補(bǔ)腎活血中藥介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路延緩椎間盤終板壓力退變的機(jī)制研究

韓濤，尹遜路，展嘉文，魏戌，馮敏山，于杰，李學(xué)朋，陳明，朱立國(guó)*

椎間盤退行性變（intervertebral disc degeneration，IDD）是導(dǎo)致脊柱退行性疾病的根本因素，也是引起腰腿部疼痛、麻木的主要原因之一[1-2]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)下腰痛就診量在所有到醫(yī)院就診患者中排第2位，僅次于因呼吸道疾病就診量[3]。當(dāng)前，下腰痛這一類疾病無(wú)論在經(jīng)濟(jì)上還是對(duì)人類健康上，已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響[4-5]。終板位于上下椎體末端和鄰近椎間盤交界處，其功能主要為對(duì)椎間盤的力學(xué)傳導(dǎo)與營(yíng)養(yǎng)傳輸。有研究表明，終板退變不僅能夠引發(fā)臨床上脊柱疼痛癥狀，而且還會(huì)加速椎間盤退變[2-3]。

臨床研究證實(shí)，補(bǔ)腎活血中藥可顯著降低椎間盤源性腰痛患者的疼痛評(píng)分及復(fù)發(fā)率[6]。但補(bǔ)腎活血中藥是否通過(guò)介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控終板軟骨細(xì)胞而發(fā)揮延緩IDD的作用，有待進(jìn)一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)將利用自主研發(fā)的脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段離體培養(yǎng)和加載裝置構(gòu)建離體兔脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段退變模型，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（RT-PCR）、Western blot和免疫組化等技術(shù)檢測(cè)退變模型終板軟骨細(xì)胞功能形態(tài)、組織中相關(guān)mRNA及蛋白表達(dá)分布的情況，旨在從分子水平探討補(bǔ)腎活血中藥在該信號(hào)通路中調(diào)控終板軟骨細(xì)胞而發(fā)揮延緩IDD的作用機(jī)制，以期闡明該復(fù)方治療IDD的藥效作用，并為補(bǔ)腎活血中藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)，為中藥復(fù)方干預(yù)骨退變機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究時(shí)間 2019年。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 于北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)采購(gòu)40只健康新西蘭大白兔，雌雄各20只，體質(zhì)量為2.5～3.0 kg，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXX（京）2016-0007。

1.3 藥物、試劑和儀器[7-10]

1.3.1 藥物 補(bǔ)腎活血中藥組成：杜仲15 g、補(bǔ)骨脂10 g、懷牛膝10 g、丹參12 g、威靈仙10 g、木瓜9 g。中藥由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院中藥房提供。

1.3.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），蘇木紅及伊紅染液（杭州化學(xué)試劑廠），DAB顯色劑（北京中杉產(chǎn)品），WB一抗（Gelsolin兔多克隆抗體，美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：Ab74419），WB二 抗（KPL山羊抗兔IgG，美國(guó)KPL公司，貨號(hào)：074-1506），DL2000 DNA Marker（TaKaRa， 貨 號(hào)：3427Q），PVDF膜（美國(guó)Millipore公司，貨號(hào)：PVH00010）。特定基因引物購(gòu)自北京Invitrogen公司，其中Wnt-3α上游引物序列為5'-GAGTTTGGTGGGATGGTGTC-3'，下游引物序列為5'-TGTCGTACTTGTCCTTGAGCAC-3'；β-catenin上 游引物序列為5'-CCTTAGGACTTCACCTGACCGAT-3'，下游引物序列5'-CCTTCCATCCCCTCCTGTTTA-3'。

1.3.3 儀器 無(wú)菌培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），干燥箱（日本三洋，型號(hào)：MIR153），恒溫水浴箱（江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠，型號(hào)：DSHZ300），離心機(jī)（北京離心機(jī)廠，型號(hào)：LDZ5-2），電子D平（瑞士梅特勒公司，型號(hào)：AE100），切片機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號(hào)：Tanon 1600），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems，型號(hào)：ABI7500），脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段離體加載和培養(yǎng)裝置（自主研發(fā)，專利號(hào)：ZL 2014 20568511.9）。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 將40只健康新西蘭兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：對(duì)照組、中藥組、中藥抑制劑組、中藥激動(dòng)劑組，每組10只。對(duì)照組：模型+培養(yǎng)液+無(wú)藥血清；中藥組：模型+培養(yǎng)液+補(bǔ)腎活血中藥含藥血清；中藥激動(dòng)劑組：模型+培養(yǎng)液+SB216763+補(bǔ)腎活血中藥含藥血清；中藥抑制劑組：模型+培養(yǎng)液+ICG001+補(bǔ)腎活血中藥含藥血清。培養(yǎng)液中含有20%胎牛血清、25 μg/ml抗壞血酸、50 mg/ml慶大霉素[11]。

1.4.2 標(biāo)本制備與培養(yǎng) 將新西蘭兔通過(guò)腹腔注射7%水合氯醛（5 ml/kg）全身麻醉后，從耳緣靜脈給予肝素鈉（0.5 ml/kg），5 min后空氣栓塞處死；俯臥位固定，備皮后，用碘酒對(duì)腰背部皮膚進(jìn)行常規(guī)消毒；取腰部正中線縱向切口，依次切開(kāi)筋膜、肌肉組織，取出腰段及下胸段脊柱，將所取脊柱周圍的軟組織和椎弓等骨組織全部剔除，僅保留椎體和椎間盤，PBS沖洗3次；對(duì)取出的脊柱節(jié)段定位，自軟骨終板與椎體結(jié)合處做鈍性分離，最后將兔的L1～2、L3～4、L5～6脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段完整取出，共計(jì)獲得120個(gè)完整脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段；并用PBS、HBSS交替對(duì)所取脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段進(jìn)行3次沖洗，隨后將沖洗完成的樣本置于含培養(yǎng)液的六孔板中保存?zhèn)溆谩?/p>

將所取的脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段放入加載培養(yǎng)裝置中，并通過(guò)該裝置予脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段29.4 N壓力。隨后將離體模型放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，隔天換液。取材時(shí)間為培養(yǎng)前（0 d）和培養(yǎng)后第1、3、7、14天。

1.4.3 取材 將四組脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段離體模型在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取材分離出椎體終板，其中一部分制作成蠟塊標(biāo)本，用于蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化染色以觀察椎間盤終板軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，另一部分取出的椎間盤終板軟骨組織進(jìn)行冷凍處理，用于RT-PCR、Western blot檢測(cè)Wnt-3α、β-catenin mRNA和蛋白的表達(dá)量。

1.5 主要觀察指標(biāo)

1.5.1 HE染色 將上述制作成的蠟塊標(biāo)本切成厚度為5 μm的石蠟帶，并用載玻片在50 ℃溫水中撈片；60 ℃恒溫箱中烤片1 h；然后用二甲苯、乙醇、自來(lái)水、PBS沖洗，進(jìn)行脫蠟至水；用蘇木素染色；再經(jīng)乙醇、二甲苯脫水透明；最后中性樹(shù)脂封片觀察石蠟切片。

1.5.2 免疫組化檢測(cè) 將石蠟包埋好的終板軟骨組織進(jìn)行切片、脫蠟、水化處理，再進(jìn)行3次PBS沖洗；將石蠟切片進(jìn)行20 min熱修復(fù)，2次PBS沖洗；滴加3%的H2O2，室溫下孵育10 min，3次PBS沖洗；滴加5%羊血清，室溫下孵育20 min；去除多余液體；滴一抗，4 ℃過(guò)夜，3次PBS沖洗；滴二抗，37 ℃環(huán)境下孵育20 min，PBS沖洗（5 min/次，3次）；滴辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37 ℃環(huán)境下孵20 min，PBS沖洗（5 min/次，3次）；使用DAB試劑盒（1 ml底物滴加1滴顯色劑），混勻后，加至標(biāo)本，顯色6 min，充分水洗；蘇木素染色；脫水、透明；中性樹(shù)脂封片觀察石蠟切片。

應(yīng)用CMOS（日本OLYMPUS公司）及專用軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司Image-Pro Plus）系統(tǒng)測(cè)量免疫組化染色切片，得到平均光密度值（mean optical density，MOD），分析蛋白多糖和Ⅱ型膠原的相對(duì)表達(dá)量。

1.5.3 RT-PCR檢測(cè)Wnt-3α、β-catenin mRNA表達(dá)水平 將終板軟骨組織從液氮中取出，剪成細(xì)小的碎片后放于含有液氮的研缽中快速研磨成粉末狀；加入Trizol（室溫，5 min）；加入氯仿0.2ml；離心（離心半徑10 cm，轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心15 min）。檢測(cè)終板軟骨組織RNA濃度及純度；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；然后進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增。

1.5.4 Wstern blot檢測(cè)Wnt-3α、β-catenin蛋白表達(dá)水平 向終板軟骨組織樣品中加入適量裂解液并進(jìn)行蛋白提??；依照電泳上樣量需要，用水及5×loading buffer調(diào)整蛋白濃度，100 ℃煮沸變性5 min；取少量上清液進(jìn)行定量。SDS-PAGE凝膠制備。將藏于-80 ℃冰箱中的終板軟骨組織總蛋白樣品進(jìn)行融化；根據(jù)蛋白定量結(jié)果，將終板軟骨組織總蛋白樣品及蛋白質(zhì)上樣緩沖液混勻，并進(jìn)行95 ℃變性；凝膠電泳，即取30 μg樣品放入凝膠孔中，并使樣品通過(guò)濃縮膠與分離膠。最后進(jìn)行孵育、檢測(cè)，即在凝膠電泳結(jié)束后，將蛋白條帶進(jìn)行轉(zhuǎn)移電泳，在其印轉(zhuǎn)到固相支持物的同時(shí)加入一抗和二抗。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行圖制作，應(yīng)用IBM SPSSS tatistics 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較采用方差分析，多組間比較采用方差分析，兩兩比較在方差齊時(shí)采用LSD分析法，方差不齊時(shí)采用dunnett T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 椎間盤軟骨終板軟骨組織經(jīng)HE染色，培養(yǎng)前軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)圓形，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)均勻紅染，軟骨層排列致密規(guī)則；培養(yǎng)第7天時(shí)中藥組軟骨細(xì)胞分散程度、數(shù)目及軟骨層排列均較對(duì)照組完整；培養(yǎng)第14天時(shí)對(duì)照組和中藥組終板軟骨組織退變程度均加重，對(duì)照組退變程度較中藥組更加明顯。中藥激動(dòng)劑組較中藥抑制劑組培養(yǎng)第3天時(shí)終板軟骨組織結(jié)構(gòu)的完整性、軟骨層排列較好。見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照組和中藥組各時(shí)間點(diǎn)及中藥抑制劑組和激動(dòng)劑組椎間盤終板軟骨矢狀面切片HE染色（×400）Figure 1 HE staining of sagittal sections of intervertebral disc cartilage endplate before culture and on different days of culture in control group， herb group，herb inhibition group and herb activation group

2.2 免疫組化檢測(cè)

2.2.1 蛋白多糖 蛋白多糖免疫組化檢測(cè)，見(jiàn)圖2，培養(yǎng)前軟骨細(xì)胞外基質(zhì)呈棕黃色，顏色較深；中藥組培養(yǎng)第1、3天時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)染色棕褐色陽(yáng)性反應(yīng)較對(duì)照組強(qiáng)烈。中藥組與對(duì)照組培養(yǎng)第1、3天時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組及對(duì)照組培養(yǎng)第7、14天細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖表達(dá)量均較培養(yǎng)前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而中藥組與對(duì)照組細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。中藥激動(dòng)劑組培養(yǎng)第3天時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)染色呈現(xiàn)棕褐色陽(yáng)性反應(yīng)，中藥抑制劑組培養(yǎng)第3天時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)染色強(qiáng)度較弱，中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組蛋白多糖表達(dá)量與中藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2、表3。

圖2 各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組與中藥組以及中藥抑制劑組與中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板軟組織內(nèi)蛋白多糖免疫組化染色（×400）Figure 2 Immunohistochemical staining of proteoglycan in soft tissue of intervertebral disc cartilage endplate on different days of culture in control group，herb group，herb inhibition group， and herb activation group

表1 免疫組化檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板蛋白多糖表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of expression of proteoglycan in intervertebral disc cartilage endplates between control group and herb group at baseline and on different days of culture detected by immunohistochemical

表1 免疫組化檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板蛋白多糖表達(dá)量比較（±s）Table 1 Comparison of expression of proteoglycan in intervertebral disc cartilage endplates between control group and herb group at baseline and on different days of culture detected by immunohistochemical

注：與培養(yǎng)前比較，aP<0.05

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第1天 第3天 第7天 第14天 F值 P值對(duì)照組 3 0.264±0.011 0.218±0.005a 0.209±0.008a 0.204±0.013a 0.203±0.007a 22.862 <0.001中藥組 3 0.264±0.011 0.260±0.007a 0.241±0.018a 0.229±0.014a 0.227±0.016a 4.687 0.022 t值 0.000 -8.695 -2.843 -2.339 -2.358 P值 1.000 0.001 0.047 0.079 0.078

表2 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板蛋白多糖表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of proteoglycan in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

表2 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板蛋白多糖表達(dá)量比較（±s）Table 2 Comparison of expression of proteoglycan in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 0.264±0.011 0.241±0.018中藥激動(dòng)劑組 3 0.264±0.011 0.273±0.008 t值 0.000 -2.814 P值 1.000 0.048

表3 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板蛋白多糖表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of expression of proteoglycan in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

表3 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板蛋白多糖表達(dá)量比較（±s）Table 3 Comparison of expression of proteoglycan in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 0.264±0.011 0.241±0.018中藥抑制劑組 3 0.264±0.011 0.207±0.008 t值 0.000 2.990 P值 1.000 0.040

2.2.2 Ⅱ型膠原 Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè)，見(jiàn)圖3，培養(yǎng)前軟骨細(xì)胞外基質(zhì)呈棕黃色，顏色較深；中藥組及對(duì)照組培養(yǎng)第1、3天時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)均呈棕褐色陽(yáng)性反應(yīng)，中藥組與對(duì)照組細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組及對(duì)照組培養(yǎng)第7、14天時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原表達(dá)量均較培養(yǎng)前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；對(duì)照組Ⅱ型膠原表達(dá)量較中藥組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表4。中藥激動(dòng)劑組第3天時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)染色呈現(xiàn)強(qiáng)烈的棕褐色陽(yáng)性反應(yīng)，中藥抑制劑組第3天時(shí)染色強(qiáng)度較弱；中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原表達(dá)量分別與中藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表5、表6。

圖3 各時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組與中藥組以及中藥抑制劑組與中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板軟組織內(nèi)Ⅱ型膠原免疫組化染色（×400）Figure 3 Immunohistochemical staining of type Ⅱ collagen in the soft tissue of intervertebral disc cartilage endplate before culture and on different days of culture in control group， herb group，herb inhibition group and herb activation group

表4 免疫組化檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板Ⅱ型膠原表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of expression of type Ⅱ collagen in the intervertebral disc cartilage endplate between control group and herb group at baseline and 1，3，7，14 days post-culture detected by immunohistochemical

表4 免疫組化檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板Ⅱ型膠原表達(dá)量比較（±s）Table 4 Comparison of expression of type Ⅱ collagen in the intervertebral disc cartilage endplate between control group and herb group at baseline and 1，3，7，14 days post-culture detected by immunohistochemical

注：與培養(yǎng)前比較，aP<0.05

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第1天 第3天 第7天 第14天 F值 P值對(duì)照組 3 0.229±0.003 0.209±0.006a 0.207±0.005a 0.196±0.008a 0.185±0.005a 23.778 <0.001中藥組 3 0.229±0.003 0.244±0.009a 0.237±0.005 0.216±0.008a 0.209±0.006a 15.006 0.010 t值 0.000 -5.520 -7.803 -3.111 -5.078 P值 1.000 0.005 0.001 0.036 0.007

表5 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板Ⅱ型膠原表達(dá)量比較（±s）Table 5 Comparison of expression of type Ⅱ collagen in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

表5 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板Ⅱ型膠原表達(dá)量比較（±s）Table 5 Comparison of expression of type Ⅱ collagen in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 0.229±0.003 0.237±0.005中藥激動(dòng)劑組 3 0.229±0.003 0.252±0.007 t值 0.000 -3.020 P值 1.000 0.039

表6 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板Ⅱ型膠原表達(dá)量比較（±s）Table 6 Comparison of expression of type Ⅱ collagen in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

表6 免疫組化檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板Ⅱ型膠原表達(dá)量比較（±s）Table 6 Comparison of expression of type Ⅱ collagen in intervertebral disc cartilage endplates between herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by immunohistochemical

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 0.229±0.003 0.237±0.005中藥抑制劑組 3 0.229±0.003 0.212±0.008 t值 0.000 4.590 P值 1.000 0.010

2.3 RT-PCR檢測(cè)

2.3.1 Wnt-3α mRNA表 達(dá) RT-PCR檢 測(cè) Wnt-3α mRNA表達(dá)。中藥組及對(duì)照組Wnt-3α mRNA表達(dá)水平均較培養(yǎng)前逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組培養(yǎng)第1、3、7、14天時(shí)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表7。中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組第3天時(shí)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平分別與中藥組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表8、表9。

表7 RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 7 Comparison of Wnt-3α mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates between control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture detected by RT-PCR

表7 RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 7 Comparison of Wnt-3α mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates between control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture detected by RT-PCR

注：與培養(yǎng)前比較，aP<0.05

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第1天 第3天 第7天 第14天 F值 P值對(duì)照組 3 30.569±0.069 28.868±0.076a 28.375±0.057a 27.091±0.075a 25.843±0.099a 1 650.800 <0.001中藥組 3 30.536±0.069 29.843±0.028a 25.832±0.298a 25.569±0.148a 24.686±0.245a 616.503 <0.001 t值 0.586 -20.944 14.523 15.937 7.592 P值 0.589 <0.001 <0.001 <0.001 0.002

表8 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 8 Comparison of Wnt-3α mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

表8 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 8 Comparison of Wnt-3α mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 30.536±0.069 25.832±0.298中藥激動(dòng)劑組 3 30.536±0.069 26.417±0.226 t值 0.000 -2.709 P值 1.000 0.054

表9 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 9 Comparison of Wnt-3α mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

表9 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 9 Comparison of Wnt-3α mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 30.536±0.069 25.832±0.298中藥抑制劑組 3 30.536±0.069 25.289±0.201 t值 0.000 2.617 P值 1.000 0.059

2.3.2 β-catenin mRNA表達(dá) RT-PCR檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá)。中藥組及對(duì)照組β-catenin mRNA表達(dá)水平均較培養(yǎng)前逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組培養(yǎng)第1、3、7、14天時(shí)β-catenin mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表10。中藥激動(dòng)劑組第3天時(shí)β-catenin mRNA表達(dá)水平較中藥組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表11；中藥抑制劑組第3天時(shí)β-catenin mRNA表達(dá)水平較中藥組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表12。

表10 RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 10 Comparison of β-catenin mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in control group and herb group at baseline and 1，3，7，14 days post-culture detected by RT-PCR

表10 RT-PCR檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 10 Comparison of β-catenin mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in control group and herb group at baseline and 1，3，7，14 days post-culture detected by RT-PCR

注：與培養(yǎng)前比較，aP<0.05

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第1天 第3天 第7天 第14天 F值 P值對(duì)照組 3 33.500±0.246 31.580±0.059a 30.491±0.201a 29.352±0.078a 29.089±0.094a 409.059 <0.001中藥組 3 33.468±0.246 30.437±0.071a 29.576±0.240a 28.443±0.109a 28.259±0.181a 398.711 <0.001 t值 -1.600 -21.573 -5.07 -11.757 -7.044 P值 0.881 <0.001 0.007 <0.001 0.002

表11 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 11 Comparison of β-catenin mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

表11 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 11 Comparison of β-catenin mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 33.500±0.246 29.576±0.240中藥激動(dòng)劑組 3 33.500±0.246 28.802±0.201 t值 0.000 4.282 P值 1.000 0.013

表12 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 12 Comparison of β-catenin mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

表12 RT-PCR檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin mRNA表達(dá)水平比較（±s）Table 12 Comparison of β-catenin mRNA expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture detected by RT-PCR

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 33.500±0.246 29.576±0.240中藥抑制劑組 3 33.500±0.246 30.285±0.200 t值 0.000 -3.931 P值 1.000 0.017

2.4 Western blot檢測(cè)

2.4.1 Wnt-3α 蛋白表達(dá) Western blot檢測(cè)Wnt-3α蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖4、5。中藥組及對(duì)照組培養(yǎng)第1、3、7、14天時(shí)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平與培養(yǎng)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組培養(yǎng)第1、3、7、14天時(shí)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表13。中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組第3天時(shí)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平分別與中藥組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表14、表15。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平電泳圖Figure 4 Electrophoretogram of Wnt-3α protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture

圖5 中藥組、中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平電泳圖Figure 5 Electrophoretogram of Wnt-3α protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group，herb activation group，and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture

表13 Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 13 Comparison of the expression levels of Wnt-3α protein in the endplate between the control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture measured by Western blot

表13 Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 13 Comparison of the expression levels of Wnt-3α protein in the endplate between the control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture measured by Western blot

注：與培養(yǎng)前比較，aP<0.05

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第1天 第3天 第7天 第14天 F值 P值對(duì)照組 3 0.843±0.010 1.036±0.007a 0.535±0.008a 0.374±0.009a 0.235±0.008a 4 760.688 <0.001中藥組 3 0.846±0.017 1.256±0.009a 1.046±0.009a 0.684±0.009a 0.546±0.008a 2 050.339 <0.001 t值 -2.278 19.168 7.050 3.160 5.267 P值 0.108 <0.001 0.008 0.038 0.019

表14 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 14 Comparison of Wnt-3α protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

表14 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 14 Comparison of Wnt-3α protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 0.846±0.017 1.046±0.009中藥激動(dòng)劑組 3 0.846±0.017 1.003±0.007 t值 0.000 6.620 P值 1.000 0.076

表15 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 15 Comparison of Wnt-3α protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

表15 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)Wnt-3α蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 15 Comparison of Wnt-3α protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 0.846±0.017 1.046±0.009中藥抑制劑組 3 0.846±0.017 1.003±0.008 t值 0.000 6.235 P值 1.000 0.063

2.4.2 β-catenin蛋白表達(dá) Western blot檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖6、7。中藥組及對(duì)照組培養(yǎng)第1、3、7、14天時(shí)β-catenin蛋白表達(dá)水平與培養(yǎng)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；中藥組培養(yǎng)第1、3、7、14天時(shí)β-catenin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表16。中藥激動(dòng)劑組第3天時(shí)β-catenin蛋白表達(dá)水平與中藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表17；中藥抑制劑組第3天時(shí)β-catenin蛋白表達(dá)水平較中藥組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表18。

圖6 不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平電泳圖Figure 6 Electrophoretogram of β-catenin protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture

圖7 中藥組、中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平電泳圖Figure 7 Electrophoretogram of β-catenin protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group， herb activation group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture

表16 Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 16 Comparison of β-catenin protein expression levels in the endplate between control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture measured by Western blot

表16 Western blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與中藥組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 16 Comparison of β-catenin protein expression levels in the endplate between control group and herb group at baseline and 1，3，7，and 14 days post-culture measured by Western blot

注：與培養(yǎng)前比較，aP<0.05

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第1天 第3天 第7天 第14天 F值 P值對(duì)照組 3 1.309±0.021 1.513±0.010a 0.799±0.009a 0.504±0.010a 0.382±0.011a 4 267.794 <0.001中藥組 3 1.306±0.009 1.672±0.015a 1.248±0.008a 1.043±0.008a 0.605±0.019a 2 936.541 <0.001 t值 1.251 10.130 26.359 25.108 18.783 P值 0.298 0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表17 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 17 Comparison of β-catenin protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

表17 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥激動(dòng)劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 17 Comparison of β-catenin protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb activation group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 1.306±0.009 1.248±0.008中藥激動(dòng)劑組 3 1.306±0.009 1.219±0.021 t值 0.000 2.215 P值 1.000 0.130

表18 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 18 Comparison of β-catenin protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

表18 Western blot檢測(cè)中藥組、中藥抑制劑組椎間盤終板內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)水平比較（±s）Table 18 Comparison of β-catenin protein expression levels in intervertebral disc cartilage endplates in herb group and herb inhibition group at baseline and 3 days post-culture measured by Western blot

組別 節(jié)段個(gè)數(shù) 培養(yǎng)前 第3天中藥組 3 1.306±0.009 1.248±0.008中藥抑制劑組 3 1.306±0.009 1.334±0.007 t值 0.000 -14.743 P值 1.000 <0.001

3 討論

軟骨組織是椎間盤終板的主要結(jié)構(gòu)，而軟骨細(xì)胞又是構(gòu)成軟骨組織的唯一細(xì)胞，軟骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性以及正常的細(xì)胞增殖和分化凋亡均與機(jī)械刺激密不可分，因?yàn)闄C(jī)械刺激可以調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)軟骨組織中的重要成分Ⅱ型膠原、蛋白多糖的表達(dá)，以及軟骨新陳代謝所需酶的分泌[12]，當(dāng)椎間盤長(zhǎng)期受到外界異常的負(fù)載時(shí)，其聚合體會(huì)發(fā)生崩解，并且其含量減少、成分構(gòu)成發(fā)生改變，這些異常改變是IDD發(fā)生的病理基礎(chǔ)[11，13-14]。并且相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，終板軟骨組織中蛋白多糖及Ⅱ型膠原的合成與細(xì)胞活性具有線性關(guān)系，而軟骨細(xì)胞活性與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)和椎間盤內(nèi)代謝產(chǎn)物的排出具有密切關(guān)系，這一系列因素會(huì)最終導(dǎo)致椎間盤退變發(fā)生[15]。

依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論，椎間盤退行性疾病主要的病因病機(jī)為肝腎不足、血瘀氣滯，故補(bǔ)腎活血是臨床上治療該類疾病的主要方法。補(bǔ)腎活血中藥是在我國(guó)古代醫(yī)書(shū)---《太平惠民和劑局方》中青娥丸的基礎(chǔ)上，運(yùn)用辨證論治方法進(jìn)行加減形成的。該方以杜仲為君藥，補(bǔ)骨脂和懷牛膝為臣藥，丹參、威靈仙、木瓜為佐使藥，共奏補(bǔ)腎健脾以治本、活血通絡(luò)以治標(biāo)的功效。

脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段模型在維持其自身穩(wěn)定性方面較離體椎間盤器官模型好[10，16-18]，所受外界刺激影響也較離體椎間盤器官模型低，較單獨(dú)椎間盤器官培養(yǎng)更接近體內(nèi)環(huán)境，因此本實(shí)驗(yàn)為使研究更具真實(shí)性和可行性，選取了兔的脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段作為實(shí)驗(yàn)的離體模型。本實(shí)驗(yàn)所用的裝置是團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段離體培養(yǎng)和加載裝置，該裝置可以對(duì)離體模型進(jìn)行類似體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)和力學(xué)刺激，所以可以更加直觀地研究椎間盤軟骨終板對(duì)力學(xué)刺激的反應(yīng)，該裝置可以在不破壞椎間盤的情況下，使整個(gè)椎間盤器官在培養(yǎng)液中進(jìn)行離體培養(yǎng)，并且可以在其模型上進(jìn)行力學(xué)加載，模擬人體脊柱退行性改變。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組培養(yǎng)第1天時(shí)蛋白多糖表達(dá)量較培養(yǎng)前顯著降低，而中藥組蛋白多糖表達(dá)量則較對(duì)照組降低幅度較??；中藥組在培養(yǎng)第1天時(shí)Ⅱ型膠原表達(dá)量較培養(yǎng)前出現(xiàn)升高，之后又逐漸降低，而對(duì)照組則逐漸降低；以上結(jié)果提示該方在延緩椎間盤終板軟骨組織中蛋白多糖、Ⅱ型膠原等相關(guān)蛋白表達(dá)量上具有一定作用。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥組及對(duì)照組中Wnt-3α、β-catenin mRNA表達(dá)水平隨著時(shí)間推移均逐漸降低，但中藥組Wnt-3α、β-catenin mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組相比下降更加明顯。在Western blot檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，中藥組及對(duì)照組在培養(yǎng)第1天時(shí)Wnt-3α、β-catenin蛋白表達(dá)水平均升高，結(jié)合前期研究，出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能與離體培養(yǎng)改變了其生存環(huán)境有關(guān)，以及該離體培養(yǎng)模型中壓力刺激造成的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)[19]；并且中藥組該兩種基因表達(dá)水平較對(duì)照組增加更為明顯，提示該方在短期內(nèi)可以刺激終板軟骨細(xì)胞合成和分泌相關(guān)蛋白，長(zhǎng)期可以延緩相關(guān)蛋白的減少。在培養(yǎng)1 d后兩組基因表達(dá)水平隨著軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少和功能活性的降低而逐漸降低，這與HE染色結(jié)果相符。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)腎活血中藥在延緩椎間盤退變中是否與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，本研究設(shè)置了中藥激動(dòng)劑組（SB216763）和中藥抑制劑組（ICG001）。本研究結(jié)果顯示，中藥激動(dòng)劑組中的蛋白多糖、Ⅱ型膠原表達(dá)量在培養(yǎng)第3天時(shí)有少量增加；RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組Wnt-3α mRNA表達(dá)水平與中藥組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），而中藥激動(dòng)劑組β-catenin mRNA表達(dá)水平較中藥組降低（P<0.05），中藥抑制劑組β-catenin mRNA表達(dá)水平較中藥組升高（P<0.05）；Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，中藥激動(dòng)劑組、中藥抑制劑組Wnt-3α蛋白表達(dá)水平分別與中藥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而中藥抑制劑組β-catenin蛋白表達(dá)水平較中藥組升高（P<0.05），中藥激動(dòng)劑組β-catenin蛋白表達(dá)水平與中藥組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了補(bǔ)腎活血中藥可以通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路上的相關(guān)蛋白來(lái)調(diào)控終板軟骨細(xì)胞的表達(dá)，干預(yù)終板軟骨組織退變，從而延緩椎間盤退變進(jìn)程。本研究是利用離體培養(yǎng)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，其中如缺氧環(huán)境及局部血液循環(huán)障礙等因素使本實(shí)驗(yàn)存在一定局限性和不足，在體實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)是完善研究和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的下一步重要方向。

作者貢獻(xiàn)：韓濤、尹遜路負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的造模、取材與培養(yǎng)，數(shù)據(jù)分析，論文撰寫與修改；展嘉文、李學(xué)朋、陳明負(fù)責(zé)觀察指標(biāo)測(cè)定、數(shù)據(jù)整理；魏戌、馮敏山、于杰負(fù)責(zé)研究的設(shè)計(jì)與可行性分析；朱立國(guó)對(duì)文章進(jìn)行審核，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。