• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面法優(yōu)化余甘子種質(zhì)資源ISSR反應(yīng)體系

    2021-11-12 10:23王建超何銀鶯黃旭萍沈朝貴陳發(fā)興郭林榕
    關(guān)鍵詞:體系優(yōu)化

    王建超 何銀鶯 黃旭萍 沈朝貴 陳發(fā)興 郭林榕

    摘要:【目的】優(yōu)化余甘子種質(zhì)資源ISSR-PCR反應(yīng)體系,為余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究提供基礎(chǔ)?!痉椒ā恳跃挼椤⒂《?、廣東、云南、福建等5份來源小同的余甘子種質(zhì)資源的基因組DNA組成混合的DNA模板,綜合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,分析引物濃度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火溫度等反應(yīng)條件對(duì)IS SR-PCR反應(yīng)體系的影響,優(yōu)化建立余甘子IS SR-PCR反應(yīng)體系?!窘Y(jié)果】引物濃度和2×Taq MasterMix添加量對(duì)擴(kuò)增效果有較大影響,DNA模板量影響較小;引物濃度和DNA模板量交互作用明顯;余甘子ISSR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umol L-l,2×Taq Master Mix添加量l3 uL, DNA模板量30 ng,擴(kuò)增結(jié)果與響應(yīng)面分析模型理論值相對(duì)誤差儀為9.39%;退火溫度為50.5- 52.7℃時(shí),隨著溫度的升高,條帶質(zhì)量變好,數(shù)量變多,退火溫度為52.7℃時(shí)可獲得多樣性好的清晰條帶。【結(jié)論】獲得ISSR-PCR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umoI·L-1,2×Taq MasterMix添加量13 UL, DNA模板量30 ng,退火溫度52.7℃,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35循環(huán),擴(kuò)增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定,多樣性好,該體系適于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系等分析研究

    關(guān)鍵詞:余甘子;ISSR-PCR;響應(yīng)面;體系優(yōu)化

    中圖分類號(hào):S 682.310.36

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1008-0384( 2021) 07-075907

    Response Surface Optimization of ISSR-PCR Reaction for Genetic Study on

    Phyllanthus Emblica

    WANG Jianchao1.2. HE Yinying2. HUANG Xuping2, SHEN Chaoguj1, CHEN Faxing2. Guo Linrong1*

    (l.Fruit Research Institute, Fujian Academy ofAgricultural Sciences. Fuzhou, Fujian 350013,China:

    2.College ofHorticulture, Fujian Agriculture and Forestrv University. Fuzhou, Fujian 350002. China)

    Abstract: 【Objective】 ISSR-PCR reaction system for genetic study on Phyllanthus emblica germplasms was optimized【Methods】 A mixed DNA template composed of genomic DNA ofP emblica germplasms came from Myanmar. India.Guangdong, Yunnan, and Fujian was obtained. The single factor test and response surface analysis were used to optimize theISSR-PCR reaction conditions including primer concentration. amount of 2×Taq Master Mix. DNA template amount, andannealing temperature.【Result】 The primer concentration and addition amount of 2×Taq Master Mix had a greater impacton the amplification than did the DNA template amount. A significant interaction between the primer concentration and DNAtemplate amount was found. The optimized system with a primer concentration of 0.4 ymoI·L-1.a 2×Taq Master Mix of13 UL, and a DNA template concentration of 30 ng was established that achieved a low relative error of 9.39% in predicting thetheoretical response. Within the annealing temperature between 50.5 ℃ and 52.7 ℃. increasing temperature improved thenumber and quality of bands. When the annealing temperature is 50.5-52.7.C,the number of strips increases. and the quality ofthe strips becomes better with the increase of temperature. The annealing temperature is 52.7℃to obtain good diversity andclear bands. 【Conclusion】 The optimized ISSR-PCR reaction system was established applying a primer concentration of0.4 umoI-L-1,a 2×Taq Master Mix ofl3L,aDNA template concentration of 30 ng at the annealing temperature of 52.7℃for35 amplification cycles. The methodology could be used to study the genetic diversity and relationship of P. emblicagermplasms .

    1.3統(tǒng)計(jì)分析

    采用Excel 2016、Design Expert 8.0.6等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,其中Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型的建立。

    2結(jié)果與分析

    2.1單因素對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

    單因素試驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2,可見,引物濃度與2×Taq Master Mix添加量對(duì)反應(yīng)體系的影響較大。引物濃度偏高或偏低都會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果,引物濃度過高會(huì)引起引物與DNA模板錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增,增加產(chǎn)生二聚體的概率,引物濃度偏低則不易測(cè)出擴(kuò)增位點(diǎn),本研究引物濃度為0.30~0.40 umol.L-l時(shí)電泳效果較好。2×Taq Master Mix含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg2+等反應(yīng)原料,Taq DNA聚合酶直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的成功與否,濃度過高容易產(chǎn)生非特異的PCR產(chǎn)物,dNTP是ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增的重要原料,濃度過高易錯(cuò)配,過低影響合成效率,2×Taq MasterMix添加量為12~14 uL為最佳。DNA模板量范圍取決于物種基因組大小和DNA純度,研究表明,DNA模板量對(duì)余甘子ISSR-PCR的影響較小,考慮電泳條帶質(zhì)量和數(shù)量,選擇DNA模板量最佳為30 ng。

    2.2響應(yīng)面法優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系

    以電泳圖譜(圖3)中電泳條帶數(shù)量、清晰度、重復(fù)性、亮度和背景干凈程度的評(píng)分(5名科研T作者主觀評(píng)分)為響應(yīng)值(表4),采用多元回歸擬合,獲得引物濃度(X1),2×Taq Master Mix添加量(X2),DNA模板量(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型為F=11.92-0.437 5X1-O.5 5X2 -1.737 5X2-0.75XIX21.575XIX3-0.55X2X3-4.2975Xl2-3.5225X2--2.1975X32。檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析電泳圖評(píng)分為響應(yīng)值時(shí),該二次方程模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-0.012 6<0.05),說明該模型對(duì)本試驗(yàn)有較好擬合;回歸方程失擬性檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-0.7571),表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小,模型能較好地反應(yīng)真實(shí)的試驗(yàn)值,可用于響應(yīng)值的分析和預(yù)測(cè),所得的回歸方程模型能較好地預(yù)測(cè)電泳圖譜得分隨各參數(shù)的變化規(guī)律。試驗(yàn)所選三因子X1、X2和X3中X3達(dá)到顯著影響(p<0.05),Xl、X2因子二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著影響(p<0.001)表明單因素X2對(duì)響應(yīng)結(jié)果影響較大,且X1與X2因子有極顯著的交互影響。

    根據(jù)回歸擬合方程得出各試驗(yàn)因子引物濃度(X)、2×Taq Master Mix添加量(X2)、DNA模板量(X3)兩兩因素交互作用的等高線圖(圖4),等高線圖可直觀反映出2個(gè)變量間交互作用的顯著程度,其中圓形表示兩兩因素交互作用不顯著,而橢圓形表示兩兩因素交互作用顯著[16];等高線圖由藍(lán)到紅的變化越快,沿白變量方向高度差越大[17],引物濃度(Xl)和DNA模板量(X3)之間交互作用顯著。

    根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件分析出的若干解決方案與其相應(yīng)預(yù)測(cè)得分值,考慮到保證高響應(yīng)值的同時(shí)節(jié)約成本,對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)分析驗(yàn)證,得到ISSR反應(yīng)體系的實(shí)際值(圖5),該值與理論預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較計(jì)算相對(duì)誤差,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,最優(yōu)實(shí)際解決方案引物濃度為0.40 umol·L-1,2×Taq Master Mix添加量為13.0 uL,DNA模板量30 ng,該條件與理論預(yù)測(cè)響應(yīng)值13.130 4的相對(duì)誤差僅為9.39%,說明該模型具有好的分析能力,可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。

    2.3退火溫度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

    退火溫度影響ISSR圖譜的穩(wěn)定性,較低的退火溫度可保證引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性,但較易產(chǎn)生錯(cuò)誤的擴(kuò)增。由電泳圖譜(圖6)可知,35循環(huán)數(shù)下,50.5~54.0℃隨著退火溫度的升高譜帶質(zhì)量與條帶數(shù)有較明顯的變化,退火溫度為50.5—52.7℃時(shí),隨著溫度的升高條帶數(shù)呈增加趨勢(shì),條帶質(zhì)量變好,52.7~54.0℃時(shí),部分條帶模糊,缺失。選擇較高的退火溫度可減少引物和模板間非特異性的結(jié)合,提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,綜合譜帶質(zhì)量和條帶數(shù),退火溫度為52.7℃時(shí)最佳,可獲得較好的擴(kuò)增效果。

    通過優(yōu)化得到ISSR-PCR反應(yīng)的體系為引物濃度為0.4 umol·1-1,2×Taq Master Mix添加量為13 uL,DNA模板量30 ng,退火溫度為52.7 0C,循環(huán)次數(shù)35次;將該體系應(yīng)用于不同余甘子種質(zhì)資源效果見圖7,引物UBC841在該體系下可擴(kuò)增出條帶清晰和多態(tài)性良好的電泳圖譜,表明該體系適宜應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。

    3討論與結(jié)論

    ISSR是在SSR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的分子標(biāo)記,目前,ISSR已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳圖譜、遺傳多樣性及分子生態(tài)學(xué)研究[18.19]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)基于PCR反應(yīng),其擴(kuò)增譜帶受反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序變化以及物種不同的影響,采用不同的反應(yīng)體系組合和擴(kuò)增程序電泳結(jié)果差異較大,因此,開發(fā)ISSR分子標(biāo)記對(duì)其反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序優(yōu)化顯得必不可少。

    本研究綜合運(yùn)用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法,首先確定了各因素的有效范圍,再對(duì)各因素組合優(yōu)化,從而確立普遍適用于余甘子種質(zhì)資源的ISSR-PCR反應(yīng)體系。本研究PCR擴(kuò)增采用2×Taq MasterMix試劑,該試劑將多種擴(kuò)增原料混合,研究結(jié)果雖未能直觀體現(xiàn)Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+等原料對(duì)余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響[20],但可大大提高T作效率,達(dá)到了節(jié)省物料、簡便、快速的目的,可在ISSR分子標(biāo)記研究中加以推廣應(yīng)用。本研究結(jié)果表明引物濃度對(duì)余甘子ISSR反應(yīng)體系影響較大,DNA模板量與引物濃度有顯著的交互作用,與前人研究較一致[21.22]。應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)影響ISSR反應(yīng)體系的主要因素進(jìn)行篩選,建立余甘子ISSR反應(yīng)體系模型F=11.92-0.437 5X1-0.55X2 1.737 5X30.75XIX2 1.575X1X3 0.55X2X3 4.297 5Xl2 3.522 5X222.197 5X22,可較快地得到最優(yōu)組合,避免了單因素試驗(yàn)結(jié)果的不足。

    本研究確立余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系:引物濃度為0.4 UMol·1,2×Taq Master Mix添加量為13 UL,DNA模板濃度30 ng,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35循環(huán),退火溫度52.7℃;擴(kuò)增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定,多樣性好,可應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究。

    參考文獻(xiàn):

    [1]潘慧清,朱平,魏學(xué)明,等藏藥余甘子研究概[J]。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2019,36 (2):8488

    PAN H Q,ZHU P, WEI X M,et al On Tibetan medicine Yuganzi(Phylianthi fructus) [Jl Journal of Gansu University of ChineseMedicine. 2019. 36(2):8488.( in Chinese)

    [2] 國家藥典委員會(huì)中華人民共和國典一部[M]北京:中國醫(yī)藥利技出版社、2020 186-187

    [3] 趙謀明,劉曉麗,崔春,等余甘子多酚響應(yīng)面法優(yōu)化提取及其抗氧化活性研究[J]食品工業(yè)科技,2007. 28 (6):117-120

    ZHAO M M. LIU X L,CUI C,et al.Studv on the optimizingextraction processing of polyphenol from Phyllanthus emblicaL fruitby method of response surface analvsis and its antioxidant activity [J]Science and Technology of Food Industry, 2007. 28(6):117-120( in Chinese)

    [4] GANTAIT s,MAHANTA M. BERA s,et al Advances iiibiotechnology of Emblica officinalis Gaertn. syn. Phyllanthus emblicaL:A nutraceuticals-rich fruit tree with multifaceted ethnomedicinaluses [J]3 Biotech. 2021. 11 (2);1-25

    [5] ZIETKIEWICZ E,RAFALSKI A. LABUDA D Genomefmgerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerasechain reaction amplification [J] Genomics. 1994. 20(2):176-183

    [6] SARWAT M. DAS s,SRIVASTAVA P s Analysis of geneticdiversity through AFLP. SAMPL. ISSR and RAPD markers iiiTribulus terrestris.a medicinal herb [J]. Plant Cell Reports, 2008.27 (3) 519528

    [7] 楊培奎,鄭道序,馬瑞君,等潮汕橄欖地方品種(系)遺傳多樣性的ISSR分析[J]廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013. 40 (23):129-132

    YANG P K. ZHENG D X. MA R J,et al_ Genetic diversity analvsis ofCanarium olbumL landrances in Chaoshan area by ISSR[J]Guangdong .Agricultural Sciences. 2013. 40 (23):129-132 (inChinese)

    [8] 張安世,韓臣鵬,齊秀娟,等基于ISSR標(biāo)記的獼猴桃品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2017. 26 (3):19-26

    ZHANG A S,HAN C P,QI X J,et al Genetic diversity analvsis andfingerprinting construction of cultivars of Actinidio spp. based onISSR marker [J] Journal of Plant Resources and Environment. 2017,26 (3):19-26 (in Chinese)

    [9] 李國田,張美勇,相昆,等基于ISSR標(biāo)記的16個(gè)核桃品種遺傳多樣性分析及分子身份構(gòu)建[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)、2015. 29 (10):1884-1892

    LI G T,ZHANG M Y. XIANG K,et al Analysis of genetic diversityand establislunent of molecular ID for 16 walnut varieties based onISSR markers [Jl Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 2015.29( 10): 1884-1892. (in Chinese)

    [IO]劉曉生,鄭道序,周春娟,等潮汕余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析[J]中國南方果樹,2014.43 (1):1822

    LIU X S,ZHENG D X,ZHOU C J,et al Analysis of genetic diversityand genetic relationship of Phyllonthus emblicaL Gerniplasin inChaoshan area with ISSR [J] South China Fruits. 2014. 43(1):1822 (in Chinese)

    [11]周春娟,詹潮安,劉曉生,等粵東余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析[C]//廣東省植物學(xué)會(huì)年會(huì)2012年年會(huì)論文集2012:16-16

    ZHOU C J,ZHAN C A. LIU X S,et al ISSR Analysis of geneticdiversity and genetic relationship of Phyllanthus emblica germplasmresources in eastem Guangdong[C] //Annual meeting of GuangdongBotany Society. 2012: 16-16 (in Chinese)

    [12]邵雪花,劉牛,賴多,等28份余甘子品種遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020.48 (8):129-136

    SHAO X H,LIU N. LAI D, et al Genetic diversity analysis and DNAfingerprint inapping of 28 varieties of Pbyllanthus emblicaL based onISSR molecular marker [J] Journol of Northivest A&f University(Natural Science Edition), 2020. 48(8):129-136(ln Chinese)

    [13]李巧明,趙建立云南干熱河谷地區(qū)余甘子居群的遺傳多樣性研究[J]生物多樣性,2007. 15 (1):8491

    LI Q M. ZHAO J L Genetic diversity of Phyllanthus emblicopopulations in dry-hot valleys in Yunnan [J] Biodiversity Science.2007. 15(1):8491. (in Chinese)

    [14]李金璐,王碩,于婧,等 ‘種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報(bào).2013. 48 (1):7278

    LI J L,WANG S, YU J, et al A modified CTAB protocol for plantDNA extraction [J] Chinese Bulletin of Botany. 2013. 48(1):7278. (in Chinese)

    [15]尚小紅,嚴(yán)華兵,曹升,等葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2018. 49 (1):1-7

    SHANG X H. YAN H B,CAO S,et al Optimization of SCoT-PCRreaction svstein and primer selection for Pueraria DC[J] Journal ofSoutbern Agriculture. 2018. 49(1):1-7.( in Chinese)

    [16]闞琦繽,劉瑞雪,王曉婭,等響應(yīng)面優(yōu)化刺五加總黃酮提取工藝及

    體外抗氧化研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2021. 36 (3):358368

    KAN Q B,LIU R X. WANG X Y. et al_ Process optimization and invitro antioxidant activity of flavonoids extracted from Acantbopanaxsenticosus [J] Fujian Journol ofAgricultural Sciences. 2021, 36 t3)I358368 (in Chinese)

    [17]鄭良,李越凡,趙強(qiáng),等基于響應(yīng)面分析的聚甲基丙烯酸甲酯表面微觀生物污損超聲防除研究[J]表面技術(shù),2021. 50 (4):319327

    ZHENG L,LI Y F,ZHAO Q,et al_Research on removal ofmicrofouling on polymethyl methacrylate surface by ultrasonicantifouling technology based on response surface analysis [Jl SurfaceTechnology. 2021. 50 (4): 319327(in Chinese)

    [18] YEH F c Population genetic analysis of codominant and doininantmarkers and quantitative traits [J] Belgion Journal of Botany. 1997:129

    [19]王建波ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]遺傳,2002. 24 (5):613616

    WANG J B ISSR markers and their applications in plant genetics [JlHereditas(Beijing). 2002, 24(5):613616.( in Chinese)

    [20]黃曉慧,巫偉峰,陳春,等中國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2018. 49 (7):1282-1288

    HUANG X H. WU W F,CHEN C, et al Optimization and primerscreening of ISSR-PCR reaction system for Chinese Orchids [JlJournol of Southern .4griculture. 2018. 49(7) 1282-1288.( inChinese)

    [21]劉鳳書,侯開衛(wèi),李紹家,等余甘子的保健價(jià)值及開發(fā)利用前景[J]自然資源學(xué)報(bào),1993.8 (4):299306

    LIU F S,HOU K W. LI S J,et al The health-protecting value ofPhvllantbus emblicaL and its prospects for exploitation andutilization [J] Journal of Naturol Resources. 1993.8 (4):299306. (in Chinese)

    [22]鐘風(fēng)林,王江波,潘東明,等余甘子ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]生物技術(shù)通報(bào),2008 (3):166-169

    ZHONG F L WANG J B,PAN D M. et al_Optimization of ISSRreaction system in Pbyllanthus emblica L[J] Biotechnology Bulletin.2008 (3): 166-169 (in Chinese)

    (責(zé)任編輯:黃愛萍)

    收稿日期:2021-03-16初稿:2021-05-12修改稿

    作者簡介:王建超(1988-),男,研究實(shí)習(xí)員,研究方向:熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保護(hù)與生理生化研究(Email: 447327289@qq.com)

    通信作者:郭林榕( 1963-),女,副研究員,研究方向:熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保存、選育種及栽培研究(Email: linrong-g@163com)

    基金項(xiàng)目:福建省科技計(jì)劃公益類專項(xiàng)( 2019Rl028—ll):國家熱帶植物種質(zhì)資源庫(余甘子種質(zhì)資源分庫)(NTPGRC2021-011):農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種(熱帶作物)資源保護(hù)項(xiàng)日( 151821301354052701)

    猜你喜歡
    體系優(yōu)化
    供電公司人力資源培訓(xùn)與開發(fā)體系優(yōu)化
    正交設(shè)計(jì)優(yōu)化荷花品種ISSR—PCR反應(yīng)體系
    楊梅iPBS—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化
    綠水集團(tuán)公司融資戰(zhàn)略體系優(yōu)化研究
    合肥周谷堆農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)物流配送體系優(yōu)化研究
    99热这里只有精品一区| 大香蕉久久网| 天堂中文最新版在线下载 | 男女视频在线观看网站免费| 国产精品久久久久久av不卡| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美色欧美亚洲另类二区| 校园春色视频在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 国产精品永久免费网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产在线男女| 久久久精品大字幕| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 18+在线观看网站| 婷婷亚洲欧美| 日韩av不卡免费在线播放| 最新中文字幕久久久久| 亚洲国产欧美人成| 毛片一级片免费看久久久久| 国产日本99.免费观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜精品一区二区三区免费看| kizo精华| 国内精品美女久久久久久| 国产三级在线视频| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲高清免费不卡视频| a级毛色黄片| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产91av在线免费观看| 看片在线看免费视频| 18+在线观看网站| 三级经典国产精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 在线播放无遮挡| 大香蕉久久网| 国产精品免费一区二区三区在线| 日韩亚洲欧美综合| 99热精品在线国产| 人妻夜夜爽99麻豆av| 草草在线视频免费看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 免费看av在线观看网站| 看免费成人av毛片| av国产免费在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产乱人视频| 丰满乱子伦码专区| 97热精品久久久久久| 一级黄片播放器| 成熟少妇高潮喷水视频| 免费人成在线观看视频色| 亚洲,欧美,日韩| 一级黄色大片毛片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成人国产麻豆网| 国产黄a三级三级三级人| 哪里可以看免费的av片| 在线观看午夜福利视频| 免费看av在线观看网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品综合久久久久久久免费| 深夜a级毛片| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产成人a∨麻豆精品| 久久国内精品自在自线图片| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产毛片a区久久久久| 中文字幕av在线有码专区| 欧美激情国产日韩精品一区| 成人毛片a级毛片在线播放| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美| 一区二区三区四区激情视频 | 少妇人妻一区二区三区视频| 精品免费久久久久久久清纯| 国产成人影院久久av| 久久精品国产亚洲网站| 国产色婷婷99| 国产毛片a区久久久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 大型黄色视频在线免费观看| 国产一区二区在线观看日韩| 嫩草影院精品99| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人鲁丝片一二三区免费| 免费看日本二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人freesex在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产伦精品一区二区三区视频9| or卡值多少钱| 国产淫片久久久久久久久| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人美女网站在线观看视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 99久久九九国产精品国产免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 深夜a级毛片| 美女国产视频在线观看| 欧美激情在线99| 精品一区二区三区视频在线| 久久人人爽人人片av| 直男gayav资源| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 极品教师在线视频| 中文资源天堂在线| 国产午夜福利久久久久久| av国产免费在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 在线国产一区二区在线| 日韩国内少妇激情av| 国产成人精品久久久久久| 精品人妻视频免费看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲,欧美,日韩| 一区二区三区高清视频在线| 久久久久久久久大av| 我要看日韩黄色一级片| 嫩草影院新地址| 99久国产av精品| 99视频精品全部免费 在线| 大香蕉久久网| 九色成人免费人妻av| 午夜激情福利司机影院| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲av免费在线观看| 国产人妻一区二区三区在| 日韩欧美在线乱码| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 男插女下体视频免费在线播放| 免费观看精品视频网站| 免费观看a级毛片全部| 男女视频在线观看网站免费| 国产欧美日韩精品一区二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 人人妻人人看人人澡| 国产 一区精品| 一级毛片我不卡| 99精品在免费线老司机午夜| 3wmmmm亚洲av在线观看| 最近手机中文字幕大全| 在线播放无遮挡| 一区福利在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲经典国产精华液单| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲不卡免费看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久久久久国产a免费观看| 国产亚洲欧美98| 久久久久久久久久久免费av| 欧美性猛交黑人性爽| 如何舔出高潮| 91久久精品电影网| 久久韩国三级中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 午夜免费激情av| a级一级毛片免费在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一区二区三区免费毛片| 国产午夜精品一二区理论片| 国产精品久久久久久精品电影| 最近2019中文字幕mv第一页| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产精品精品国产色婷婷| 国产91av在线免费观看| 日韩人妻高清精品专区| videossex国产| 赤兔流量卡办理| 3wmmmm亚洲av在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲18禁久久av| 免费看av在线观看网站| 欧美精品一区二区大全| 亚洲高清免费不卡视频| 久久久久久久久久成人| 亚洲av成人av| 亚洲不卡免费看| 日韩人妻高清精品专区| 91久久精品国产一区二区三区| 久久九九热精品免费| 午夜视频国产福利| 一区福利在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区| 小说图片视频综合网站| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产一区二区在线观看日韩| 乱系列少妇在线播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品一区二区性色av| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日韩欧美在线乱码| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 99久久精品热视频| 麻豆乱淫一区二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成年女人永久免费观看视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产麻豆成人av免费视频| 久久久久国产网址| 哪里可以看免费的av片| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产极品天堂在线| 国内精品宾馆在线| 一个人看的www免费观看视频| 色哟哟·www| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产三级在线视频| 国产精品一区www在线观看| 国产精品国产高清国产av| 天堂√8在线中文| 精品久久久久久成人av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美人与善性xxx| 国产男人的电影天堂91| 免费搜索国产男女视频| 精品久久久噜噜| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲av免费高清在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 午夜视频国产福利| 波多野结衣高清作品| 嘟嘟电影网在线观看| 国产高潮美女av| 亚洲精品影视一区二区三区av| 赤兔流量卡办理| 亚洲av男天堂| 午夜精品国产一区二区电影 | 午夜精品在线福利| 国产精品一区二区在线观看99 | 村上凉子中文字幕在线| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美三级亚洲精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 岛国毛片在线播放| 深爱激情五月婷婷| 麻豆一二三区av精品| 国产成人91sexporn| 久久99热6这里只有精品| 久久精品91蜜桃| 嫩草影院新地址| 国内精品久久久久精免费| eeuss影院久久| 熟女人妻精品中文字幕| 两个人的视频大全免费| 插阴视频在线观看视频| 久久久久久久久久久免费av| 国产高清有码在线观看视频| 国产免费男女视频| 亚洲最大成人av| av在线老鸭窝| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一级av片app| 成人毛片60女人毛片免费| 久久午夜福利片| 亚洲性久久影院| 久久精品影院6| 高清毛片免费看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲av免费高清在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 深夜a级毛片| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 1000部很黄的大片| 精品欧美国产一区二区三| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲av一区综合| 赤兔流量卡办理| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产在视频线在精品| 2021天堂中文幕一二区在线观| 人妻少妇偷人精品九色| 不卡一级毛片| 春色校园在线视频观看| 一个人看的www免费观看视频| 观看美女的网站| av专区在线播放| av免费在线看不卡| 99久久人妻综合| 久久99蜜桃精品久久| 午夜爱爱视频在线播放| 久久精品91蜜桃| 一区二区三区免费毛片| av福利片在线观看| 成人午夜高清在线视频| 久久久久国产网址| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 日本一本二区三区精品| 久久中文看片网| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产 一区精品| 人妻系列 视频| 成人毛片60女人毛片免费| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成年版毛片免费区| 欧美zozozo另类| 尾随美女入室| 淫秽高清视频在线观看| 国产亚洲精品av在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 精品久久久噜噜| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲欧美清纯卡通| 在线天堂最新版资源| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国语自产精品视频在线第100页| 天美传媒精品一区二区| 亚洲性久久影院| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品电影一区二区三区| 国国产精品蜜臀av免费| 看片在线看免费视频| 床上黄色一级片| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成人欧美大片| 综合色av麻豆| 日韩欧美在线乱码| 偷拍熟女少妇极品色| 久久久欧美国产精品| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 婷婷六月久久综合丁香| 精品久久久久久久久久久久久| 在线观看一区二区三区| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲图色成人| 丰满的人妻完整版| 级片在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 天堂影院成人在线观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 日本在线视频免费播放| 色综合亚洲欧美另类图片| 在线播放国产精品三级| 日韩三级伦理在线观看| 99热这里只有是精品50| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 天堂网av新在线| 长腿黑丝高跟| 欧美潮喷喷水| 99在线人妻在线中文字幕| 成人美女网站在线观看视频| 国产成人福利小说| 国产在线男女| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产精品合色在线| 男女视频在线观看网站免费| 国产高清不卡午夜福利| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 免费看日本二区| 免费观看a级毛片全部| 在线播放无遮挡| 99九九线精品视频在线观看视频| 日韩国内少妇激情av| 成人午夜高清在线视频| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲av免费高清在线观看| 我的老师免费观看完整版| 国产淫片久久久久久久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产麻豆成人av免费视频| 在线观看av片永久免费下载| 久久人人爽人人片av| 国产精品福利在线免费观看| 中出人妻视频一区二区| 精品国产三级普通话版| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 色吧在线观看| 日韩大尺度精品在线看网址| 日韩强制内射视频| 免费看光身美女| 两个人视频免费观看高清| 九草在线视频观看| 夜夜爽天天搞| 波野结衣二区三区在线| 午夜精品在线福利| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲美女视频黄频| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲在久久综合| 欧美在线一区亚洲| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久久九九精品影院| 人妻夜夜爽99麻豆av| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 91精品国产九色| 国产伦精品一区二区三区视频9| 最近最新中文字幕大全电影3| 长腿黑丝高跟| 久久久久免费精品人妻一区二区| av在线播放精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 高清毛片免费观看视频网站| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久国产成人精品二区| 色噜噜av男人的天堂激情| av黄色大香蕉| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 1000部很黄的大片| 久久99热6这里只有精品| 黄片wwwwww| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品不卡视频一区二区| 日日干狠狠操夜夜爽| 夫妻性生交免费视频一级片| 老女人水多毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 天堂影院成人在线观看| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 乱系列少妇在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产单亲对白刺激| 99久久精品热视频| 成人欧美大片| 最近中文字幕高清免费大全6| av天堂中文字幕网| 久久久久网色| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久精品大字幕| 一级二级三级毛片免费看| 亚洲最大成人中文| 毛片女人毛片| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 精品久久久久久成人av| 久久精品影院6| 国产伦理片在线播放av一区 | 国产成人一区二区在线| videossex国产| 边亲边吃奶的免费视频| 嘟嘟电影网在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热这里只有是精品50| 99九九线精品视频在线观看视频| 一个人看的www免费观看视频| 久久午夜亚洲精品久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产av不卡久久| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 毛片一级片免费看久久久久| 12—13女人毛片做爰片一| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 婷婷色综合大香蕉| 观看免费一级毛片| 综合色av麻豆| 国产黄片美女视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 日本与韩国留学比较| 校园春色视频在线观看| 少妇的逼好多水| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 亚洲精品影视一区二区三区av| 12—13女人毛片做爰片一| 干丝袜人妻中文字幕| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 精品国内亚洲2022精品成人| 欧美一区二区亚洲| 亚洲中文字幕日韩| 一级黄片播放器| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 中文字幕久久专区| 搡老妇女老女人老熟妇| 成年女人看的毛片在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产精品av视频在线免费观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲成av人片在线播放无| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲欧美精品综合久久99| 黑人高潮一二区| 麻豆成人av视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 波多野结衣高清无吗| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久精品94久久精品| av福利片在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 国产私拍福利视频在线观看| av在线亚洲专区| 成人无遮挡网站| 中文字幕av成人在线电影| 内地一区二区视频在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| 三级经典国产精品| 午夜激情欧美在线| 99热网站在线观看| 在线国产一区二区在线| 午夜老司机福利剧场| 日日啪夜夜撸| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 日本与韩国留学比较| av黄色大香蕉| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美区成人在线视频| 美女 人体艺术 gogo| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲人成网站在线观看播放| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产三级中文精品| 国产久久久一区二区三区| 欧美一区二区国产精品久久精品| av福利片在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 18+在线观看网站| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 此物有八面人人有两片| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 舔av片在线| 在线观看66精品国产| 三级毛片av免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美高清成人免费视频www| 嫩草影院入口| 日本免费a在线| 日本黄色视频三级网站网址| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美日韩东京热| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美bdsm另类| 欧美最黄视频在线播放免费| 99久久无色码亚洲精品果冻| 2022亚洲国产成人精品| 又爽又黄a免费视频| 嫩草影院精品99| 全区人妻精品视频| 99热这里只有是精品在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久久国产成人免费| 91av网一区二区| 亚洲在线观看片| 91久久精品国产一区二区成人| 久久热精品热| 日本三级黄在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 精品熟女少妇av免费看| 中出人妻视频一区二区| 久久精品综合一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜精品在线福利| 村上凉子中文字幕在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 性插视频无遮挡在线免费观看| 2022亚洲国产成人精品| 天堂网av新在线| 亚洲国产精品成人综合色| 中文字幕av成人在线电影| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 嫩草影院新地址| 22中文网久久字幕| 欧美激情久久久久久爽电影| 午夜激情欧美在线| 久久久久久久久久黄片| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久精品夜色国产| 97超视频在线观看视频| 亚洲最大成人中文| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲精品色激情综合| 亚洲欧美日韩东京热| 99热6这里只有精品| 亚洲18禁久久av| 黄色日韩在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人精品婷婷| 国产黄片美女视频|