜交，而在光熱作用下恰好又能解離；且該設(shè)計不能實現(xiàn)DNAzyme的催化循環(huán)剪切能力，不利于細胞內(nèi)含量較低的目標物分析檢測.

Fig.13 Schematic illustration of near?infrared photothermally activated DNAzyme for imaging Zn2+in living cells(A)[66]and schematic of thermally activated glyoxal caging 10?23 DNAzyme probe(B)[67]

以上2種光激活DNAzyme活性的策略，為研究者們提供了一種時空可控的研究思路.

除了光調(diào)控DNAzyme活性的方法外，Knutson等［67］報道了一種用熱激活DNAzyme的方法.他們在DNAzyme序列的所有A，C和G堿基上共價結(jié)合戊二醛分子，修飾后的DNAzyme與底物通過氫鍵雜交的能力被削弱，不能雜交剪切底物［圖13（B）］.在熱作用下，戊二醛分子從堿基上脫離，DNAzyme恢復(fù)原本與底物雜交的能力.凝膠電泳分析和熒光分析結(jié)果表明，這種DNAzyme的活性調(diào)控方法是可逆的，戊二醛分子封閉后的DNAzyme（caged DNAzyme）經(jīng)過熱激活變?yōu)榫哂谢钚缘腄NAzyme（decaged DNAzyme），它對底物的剪切能力與未經(jīng)戊二醛分子修飾的DNAzyme（untreated DNAzyme）相當.

上述光和熱激活DNAzyme的策略都是對DNAzyme功能的間接調(diào)控.這些策略中DNAzyme的設(shè)計和修飾較復(fù)雜，且都是通過外源性的條件激活，不適用于生物體內(nèi)自發(fā)、特定的響應(yīng)激活DNAzyme.此外，光和熱產(chǎn)生的副作用可能會對細胞活性和機能造成一定的影響.相比之下，采用細胞內(nèi)源性分子直接激活DNAzyme的策略顯得更有優(yōu)勢，一方面不需要對細胞施加外源性刺激，對細胞的活性和機能幾乎沒有不利影響，另一方面DNAzyme探針進入細胞發(fā)揮作用可以被選擇性激活.因此，在將DNAzyme用于細胞內(nèi)相關(guān)研究時，應(yīng)盡量采用這種安全、無損的內(nèi)源性調(diào)控DNAzyme活性的方式.

3 脫氧核酶在生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 DNAzyme在檢測金屬離子方面的應(yīng)用

多數(shù)DNAzyme需要金屬離子作為輔因子才能發(fā)揮其催化剪切作用，金屬離子濃度的大小將會限制DNAzyme剪切活性的高低，因此DNAzyme最直接的用途是用于檢測特定的金屬離子輔因子.目前發(fā)展了一系列利用DNAzyme檢測金屬離子的方法，包括比色法［68，69］、熒光分析法［70~72］及電化學(xué)分析法［73］等.

Lu等［68］設(shè)計了一種基于DNAzyme的比色方法用于檢測Pb2+.由圖14（A）可見，在金納米顆粒表面修飾1個短的核酸鏈（DNA1），DNA1通過堿基互補配對與Linker鏈的兩端（紅色部分）雜交，通過Linker鏈的作用使多個金顆粒交聯(lián)在一起，此時溶液呈藍色.Pb2+高效響應(yīng)的17E DNAzyme通過堿基互補配對與Linker鏈中間（黑色部分）雜交，同時Linker鏈作為17E DNAzyme的底物.當體系中存在Pb2+時，激活DNAzyme剪切底物，Linker鏈斷開導(dǎo)致金顆粒相互分離，形成單顆粒分散狀態(tài)，此時溶液呈紅色.通過溶液的顏色變化可以判斷溶液相中Pb2+的存在.該設(shè)計可以有效地區(qū)分等濃度的其它金屬離子，如Mg2+，Ca2+，Mn2+和Zn2+等.

Fig.14 The colorimetric assay of lead ions based on the integration of DNAzyme biocatalysis with AuNPs labels(A)[68],schematic illustration of the cell membrane?anchored DNAzyme for real?time moni?toring of Mg2+in the cellular microenvironment(B)[74],scheme of the simultaneous imaging of Zn2+and Cu2+in living cells based on DNAzyme?modified AuNP(C)[75]and in vitro selection of metal?spe?cific DNAzymes as activity?based sensors(D)[79]

由于熒光方法具有更好的靈敏度，且適用于細胞和活體成像檢測，目前利用DNAzyme檢測金屬離子的熒光方法已廣泛應(yīng)用于體外和細胞內(nèi).Tan等［74］構(gòu)建了1種DNAzyme熒光探針用于監(jiān)測細胞表面Mg2+的活動［圖14（B）］.將熒光基團修飾的DNAzyme與猝滅基團修飾的底物雜交，然后利用DNAzyme另一端修飾的膽固醇通過疏水作用嵌插在細胞膜表面，從而將DNAzyme和底物探針雙鏈固定在細胞膜上.當有Mg2+流出細胞膜表面時，會激活DNAzyme剪切底物，釋放出猝滅基團標記的底物而產(chǎn)生熒光信號，從而實現(xiàn)對細胞膜表面Mg2+活動的監(jiān)測.

Tang等［75］在金納米顆粒上修飾不同的DNAzyme實現(xiàn)了多種金屬離子的同時檢測.由圖14（C）可見，將Zn2+和Cu2+2種DNAzyme通過金-硫鍵修飾在金納米顆粒表面，底物通過與DNAzyme雜交固定在金納米顆粒表面，利用金納米顆粒強的熒光猝滅能力猝滅底物上的熒光團.當存在Zn2+和Cu2+離子時，DNAzyme剪切底物，剪切后的短寡核苷酸片段離開金納米顆粒，使熒光恢復(fù)，從而實現(xiàn)體外和細胞內(nèi)對特定金屬離子的檢測.該方法對Zn2+和Cu2+的檢測限分別達到0.47和0.45 nmol/L.

此外，科研人員還篩選出大量不同金屬離子依賴的DNAzyme，如Na+［63］，UO2+［76］，Ag+［77］，Ce2+［78］等，由圖14（D）可見，這些DNAzyme都可以發(fā)展成為傳感器用于特定金屬離子的分析檢測［79］.

為了進一步將金屬離子響應(yīng)的DNAzyme探針用于實時、便捷的環(huán)境監(jiān)測，Lu課題組［80，81］發(fā)展了一系列基于便攜式溫度計、血糖儀及試紙條等的方法，用于金屬離子的檢測.由圖15（A）可見，Lu等［80］發(fā)展了一種新型的目標響應(yīng)智能溫度計，用于將分子檢測轉(zhuǎn)化為溫度從而進行檢測.該傳感器系統(tǒng)由磷脂酶（PLA2）修飾的功能性核酸、封裝近紅外染料的脂質(zhì)體和近紅外激光設(shè)備連接的溫度計組成.當檢測特定金屬離子，如UO22+時，需將UO22+特異性DNAzyme、底物及PLA2修飾的核酸結(jié)合在磁性微球表面，當存在UO22+時，可以激活DNAzyme剪切底物，釋放PLA2修飾的核酸，PLA2催化脂質(zhì)體水解釋放近紅外染料.在近紅外激光照射下，釋放的染料可以將光能轉(zhuǎn)化為熱量，使溶液溫度升高，進而被溫度計檢測到.基于此，可以通過溫度的變化情況來檢測溶液中金屬離子的濃度.實驗結(jié)果表明，該傳感器可在0~1 mmol/L的動態(tài)范圍內(nèi)對UO22+進行定量分析，檢測限為25.7 nmol/L.該方法可以用于多種金屬離子的檢測，只需要更換特定金屬離子響應(yīng)的DNAzyme即可.

Fig.15 Schematic of metal ion detection using DNAzyme probe with smart thermometers(A)[80]and schematic of Na+detection using DNAzyme probe with portable personal glucose meters(B)[81]

Lu等［81］還將便攜式血糖儀用于金屬離子的檢測.由圖15（B）可見，將鈉離子響應(yīng)的DNAzyme、底物和淀粉酶修飾的核酸通過堿基互補配對雜交結(jié)合在磁性微球表面；當加入鈉離子時，激活DNAzyme剪切底物，使淀粉酶修飾的核酸從磁球上脫離，進入溶液相中；此時淀粉酶可以將蔗糖溶液水解轉(zhuǎn)化為葡萄糖溶液，通過血糖儀即可以測得生成的葡萄糖量，最后根據(jù)葡萄糖產(chǎn)量計算出溶液中鈉離子的濃度.該方法可以在8.0~120 mmol/L范圍內(nèi)對人血清中的Na+定量分析，檢測限可達1.9 mmol/L，遠遠低于人血清中正常的Na+水平.此外，該策略還成功用于低鈉血癥、高鈉血癥的診斷，表明低鈉血癥和高鈉血癥信號之間存在顯著差異.因為該系統(tǒng)是高度模塊化的，可以根據(jù)不同的檢測目標物設(shè)計不同的核酸探針，因此可以應(yīng)用于許多疾病標志物的實時POCT檢測.

將這些便攜式、高度模塊化的簡單設(shè)備成功用于金屬離子的檢測，極大地推動了基于DNAzyme的即時檢驗（POCT）設(shè)備的發(fā)展，未來有望設(shè)計更多的POCT設(shè)備用于環(huán)境污染檢測、病人疾病監(jiān)控等方面.

3.2 DNAzyme在檢測生物小分子方面的應(yīng)用

1998年，Breaker等［82］發(fā)現(xiàn)了首個以非金屬離子為輔因子的DNAzyme［圖16（A）］.他們在體外篩選出以組氨酸為輔因子的DNAzyme.篩選過程中優(yōu)化得到的脫氧核酶需要L-組氨酸或相關(guān)的類似物來催化DNAzyme剪切底物，其中組氨酸的咪唑基團起到主要的激活DNAzyme的作用.實驗結(jié)果表明，與不存在DNAzyme時相比，底物裂解的速率提高約100萬倍.這一發(fā)現(xiàn)為DNAzyme用于非金屬離子的分析檢測提供了更多的可能.

Fig.16 In vitro selection of histidine?dependent DNAzyme(A)[82]and schematic of DNAzyme?based sensing system for the detection of L?histidine(B)[83]

L-組氨酸在組織的生長和修復(fù)中起著重要的作用，在生物體中控制金屬元素的傳遞，因此發(fā)展一種靈敏的對細胞中L-組氨酸進行檢測的工具意義重大.Yu等［83］將Breaker篩選出的L-組氨酸DNAzyme用于檢測細胞中L-組氨酸.由圖16（B）可見，L-組氨酸存在時，可以激活DNAzyme剪切底物，釋放3′端短的核酸片段（圖中綠色部分）.釋放的片段作為引發(fā)劑（I）與信標分子堿基互補配對雜交，形成雙鏈DNA，被Nt.BbvCI核酸內(nèi)切酶剪切，此時信標分子末端修飾的熒光團FAM與猝滅團Dabcyl分離，產(chǎn)生熒光信號，同時釋放I，進入下一個循環(huán)，實現(xiàn)放大效果，產(chǎn)生大量的熒光信號.該信號放大體系對L-組氨酸的檢測限達到200 nmol/L，并成功用于細胞勻漿中的L-組氨酸的檢測；且該DNAzyme體系可以特異性的區(qū)分L-組氨酸和D-組氨酸，僅對L-組氨酸才有響應(yīng).

3.3 DNAzyme在檢測核酸方面的應(yīng)用

作為一種強大的分析工具，DNAzyme在檢測核酸方面也有著廣泛的應(yīng)用.Duan等［84］構(gòu)建了一個基于DNAzyme的DNA納米機器，可用于活細胞中腫瘤標志物miR-21的高靈敏度成像.由圖17可見，Duan等首先用3條單鏈DNA（S1，S2，S3）組裝成DNA三棱柱（DNA triangular prism，DTP），然后PA，PB和PS 3條DNA鏈通過堿基互補配對雜交結(jié)合到三棱柱結(jié)構(gòu)中，其中PA和PB各包含DNAzyme的部分序列，PS為帶有FAM熒光團和BHQ1猝滅團的DNAzyme底物鏈，3條鏈處于雜交狀態(tài)時，DNAzyme結(jié)構(gòu)被封閉起來，無法剪切底物鏈.在細胞中，內(nèi)源性miR-21可以改變PA，PB和PS 3條鏈的雜交狀態(tài)，使DNAzyme恢復(fù)成具有活性的結(jié)構(gòu)，從而可以剪切底物鏈，釋放出熒光信號.同時，釋放miR-21循環(huán)利用，激活其它活性被封閉的DNAzyme，產(chǎn)生放大的熒光信號.這種納米機器的生物穩(wěn)定性高，細胞毒性低，細胞內(nèi)化良好，能夠準確地監(jiān)測細胞中miR-21的表達水平.

Fig.17 Schematic of the DTP?based DNAzyme cascade circuits for intracellular miRNA imaging[84]

3.4 DNAzyme在檢測微生物方面的應(yīng)用

近年來，Li等［85，86］篩選出一些用于檢測細菌的DNAzyme.由圖18（A）可見，他們設(shè)計了一種底物和DNAzyme在同一條序列上的探針（RFDs），并在底物剪切位點的兩側(cè)分別修飾上熒光團（F）和猝滅團（Q）.將該探針與目標活細菌混合后，可以激活DNAzyme剪切底物，產(chǎn)生熒光信號.因此該DNAzyme在目標細菌存在的情況下會自動發(fā)出熒光，建立了一種簡單的“混合讀取”測定法來檢測目標細菌.

Didar等［87］將RFDs探針印刷在食品包裝袋上對食品污染進行實時監(jiān)控.由圖18（B）可見，將大腸桿菌（E.coli）特異性激活的DNAzyme探針通過共價連接到環(huán)烯烴聚合物（COP）膜上，實驗結(jié)果表明，該探針具有很好的特異性，在不同的pH條件（pH=3~9）下能夠穩(wěn)定存在（>14 d），只有在目標物大腸桿菌存在時，DNAzyme探針才會被激活，剪切底物，產(chǎn)生熒光.該探針在肉和蘋果汁中可以檢測到的大腸桿菌濃度低至103CFU/mL.將這種傳感材料用于食品包裝，能夠?qū)崟r監(jiān)控各種類型食品中的微生物污染，方法簡單、靈活，無需從包裝中取出樣品，能夠讓人們對食品被微生物污染的情況作出正確的評價.

Liu等［88］篩選出一種針對鰻弧菌的DNAzyme.鰻弧菌是一種細菌性病原體，會對水生魚類造成嚴重損害，因此其快速檢測和預(yù)防至關(guān)重要.在這項研究中，使用鰻弧菌的胞外基質(zhì)（CEM）作為靶標進行DNAzyme的體外選擇［圖18（C）］.經(jīng)過7輪選擇，獲得了具有高活性和特異性的名為VAE-2的DNA?zyme，其表現(xiàn)出對鰻弧菌的高效響應(yīng)性和特異性.他們通過在VAE-2 DNAzyme鏈的3′端標記猝滅團，在底物的5′端標記FAM熒光團構(gòu)建了一個DNAzyme傳感器，并成功用于污染水體中鰻弧菌的檢測.

同樣，可以利用DNAzyme鑒定特定的腫瘤細胞.Li等［89］利用細胞裂解液篩選出乳腺癌細胞MDA-MB-231特異性激活的DNAzyme，并將該DNAzyme設(shè)計成RFDs探針，用于檢測乳腺癌細胞MDAMB-231.該探針以乳腺癌細胞MDA-MB-231中的特定胞質(zhì)蛋白作為靶標，可以有效區(qū)分MDA-MB-231和其它分型的乳腺癌細胞，以及其它的腫瘤細胞［圖18（D）］.此外，Shen等［90］也利用RFDs探針篩選出慢性骨髓性白血病K562細胞特異性激活的DNAzyme.

綜上所述，DNAzyme可作為一種簡單、高效且廉價的核酸工具用于微生物方面的快速分析檢測.

Fig.18 Conceptual design of fluorescent DNAzymes that fluoresce upon contact with living bacterial cells(A)[86],illustration of real?time monitoring of food contamination by printing E.coli?activated DNAzyme probes on food packaging(B)[87],and schematic illustration of V.Anguillarum?specific DNAzyme(C)[88]and schematic of fluorogenic DNAzyme probes for specific recognition of breast tumors(D)[89]

3.5 DNAzyme在基因治療方面的應(yīng)用

基于DNAzyme對DNA和RNA底物強的識別和剪切能力，近年來，DNAzyme在細胞實驗中表現(xiàn)出良好的基因沉默作用.DNAzyme是一段短的DNA序列，具有易合成、易修飾、廉價易得、穩(wěn)定性好及設(shè)計簡便等優(yōu)勢，因而作為一類有巨大潛力的基因沉默工具被廣泛關(guān)注.其中，10-23 DNAzyme是目前應(yīng)用最廣泛的一類用于基因沉默的DNAzyme，因為其對任意序列的RNA底物均表現(xiàn)出較強的剪切能力.10-23 DNAzyme進入細胞后，能通過堿基互補配對結(jié)合特定mRNA并對其進行切割破壞，下調(diào)蛋白質(zhì)的表達，達到調(diào)控細胞生物功能的目的.Chaput等［91］將10-23 DNAzyme用于細胞內(nèi)抑制蛋白（以典型的發(fā)綠色熒光的GFP蛋白為例）表達的研究［圖19（A）］［88］.為了提高脫氧核酶在細胞復(fù)雜環(huán)境中的穩(wěn)定性，可以將核酸糖環(huán)2號位的氫進行氟取代、甲氧基取代，或者構(gòu)建鎖核酸（LNA），研究結(jié)果顯示這些修飾不會對DNAzyme的活性產(chǎn)生影響，甚至可以提高DNAzyme的活性.將GFP質(zhì)粒和10-23 DNAzyme轉(zhuǎn)染進入細胞，與對照組相比，觀察到轉(zhuǎn)染了DNAzyme的細胞呈現(xiàn)更弱的綠色熒光；qRTPCR實驗結(jié)果表明，實驗組細胞內(nèi)GFP的mRNA含量有所下降，證明DNAzyme進入細胞后通過破壞靶標mRNA來抑制蛋白表達.

由于DNAzyme發(fā)揮剪切作用需要一定量的金屬離子作為輔因子，針對細胞內(nèi)輔因子不足的問題，Tan等［92］利用二氧化錳納米片負載10-23 DNAzyme進入細胞，在腫瘤細胞內(nèi)高GSH含量作用下將二氧化錳納米片降解為Mn2+，Mn2+可以作為10-23 DNAzyme的輔因子，增強DNAzyme在細胞內(nèi)的剪切活性，有效下調(diào)Egr-1基因，最終促進腫瘤細胞凋亡［圖19（B）］.

為了使DNAzyme靶向進入特定腫瘤細胞，并且不需要外源加入金屬離子輔因子，Li等［93］設(shè)計了一個Y型的DNA納米結(jié)構(gòu)［圖19（C）］，其中2個頂點連接Sgc8適配體靶向腫瘤細胞，另一個頂點連接鈉離子DNAzyme，用于靶向結(jié)合原癌基因MET.該方法的優(yōu)勢在于通過Sgc8適配體靶向腫瘤細胞，可以使Y型探針進入特定腫瘤細胞，降低其對正常細胞的毒副作用；同時因為細胞本身內(nèi)含有大量的鈉離子，直接采用鈉離子響應(yīng)的DNAzyme可以使其在不加入外源金屬離子時就發(fā)揮高效的剪切活性；Y型環(huán)形結(jié)構(gòu)的設(shè)計也有利于提高DNAzyme在細胞內(nèi)的穩(wěn)定性.實驗結(jié)果表明，將該Y型探針與細胞共孵育，腫瘤細胞的MET蛋白含量明顯下降，且細胞死亡率上升.此外，該Y型DNA納米結(jié)構(gòu)的功能模塊可以靈活設(shè)計，用于靶向不同細胞及切割不同的mRNA.

以上研究結(jié)果表明，DNAzyme有望成為一種廉價易得、穩(wěn)定的核酸藥物用于疾病的治療，其可編程性和易于修飾的特性將極大地推動它在基因治療領(lǐng)域的發(fā)展.

Fig.19 RNA cleavage DNAzymes as gene silencing agents(A)[91],activated mechanism of the DNAzyme?MnO2 nanosystem for gene silencing(B)[92]and design of circular Y?shaped aptamer?DNAzyme conjugate for in vivo molecular gene silencing(C)[93]

3.6 DNAzyme在藥物緩釋方面的應(yīng)用

DNAzyme能夠剪切RNA和DNA底物的特性使其可以作為一種靈活可控的開關(guān)用于納米材料中藥物的緩釋.

Willner等［94］設(shè)計了一系列由DNAzyme調(diào)控無機納米材料釋放藥物的方法.由圖20（A）可見，首先將有機染料封裝在介孔二氧化硅的孔內(nèi)，然后在二氧化硅的表面修飾上底物和DNAzyme，以封閉二氧化硅的孔，防止封裝的有機染料泄露.在金屬離子輔因子存在下，激活DNAzyme剪切底物，DNAzyme和底物從介孔硅表面脫離，此時介孔硅中封裝的有機染料逐漸釋放出來.作者將該方法應(yīng)用于控制化療藥物阿霉素的可控釋放.利用DNAzyme調(diào)控無機納米材料釋放藥物的方法在未來的藥物可控釋放及藥物靶向釋放方面具有重要意義.

為了進一步實現(xiàn)在細胞中對藥物的可控釋放，Huang等［95］利用金屬-有機框架納米材料（NMOFs）負載化療藥物阿霉素，在材料的表面修飾DNAzyme和底物雙鏈，以封閉藥物［圖20（B）］.該DNAzyme包含ATP適配體，在ATP和輔因子Mg2+的作用下，DNAzyme催化中心形成穩(wěn)定且具有活性的結(jié)構(gòu)，然后剪切底物，脫離NMOFs表面，此時NMOFs中封裝的藥物得以釋放.Willner等［94］將阿霉素（樣品a）、裝載阿霉素的NMOFs（樣品b）和表面修飾DNAzyme和底物且裝載阿霉素的NMOFs（樣品c）分別與正常的乳腺細胞（MCF-10A）和乳腺癌細胞（MDA-MB-231）孵育，發(fā)現(xiàn)只有樣品c對MDA-MB-231癌細胞表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，而不影響MCF-10A細胞.因為ATP在MDA-MB-231細胞中過表達，它可以與Mg2+共同作用，促進修飾有DNAzyme和底物的NMOFs中的藥物釋放并發(fā)揮作用.實驗結(jié)果表明，該DNA?zyme可控釋放策略可以實現(xiàn)在特定環(huán)境下釋放藥物，從而降低對正常組織的毒副作用.

在這一類方法中，可以將DNAzyme比作納米材料的“門”，相應(yīng)的輔因子控制著這個門的開關(guān)，從而實現(xiàn)藥物的“封閉”和“釋放”.

在此基礎(chǔ)上，一些更為巧妙的利用DNAzyme控制藥物釋放進行腫瘤治療的新策略被提出.Wang等［96］首先報道了一種多功能自給自足的DNAzyme驅(qū)動藥物傳遞系統(tǒng)，該系統(tǒng)是由滾環(huán)聚合生成的DNAzyme-底物、Sgc-8c適配體、封裝的pH響應(yīng)ZnO納米顆粒及化療藥物阿霉素（DOX）組成的一個核酸納米海綿.Sgc-8c適配體可以靶向識別并結(jié)合腫瘤細胞表面的酪氨酸蛋白激酶7（PTK7），引導(dǎo)納米海綿靶向進入腫瘤細胞.在細胞的溶酶體酸性條件下，ZnO納米顆粒降解為Zn2+，激活DNAzyme，發(fā)生自剪切，破壞RCA球釋放出DOX，作為化療藥物促進腫瘤細胞凋亡.

Wang等［97］還構(gòu)建了一個功能性更強的RCA納米海綿［97］，該核酸納米海綿包含多個重復(fù)的I-R3 DNAzyme、10-23 DNAzyme和MUC-1適配體序列，并封裝了ZnO納米顆粒和細胞色素C［圖20（C）］.MUC-1適配體靶向腫瘤細胞表面高表達的跨膜蛋白MUC-1，引導(dǎo)納米海綿靶向進入腫瘤細胞內(nèi)，在細胞的溶酶體酸性條件下氧化鋅納米材料降解為鋅離子，激活I(lǐng)-R3 DNAzyme，發(fā)生自剪切，破壞RCA球釋放出10-23 DNAzyme和細胞色素C.10-23 DNAzyme靶向結(jié)合凋亡抑制基因Survivin，氧化鋅納米顆粒產(chǎn)生的游離Zn2+又可以作為10-23 DNAzyme的輔因子，提高其剪切Survivin基因的效率，促進細胞凋亡.同時，RCA釋放出來的細胞色素C也可以促進細胞凋亡.

Yang等［98］發(fā)展了一種用DNAzyme控制水凝膠破裂的策略.由圖20（D）可見，使用DNAzyme及其底物作為交聯(lián)劑制備水凝膠，將金納米顆粒（AuNPs）封裝在水凝膠中.當存在Pb2+時，激活DNAzyme剪切底物，使水凝膠中的交聯(lián)劑斷裂，導(dǎo)致水凝膠破裂溶解釋放AuNPs，溶液相從無色變?yōu)榧t色.根據(jù)顏色的差異可以實現(xiàn)Pb2+的可視化檢測.該策略同樣適用于Cu2+等其它金屬離子的檢測［99］.除了檢測金屬離子外，該方法可以進一步擴展應(yīng)用于藥物緩釋，通過在水凝膠中封裝藥物，再利用金屬離子激活DNAzyme剪切底物，可以達到藥物緩釋的目的.

Fig.20 Schematic presentation of the DNAzyme?induced release of substrates from the nanocontainers(A)[94],schematic presentation of the DNAzyme?induced release of drugs from metal?organic framework(B)[95],the stimulus?responsive cascade activation of DNAzyme for efficient drug delivery in cancer cells(C)[97]and working principle of lead ions DNAzyme cross?linked hydrogel(D)[98]

這種由DNAzyme調(diào)控的核酸納米材料降解釋放藥物的方式，可實現(xiàn)精確有效的藥物緩慢釋放.在這類方法中，DNAzyme作為核酸納米材料的一部分，在相應(yīng)輔因子的作用下激活DNAzyme剪切，破壞納米材料，完全釋放材料中封裝的藥物，與將DNAzyme修飾在材料表面的方式相比，這種方式能更好地釋放封鎖在材料里面的藥物.

3.7 DNAzyme在調(diào)控細胞間相互作用方面的應(yīng)用

通過細胞表面工程調(diào)節(jié)細胞間相互作用和細胞行為對于生物學(xué)研究具有重要意義.科研人員對此已經(jīng)做出了巨大的努力，目前主要是通過大分子或有機代謝物觸發(fā)細胞表面修飾來誘導(dǎo)不同細胞間的組裝，但可控的細胞-細胞相互作用，包括由金屬離子觸發(fā)的細胞間的結(jié)合和分離仍然是一個挑戰(zhàn).

Lu課題組［100］一直致力于提高DNAzyme的性能和擴展其應(yīng)用，最近，他們將DNAzyme轉(zhuǎn)向調(diào)控細胞間的相互作用方面，設(shè)計了一種基于DNAzyme的策略以實現(xiàn)由金屬離子觸發(fā)的可控制的細胞間相互作用.由圖21（A）可見，在Zn2+特異性響應(yīng)的DNAzyme及其底物的5′端均修飾上膽固醇，然后將DNA?zyme和底物分別與T細胞和腫瘤細胞孵育，即可將核酸分別嵌插在這2種細胞膜的表面，將2種細胞混合，細胞膜表面的DNAzyme和底物通過堿基互補配對雜交，從而將T細胞和腫瘤細胞拉近；當存在Zn2+時，激活DNAzyme剪切底物，隨即DNAzyme和底物解離，從而導(dǎo)致2種細胞分離.此外，他們還將該策略用于控制T細胞球和腫瘤細胞球之間的結(jié)合和分離［圖21（B）］.最后，進一步將DNAzyme和底物探針設(shè)計成包含2個DNAzyme和底物的整合序列［圖21（C）］，這2種DNAzyme分別為Zn2+和Mg2+激活的DNAzyme.只有當Zn2+和Mg2+同時存在時，才能激活DNAzyme發(fā)生剪切，破壞DNAzyme和底物雜交雙鏈，使T細胞和腫瘤細胞分離.這種利用DNAzyme控制的T細胞球狀體在不同腫瘤細胞球狀體之間的遷移的方法為未來的治療應(yīng)用開辟了新的途徑.

Fig.21 Cell?cell interaction controlled by DNAzyme[100]

綜上所述，基于金屬依賴性的DNAzyme裂解方法可以有效地操縱細胞行為，包括細胞間的結(jié)合和分離.由于可以使用各種各樣的金屬特異性DNAzyme，該方法能用于構(gòu)建不同金屬離子控制的細胞間作用，提供了一個靈活的平臺來調(diào)節(jié)動態(tài)細胞間行為.

3.8 DNAzyme在邏輯運算方面的應(yīng)用

基于DNA的穩(wěn)定性、可編程性和易于操控等性質(zhì)，DNA已被用于廣泛邏輯運算和模擬生物線路等生物計算領(lǐng)域.因為DNAzyme包含DNA和酶的雙重特性，基于DNAzyme的DNA邏輯線路設(shè)計更加靈活多變，使得DNAzyme在生物工程系統(tǒng)、信息處理和生物計算領(lǐng)域大放異彩.Zhang等［101］受自然界中蛋白質(zhì)的變構(gòu)調(diào)節(jié)的啟發(fā)，提出了一種新的變構(gòu)策略以調(diào)節(jié)DNAzyme的活性而無需改變其核酸序列［圖22（A）］，構(gòu)建了一系列基于DNAzyme的邏輯線路.他們首先設(shè)計了一條寡核苷酸鏈（block）與DNAzyme催化中心雜交，從而抑制DNAzyme活性，在外界核酸（I）的進攻下，通過其toehold部分與block雜交可以將block從DNAzyme催化中心置換下來，使DNAzyme恢復(fù)活性［圖22（B）］.同時還設(shè)計了通過2種核酸共同激活DNAzyme的策略及串聯(lián)的DNAzyme激活策略，即一種刺激物（此處以核酸為例）激活第一級DNAzyme，被激活的DNAzyme剪切產(chǎn)生可以激活第二個DNAzyme的核酸［圖22（C）］.在此策略中，DNA鏈置換被用來調(diào)節(jié)DNAzyme的結(jié)構(gòu)，進而控制DNAzyme的活性.這種模擬自然界中蛋白質(zhì)的激活的策略及級聯(lián)線路的設(shè)計，使得該體系具有模擬分析更復(fù)雜的分子系統(tǒng)的潛力.

Fig.22 Schematic comparison of allosteric regulation of protein and DNAzyme(A),illustrations of DNAzyme?based YES gate(B)and DNAzyme?based two?level cascading circuit(C)[101]

此外，該課題組［102］設(shè)計了一種結(jié)合熵驅(qū)動的鏈置換反應(yīng)（EDR）和DNAzyme的邏輯運算體系（圖23）用于模擬生物工程系統(tǒng)和分子信息處理過程.該體系中，DNAzyme和EDR可以交替參與反應(yīng)，實現(xiàn)級聯(lián)的催化回路，構(gòu)建了一系列邏輯門（YES，AND，OR）.同時，還建立了兩層級聯(lián)電路和反饋自催化電路.所提出的DNAzyme調(diào)控策略在構(gòu)建更復(fù)雜的DNA催化線路方面具有很大的潛力.

Fig.23 Scheme for the entropy?driven DNA logic gate using the DNAzyme?based regulating strategy[102]

4 總結(jié)與展望

本文綜合評述了目前調(diào)控DNAzyme活性的方法及其在生物傳感和臨床診斷等方面的一些應(yīng)用.DNAzyme作為一種具有催化功能的單鏈DNA片段，具有高效的催化活性和結(jié)構(gòu)識別能力，因其分子量小、合成成本低、易于設(shè)計和標記、易于與其它核酸擴增技術(shù)結(jié)合等方面的優(yōu)勢，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域，其應(yīng)用前景仍不斷被挖掘.為了充分發(fā)揮DNAzyme的優(yōu)勢，使其更好地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，仍有一些問題亟待解決：（1）DNAzyme穩(wěn)定性問題.盡管DNAzyme的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性要優(yōu)于傳統(tǒng)蛋白酶，但將其用于實際樣本檢測時，復(fù)雜的樣品組分可能會對DNAzyme的傳感性能造成一定的干擾.（2）底物穩(wěn)定性問題.除了I-R3 DNAzyme底物為全DNA底物外，其它的DNAzyme底物中均包含RNA堿基切割位點，這種RNA嵌合的DNA底物穩(wěn)定性要低于全DNA底物，容易降解，同樣不利于復(fù)雜樣本的分析應(yīng)用.（3）DNAzyme對金屬離子依賴性問題.多數(shù)DNAzyme需要金屬離子作為輔因子才能發(fā)揮作用，因此將這些DNAzyme用于基因治療或其它涉及細胞的研究時，需要考慮到內(nèi)源性金屬離子不足，導(dǎo)致DNAzyme催化活性降低的問題.（4）將DNAzyme用于POCT領(lǐng)域.隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，即時化的POCT設(shè)備備受人們青睞，DNAzyme作為一種強大的核酸工具，在構(gòu)建POCT設(shè)備方面具有廣泛前景，但目前對這方面的研究較為缺乏.在未來的研究中，通過化學(xué)修飾或其它方式提高DNAzyme和底物的穩(wěn)定性以及篩選性能更優(yōu)異的DNAzyme，仍是未來科研工作者需要努力的方向之一.