• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    響應(yīng)面法優(yōu)化余甘子種質(zhì)資源ISSR反應(yīng)體系

    2021-11-12 10:23王建超何銀鶯黃旭萍沈朝貴陳發(fā)興郭林榕
    關(guān)鍵詞:體系優(yōu)化

    王建超 何銀鶯 黃旭萍 沈朝貴 陳發(fā)興 郭林榕

    摘要:【目的】優(yōu)化余甘子種質(zhì)資源ISSR-PCR反應(yīng)體系,為余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系研究提供基礎(chǔ)?!痉椒ā恳跃挼椤⒂《?、廣東、云南、福建等5份來源小同的余甘子種質(zhì)資源的基因組DNA組成混合的DNA模板,綜合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法,分析引物濃度、2×Taq Master Mix添加量、DNA模板量、退火溫度等反應(yīng)條件對(duì)IS SR-PCR反應(yīng)體系的影響,優(yōu)化建立余甘子IS SR-PCR反應(yīng)體系?!窘Y(jié)果】引物濃度和2×Taq MasterMix添加量對(duì)擴(kuò)增效果有較大影響,DNA模板量影響較小;引物濃度和DNA模板量交互作用明顯;余甘子ISSR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umol L-l,2×Taq Master Mix添加量l3 uL, DNA模板量30 ng,擴(kuò)增結(jié)果與響應(yīng)面分析模型理論值相對(duì)誤差儀為9.39%;退火溫度為50.5- 52.7℃時(shí),隨著溫度的升高,條帶質(zhì)量變好,數(shù)量變多,退火溫度為52.7℃時(shí)可獲得多樣性好的清晰條帶。【結(jié)論】獲得ISSR-PCR反應(yīng)體系為引物濃度0.4 umoI·L-1,2×Taq MasterMix添加量13 UL, DNA模板量30 ng,退火溫度52.7℃,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)35循環(huán),擴(kuò)增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定,多樣性好,該體系適于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系等分析研究

    關(guān)鍵詞:余甘子;ISSR-PCR;響應(yīng)面;體系優(yōu)化

    中圖分類號(hào):S 682.310.36

    文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    文章編號(hào):1008-0384( 2021) 07-075907

    Response Surface Optimization of ISSR-PCR Reaction for Genetic Study on

    Phyllanthus Emblica

    WANG Jianchao1.2. HE Yinying2. HUANG Xuping2, SHEN Chaoguj1, CHEN Faxing2. Guo Linrong1*

    (l.Fruit Research Institute, Fujian Academy ofAgricultural Sciences. Fuzhou, Fujian 350013,China:

    2.College ofHorticulture, Fujian Agriculture and Forestrv University. Fuzhou, Fujian 350002. China)

    Abstract: 【Objective】 ISSR-PCR reaction system for genetic study on Phyllanthus emblica germplasms was optimized【Methods】 A mixed DNA template composed of genomic DNA ofP emblica germplasms came from Myanmar. India.Guangdong, Yunnan, and Fujian was obtained. The single factor test and response surface analysis were used to optimize theISSR-PCR reaction conditions including primer concentration. amount of 2×Taq Master Mix. DNA template amount, andannealing temperature.【Result】 The primer concentration and addition amount of 2×Taq Master Mix had a greater impacton the amplification than did the DNA template amount. A significant interaction between the primer concentration and DNAtemplate amount was found. The optimized system with a primer concentration of 0.4 ymoI·L-1.a 2×Taq Master Mix of13 UL, and a DNA template concentration of 30 ng was established that achieved a low relative error of 9.39% in predicting thetheoretical response. Within the annealing temperature between 50.5 ℃ and 52.7 ℃. increasing temperature improved thenumber and quality of bands. When the annealing temperature is 50.5-52.7.C,the number of strips increases. and the quality ofthe strips becomes better with the increase of temperature. The annealing temperature is 52.7℃to obtain good diversity andclear bands. 【Conclusion】 The optimized ISSR-PCR reaction system was established applying a primer concentration of0.4 umoI-L-1,a 2×Taq Master Mix ofl3L,aDNA template concentration of 30 ng at the annealing temperature of 52.7℃for35 amplification cycles. The methodology could be used to study the genetic diversity and relationship of P. emblicagermplasms .

    1.3統(tǒng)計(jì)分析

    采用Excel 2016、Design Expert 8.0.6等軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,其中Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析和模型的建立。

    2結(jié)果與分析

    2.1單因素對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

    單因素試驗(yàn)的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2,可見,引物濃度與2×Taq Master Mix添加量對(duì)反應(yīng)體系的影響較大。引物濃度偏高或偏低都會(huì)影響擴(kuò)增結(jié)果,引物濃度過高會(huì)引起引物與DNA模板錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增,增加產(chǎn)生二聚體的概率,引物濃度偏低則不易測(cè)出擴(kuò)增位點(diǎn),本研究引物濃度為0.30~0.40 umol.L-l時(shí)電泳效果較好。2×Taq Master Mix含有Taq DNA聚合酶、dNTP混合物和Mg2+等反應(yīng)原料,Taq DNA聚合酶直接影響擴(kuò)增反應(yīng)的成功與否,濃度過高容易產(chǎn)生非特異的PCR產(chǎn)物,dNTP是ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增的重要原料,濃度過高易錯(cuò)配,過低影響合成效率,2×Taq MasterMix添加量為12~14 uL為最佳。DNA模板量范圍取決于物種基因組大小和DNA純度,研究表明,DNA模板量對(duì)余甘子ISSR-PCR的影響較小,考慮電泳條帶質(zhì)量和數(shù)量,選擇DNA模板量最佳為30 ng。

    2.2響應(yīng)面法優(yōu)化ISSR反應(yīng)體系

    以電泳圖譜(圖3)中電泳條帶數(shù)量、清晰度、重復(fù)性、亮度和背景干凈程度的評(píng)分(5名科研T作者主觀評(píng)分)為響應(yīng)值(表4),采用多元回歸擬合,獲得引物濃度(X1),2×Taq Master Mix添加量(X2),DNA模板量(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型為F=11.92-0.437 5X1-O.5 5X2 -1.737 5X2-0.75XIX21.575XIX3-0.55X2X3-4.2975Xl2-3.5225X2--2.1975X32。檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析電泳圖評(píng)分為響應(yīng)值時(shí),該二次方程模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-0.012 6<0.05),說明該模型對(duì)本試驗(yàn)有較好擬合;回歸方程失擬性檢驗(yàn)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p-0.7571),表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小,模型能較好地反應(yīng)真實(shí)的試驗(yàn)值,可用于響應(yīng)值的分析和預(yù)測(cè),所得的回歸方程模型能較好地預(yù)測(cè)電泳圖譜得分隨各參數(shù)的變化規(guī)律。試驗(yàn)所選三因子X1、X2和X3中X3達(dá)到顯著影響(p<0.05),Xl、X2因子二次項(xiàng)均達(dá)到極顯著影響(p<0.001)表明單因素X2對(duì)響應(yīng)結(jié)果影響較大,且X1與X2因子有極顯著的交互影響。

    根據(jù)回歸擬合方程得出各試驗(yàn)因子引物濃度(X)、2×Taq Master Mix添加量(X2)、DNA模板量(X3)兩兩因素交互作用的等高線圖(圖4),等高線圖可直觀反映出2個(gè)變量間交互作用的顯著程度,其中圓形表示兩兩因素交互作用不顯著,而橢圓形表示兩兩因素交互作用顯著[16];等高線圖由藍(lán)到紅的變化越快,沿白變量方向高度差越大[17],引物濃度(Xl)和DNA模板量(X3)之間交互作用顯著。

    根據(jù)Design Expert 8.0.6軟件分析出的若干解決方案與其相應(yīng)預(yù)測(cè)得分值,考慮到保證高響應(yīng)值的同時(shí)節(jié)約成本,對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)分析驗(yàn)證,得到ISSR反應(yīng)體系的實(shí)際值(圖5),該值與理論預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較計(jì)算相對(duì)誤差,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,最優(yōu)實(shí)際解決方案引物濃度為0.40 umol·L-1,2×Taq Master Mix添加量為13.0 uL,DNA模板量30 ng,該條件與理論預(yù)測(cè)響應(yīng)值13.130 4的相對(duì)誤差僅為9.39%,說明該模型具有好的分析能力,可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。

    2.3退火溫度對(duì)ISSR反應(yīng)體系的影響

    退火溫度影響ISSR圖譜的穩(wěn)定性,較低的退火溫度可保證引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定性,但較易產(chǎn)生錯(cuò)誤的擴(kuò)增。由電泳圖譜(圖6)可知,35循環(huán)數(shù)下,50.5~54.0℃隨著退火溫度的升高譜帶質(zhì)量與條帶數(shù)有較明顯的變化,退火溫度為50.5—52.7℃時(shí),隨著溫度的升高條帶數(shù)呈增加趨勢(shì),條帶質(zhì)量變好,52.7~54.0℃時(shí),部分條帶模糊,缺失。選擇較高的退火溫度可減少引物和模板間非特異性的結(jié)合,提高擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,綜合譜帶質(zhì)量和條帶數(shù),退火溫度為52.7℃時(shí)最佳,可獲得較好的擴(kuò)增效果。

    通過優(yōu)化得到ISSR-PCR反應(yīng)的體系為引物濃度為0.4 umol·1-1,2×Taq Master Mix添加量為13 uL,DNA模板量30 ng,退火溫度為52.7 0C,循環(huán)次數(shù)35次;將該體系應(yīng)用于不同余甘子種質(zhì)資源效果見圖7,引物UBC841在該體系下可擴(kuò)增出條帶清晰和多態(tài)性良好的電泳圖譜,表明該體系適宜應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究。

    3討論與結(jié)論

    ISSR是在SSR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的分子標(biāo)記,目前,ISSR已廣泛用于植物品種鑒定、遺傳圖譜、遺傳多樣性及分子生態(tài)學(xué)研究[18.19]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)基于PCR反應(yīng),其擴(kuò)增譜帶受反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序變化以及物種不同的影響,采用不同的反應(yīng)體系組合和擴(kuò)增程序電泳結(jié)果差異較大,因此,開發(fā)ISSR分子標(biāo)記對(duì)其反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序優(yōu)化顯得必不可少。

    本研究綜合運(yùn)用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面分析法,首先確定了各因素的有效范圍,再對(duì)各因素組合優(yōu)化,從而確立普遍適用于余甘子種質(zhì)資源的ISSR-PCR反應(yīng)體系。本研究PCR擴(kuò)增采用2×Taq MasterMix試劑,該試劑將多種擴(kuò)增原料混合,研究結(jié)果雖未能直觀體現(xiàn)Taq DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+等原料對(duì)余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響[20],但可大大提高T作效率,達(dá)到了節(jié)省物料、簡便、快速的目的,可在ISSR分子標(biāo)記研究中加以推廣應(yīng)用。本研究結(jié)果表明引物濃度對(duì)余甘子ISSR反應(yīng)體系影響較大,DNA模板量與引物濃度有顯著的交互作用,與前人研究較一致[21.22]。應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)影響ISSR反應(yīng)體系的主要因素進(jìn)行篩選,建立余甘子ISSR反應(yīng)體系模型F=11.92-0.437 5X1-0.55X2 1.737 5X30.75XIX2 1.575X1X3 0.55X2X3 4.297 5Xl2 3.522 5X222.197 5X22,可較快地得到最優(yōu)組合,避免了單因素試驗(yàn)結(jié)果的不足。

    本研究確立余甘子ISSR-PCR反應(yīng)體系:引物濃度為0.4 UMol·1,2×Taq Master Mix添加量為13 UL,DNA模板濃度30 ng,擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35循環(huán),退火溫度52.7℃;擴(kuò)增獲得的條帶清晰、穩(wěn)定,多樣性好,可應(yīng)用于余甘子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系研究。

    參考文獻(xiàn):

    [1]潘慧清,朱平,魏學(xué)明,等藏藥余甘子研究概[J]。甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2019,36 (2):8488

    PAN H Q,ZHU P, WEI X M,et al On Tibetan medicine Yuganzi(Phylianthi fructus) [Jl Journal of Gansu University of ChineseMedicine. 2019. 36(2):8488.( in Chinese)

    [2] 國家藥典委員會(huì)中華人民共和國典一部[M]北京:中國醫(yī)藥利技出版社、2020 186-187

    [3] 趙謀明,劉曉麗,崔春,等余甘子多酚響應(yīng)面法優(yōu)化提取及其抗氧化活性研究[J]食品工業(yè)科技,2007. 28 (6):117-120

    ZHAO M M. LIU X L,CUI C,et al.Studv on the optimizingextraction processing of polyphenol from Phyllanthus emblicaL fruitby method of response surface analvsis and its antioxidant activity [J]Science and Technology of Food Industry, 2007. 28(6):117-120( in Chinese)

    [4] GANTAIT s,MAHANTA M. BERA s,et al Advances iiibiotechnology of Emblica officinalis Gaertn. syn. Phyllanthus emblicaL:A nutraceuticals-rich fruit tree with multifaceted ethnomedicinaluses [J]3 Biotech. 2021. 11 (2);1-25

    [5] ZIETKIEWICZ E,RAFALSKI A. LABUDA D Genomefmgerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerasechain reaction amplification [J] Genomics. 1994. 20(2):176-183

    [6] SARWAT M. DAS s,SRIVASTAVA P s Analysis of geneticdiversity through AFLP. SAMPL. ISSR and RAPD markers iiiTribulus terrestris.a medicinal herb [J]. Plant Cell Reports, 2008.27 (3) 519528

    [7] 楊培奎,鄭道序,馬瑞君,等潮汕橄欖地方品種(系)遺傳多樣性的ISSR分析[J]廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013. 40 (23):129-132

    YANG P K. ZHENG D X. MA R J,et al_ Genetic diversity analvsis ofCanarium olbumL landrances in Chaoshan area by ISSR[J]Guangdong .Agricultural Sciences. 2013. 40 (23):129-132 (inChinese)

    [8] 張安世,韓臣鵬,齊秀娟,等基于ISSR標(biāo)記的獼猴桃品種遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2017. 26 (3):19-26

    ZHANG A S,HAN C P,QI X J,et al Genetic diversity analvsis andfingerprinting construction of cultivars of Actinidio spp. based onISSR marker [J] Journal of Plant Resources and Environment. 2017,26 (3):19-26 (in Chinese)

    [9] 李國田,張美勇,相昆,等基于ISSR標(biāo)記的16個(gè)核桃品種遺傳多樣性分析及分子身份構(gòu)建[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)、2015. 29 (10):1884-1892

    LI G T,ZHANG M Y. XIANG K,et al Analysis of genetic diversityand establislunent of molecular ID for 16 walnut varieties based onISSR markers [Jl Journal of Nuclear Agricultural Sciences. 2015.29( 10): 1884-1892. (in Chinese)

    [IO]劉曉生,鄭道序,周春娟,等潮汕余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析[J]中國南方果樹,2014.43 (1):1822

    LIU X S,ZHENG D X,ZHOU C J,et al Analysis of genetic diversityand genetic relationship of Phyllonthus emblicaL Gerniplasin inChaoshan area with ISSR [J] South China Fruits. 2014. 43(1):1822 (in Chinese)

    [11]周春娟,詹潮安,劉曉生,等粵東余甘子種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系的ISSR分析[C]//廣東省植物學(xué)會(huì)年會(huì)2012年年會(huì)論文集2012:16-16

    ZHOU C J,ZHAN C A. LIU X S,et al ISSR Analysis of geneticdiversity and genetic relationship of Phyllanthus emblica germplasmresources in eastem Guangdong[C] //Annual meeting of GuangdongBotany Society. 2012: 16-16 (in Chinese)

    [12]邵雪花,劉牛,賴多,等28份余甘子品種遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜構(gòu)建[J]西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2020.48 (8):129-136

    SHAO X H,LIU N. LAI D, et al Genetic diversity analysis and DNAfingerprint inapping of 28 varieties of Pbyllanthus emblicaL based onISSR molecular marker [J] Journol of Northivest A&f University(Natural Science Edition), 2020. 48(8):129-136(ln Chinese)

    [13]李巧明,趙建立云南干熱河谷地區(qū)余甘子居群的遺傳多樣性研究[J]生物多樣性,2007. 15 (1):8491

    LI Q M. ZHAO J L Genetic diversity of Phyllanthus emblicopopulations in dry-hot valleys in Yunnan [J] Biodiversity Science.2007. 15(1):8491. (in Chinese)

    [14]李金璐,王碩,于婧,等 ‘種改良的植物DNA提取方法[J].植物學(xué)報(bào).2013. 48 (1):7278

    LI J L,WANG S, YU J, et al A modified CTAB protocol for plantDNA extraction [J] Chinese Bulletin of Botany. 2013. 48(1):7278. (in Chinese)

    [15]尚小紅,嚴(yán)華兵,曹升,等葛根SCoT-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2018. 49 (1):1-7

    SHANG X H. YAN H B,CAO S,et al Optimization of SCoT-PCRreaction svstein and primer selection for Pueraria DC[J] Journal ofSoutbern Agriculture. 2018. 49(1):1-7.( in Chinese)

    [16]闞琦繽,劉瑞雪,王曉婭,等響應(yīng)面優(yōu)化刺五加總黃酮提取工藝及

    體外抗氧化研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2021. 36 (3):358368

    KAN Q B,LIU R X. WANG X Y. et al_ Process optimization and invitro antioxidant activity of flavonoids extracted from Acantbopanaxsenticosus [J] Fujian Journol ofAgricultural Sciences. 2021, 36 t3)I358368 (in Chinese)

    [17]鄭良,李越凡,趙強(qiáng),等基于響應(yīng)面分析的聚甲基丙烯酸甲酯表面微觀生物污損超聲防除研究[J]表面技術(shù),2021. 50 (4):319327

    ZHENG L,LI Y F,ZHAO Q,et al_Research on removal ofmicrofouling on polymethyl methacrylate surface by ultrasonicantifouling technology based on response surface analysis [Jl SurfaceTechnology. 2021. 50 (4): 319327(in Chinese)

    [18] YEH F c Population genetic analysis of codominant and doininantmarkers and quantitative traits [J] Belgion Journal of Botany. 1997:129

    [19]王建波ISSR分子標(biāo)記及其在植物遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用[J]遺傳,2002. 24 (5):613616

    WANG J B ISSR markers and their applications in plant genetics [JlHereditas(Beijing). 2002, 24(5):613616.( in Chinese)

    [20]黃曉慧,巫偉峰,陳春,等中國蘭ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J]南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2018. 49 (7):1282-1288

    HUANG X H. WU W F,CHEN C, et al Optimization and primerscreening of ISSR-PCR reaction system for Chinese Orchids [JlJournol of Southern .4griculture. 2018. 49(7) 1282-1288.( inChinese)

    [21]劉鳳書,侯開衛(wèi),李紹家,等余甘子的保健價(jià)值及開發(fā)利用前景[J]自然資源學(xué)報(bào),1993.8 (4):299306

    LIU F S,HOU K W. LI S J,et al The health-protecting value ofPhvllantbus emblicaL and its prospects for exploitation andutilization [J] Journal of Naturol Resources. 1993.8 (4):299306. (in Chinese)

    [22]鐘風(fēng)林,王江波,潘東明,等余甘子ISSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]生物技術(shù)通報(bào),2008 (3):166-169

    ZHONG F L WANG J B,PAN D M. et al_Optimization of ISSRreaction system in Pbyllanthus emblica L[J] Biotechnology Bulletin.2008 (3): 166-169 (in Chinese)

    (責(zé)任編輯:黃愛萍)

    收稿日期:2021-03-16初稿:2021-05-12修改稿

    作者簡介:王建超(1988-),男,研究實(shí)習(xí)員,研究方向:熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保護(hù)與生理生化研究(Email: 447327289@qq.com)

    通信作者:郭林榕( 1963-),女,副研究員,研究方向:熱帶與業(yè)熱帶果樹種質(zhì)資源保存、選育種及栽培研究(Email: linrong-g@163com)

    基金項(xiàng)目:福建省科技計(jì)劃公益類專項(xiàng)( 2019Rl028—ll):國家熱帶植物種質(zhì)資源庫(余甘子種質(zhì)資源分庫)(NTPGRC2021-011):農(nóng)業(yè)農(nóng)村部物種品種(熱帶作物)資源保護(hù)項(xiàng)日( 151821301354052701)

    猜你喜歡
    體系優(yōu)化
    供電公司人力資源培訓(xùn)與開發(fā)體系優(yōu)化
    正交設(shè)計(jì)優(yōu)化荷花品種ISSR—PCR反應(yīng)體系
    楊梅iPBS—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化
    綠水集團(tuán)公司融資戰(zhàn)略體系優(yōu)化研究
    合肥周谷堆農(nóng)產(chǎn)品市場(chǎng)物流配送體系優(yōu)化研究
    av在线app专区| 性色avwww在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 久久免费观看电影| 久久精品国产亚洲av高清一级| 美女大奶头黄色视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲成色77777| 精品国产露脸久久av麻豆| 亚洲天堂av无毛| 激情五月婷婷亚洲| a级毛片黄视频| 91成人精品电影| 亚洲成色77777| 免费播放大片免费观看视频在线观看| av卡一久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品偷伦视频观看了| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久综合免费| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 岛国毛片在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国精品久久久久久国模美| 亚洲成人一二三区av| 人妻一区二区av| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产激情久久老熟女| 欧美国产精品va在线观看不卡| 丁香六月天网| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产一区二区在线观看av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲中文av在线| 久久精品国产自在天天线| 校园人妻丝袜中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 90打野战视频偷拍视频| 十分钟在线观看高清视频www| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| av线在线观看网站| 在线天堂最新版资源| 国产成人91sexporn| 嫩草影院入口| 涩涩av久久男人的天堂| 天堂中文最新版在线下载| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av卡一久久| 成年av动漫网址| 国产精品二区激情视频| 国产一区二区三区av在线| 天堂8中文在线网| 一区二区三区激情视频| www.av在线官网国产| 日本午夜av视频| 我的亚洲天堂| 如何舔出高潮| 免费高清在线观看日韩| xxx大片免费视频| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品久久久av美女十八| 美女大奶头黄色视频| 国产精品 欧美亚洲| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久久精品免费免费高清| a级毛片在线看网站| 精品一区在线观看国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99精国产麻豆久久婷婷| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av成人精品一二三区| 午夜福利视频精品| 免费黄频网站在线观看国产| 国产女主播在线喷水免费视频网站| av福利片在线| 亚洲人成77777在线视频| 午夜激情久久久久久久| 极品人妻少妇av视频| 精品久久久久久电影网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 中文字幕av电影在线播放| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲图色成人| 热99久久久久精品小说推荐| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av免费在线看不卡| 国产成人av激情在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 极品少妇高潮喷水抽搐| 丁香六月天网| 婷婷色麻豆天堂久久| 黑人猛操日本美女一级片| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产精品国产av在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 麻豆乱淫一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 成人手机av| 日本av手机在线免费观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产高清国产精品国产三级| 国产爽快片一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 各种免费的搞黄视频| 免费日韩欧美在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 极品人妻少妇av视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产黄色免费在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| av在线app专区| 制服丝袜香蕉在线| 两个人看的免费小视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 免费观看av网站的网址| 搡老乐熟女国产| 超碰97精品在线观看| 岛国毛片在线播放| 国产成人精品婷婷| 久久久久久免费高清国产稀缺| 99国产精品免费福利视频| 国产极品天堂在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人手机av| 丝袜美足系列| 国产色婷婷99| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久午夜福利片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 交换朋友夫妻互换小说| 久久国产亚洲av麻豆专区| 丝袜喷水一区| 麻豆av在线久日| 制服人妻中文乱码| 丁香六月天网| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 老女人水多毛片| 国产精品 国内视频| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 乱人伦中国视频| 亚洲av日韩在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 99久久人妻综合| 人成视频在线观看免费观看| 国产1区2区3区精品| 日本91视频免费播放| 久久久亚洲精品成人影院| 天堂8中文在线网| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲人成电影观看| 亚洲国产欧美网| 日韩视频在线欧美| 久久精品国产自在天天线| av不卡在线播放| 国产精品不卡视频一区二区| av片东京热男人的天堂| 一区二区三区激情视频| 亚洲人成77777在线视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 热re99久久精品国产66热6| 午夜免费男女啪啪视频观看| 各种免费的搞黄视频| 少妇人妻精品综合一区二区| 大陆偷拍与自拍| 欧美国产精品一级二级三级| 精品亚洲成国产av| 日本色播在线视频| av女优亚洲男人天堂| 十八禁网站网址无遮挡| √禁漫天堂资源中文www| 如何舔出高潮| 亚洲av中文av极速乱| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 69精品国产乱码久久久| 狂野欧美激情性bbbbbb| 免费观看av网站的网址| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 精品人妻偷拍中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久av网站| 国产一区二区在线观看av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲人成77777在线视频| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久人人人人人| 最新的欧美精品一区二区| 久久午夜福利片| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 三级国产精品片| 久久国产精品大桥未久av| 激情五月婷婷亚洲| 国产xxxxx性猛交| 国产精品一国产av| 最近2019中文字幕mv第一页| 香蕉丝袜av| 国产精品女同一区二区软件| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品偷伦视频观看了| 又黄又粗又硬又大视频| 国产探花极品一区二区| 大码成人一级视频| 女性被躁到高潮视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久热这里只有精品99| 亚洲中文av在线| 一级片免费观看大全| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 曰老女人黄片| 考比视频在线观看| 日本午夜av视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 丁香六月天网| 国产福利在线免费观看视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 丝袜脚勾引网站| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久ye,这里只有精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 欧美精品av麻豆av| 国产亚洲一区二区精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 我的亚洲天堂| 亚洲精品一二三| 色吧在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 18在线观看网站| 一本久久精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 黑人猛操日本美女一级片| 97在线人人人人妻| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲精品第二区| 黄频高清免费视频| 人妻人人澡人人爽人人| 午夜福利在线免费观看网站| 看免费av毛片| 国产精品不卡视频一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久国产欧美日韩av| av片东京热男人的天堂| 黄色 视频免费看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产免费一区二区三区四区乱码| 五月开心婷婷网| av天堂久久9| 国产一区有黄有色的免费视频| 美女主播在线视频| 999精品在线视频| av网站免费在线观看视频| 9191精品国产免费久久| 国产一区二区激情短视频 | 久久女婷五月综合色啪小说| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产97色在线日韩免费| 99久久人妻综合| 制服诱惑二区| 亚洲成人一二三区av| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本wwww免费看| 久久精品久久久久久久性| 中文天堂在线官网| 美女国产高潮福利片在线看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 丝袜美足系列| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 在线观看国产h片| 美女中出高潮动态图| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲精品一区蜜桃| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产亚洲一区二区精品| 电影成人av| 我要看黄色一级片免费的| 大香蕉久久网| 久久精品久久精品一区二区三区| 久久av网站| 一级毛片电影观看| 午夜福利乱码中文字幕| 有码 亚洲区| 欧美av亚洲av综合av国产av | videossex国产| 亚洲精品美女久久av网站| 在线观看国产h片| 日韩欧美一区视频在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 久久久久久久亚洲中文字幕| 日韩三级伦理在线观看| 午夜影院在线不卡| 精品午夜福利在线看| 涩涩av久久男人的天堂| 一级毛片 在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 一区在线观看完整版| 一边摸一边做爽爽视频免费| freevideosex欧美| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产免费福利视频在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 欧美精品av麻豆av| 18+在线观看网站| √禁漫天堂资源中文www| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲av男天堂| 久久久久久人人人人人| 免费在线观看黄色视频的| 曰老女人黄片| 久久精品人人爽人人爽视色| 高清不卡的av网站| 国产欧美亚洲国产| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美日韩视频精品一区| 国产一级毛片在线| av免费观看日本| 韩国高清视频一区二区三区| 国产精品无大码| 亚洲精品成人av观看孕妇| 天天操日日干夜夜撸| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲av免费高清在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产1区2区3区精品| 九草在线视频观看| 一二三四中文在线观看免费高清| 大香蕉久久网| 精品国产国语对白av| 久久女婷五月综合色啪小说| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲精品国产av成人精品| 免费高清在线观看日韩| 婷婷色综合www| 欧美日韩综合久久久久久| videossex国产| 国产男女超爽视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | av在线观看视频网站免费| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产乱来视频区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 啦啦啦啦在线视频资源| 男人操女人黄网站| 中文字幕亚洲精品专区| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日日啪夜夜爽| 亚洲国产欧美在线一区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产高清国产精品国产三级| 99re6热这里在线精品视频| 久久热在线av| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩免费高清中文字幕av| 叶爱在线成人免费视频播放| 在现免费观看毛片| a级毛片在线看网站| 免费黄色在线免费观看| 国产极品天堂在线| 丝袜在线中文字幕| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲伊人色综图| 视频区图区小说| 国产日韩欧美视频二区| 国产有黄有色有爽视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 下体分泌物呈黄色| 免费看不卡的av| 色吧在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 边亲边吃奶的免费视频| 久久韩国三级中文字幕| 国产av一区二区精品久久| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 男女边摸边吃奶| 国产精品熟女久久久久浪| 女人久久www免费人成看片| 一级片'在线观看视频| 欧美成人午夜免费资源| 久久99蜜桃精品久久| 国产片特级美女逼逼视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品一区在线观看国产| 天天影视国产精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 熟妇人妻不卡中文字幕| 爱豆传媒免费全集在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品三级大全| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 九草在线视频观看| 春色校园在线视频观看| 久久久亚洲精品成人影院| 国产精品一二三区在线看| 69精品国产乱码久久久| 亚洲伊人色综图| 精品久久蜜臀av无| 免费看不卡的av| 久久久久久久精品精品| 久久女婷五月综合色啪小说| 五月天丁香电影| 亚洲一区二区三区欧美精品| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩大片免费观看网站| av视频免费观看在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 一区二区三区乱码不卡18| 久久99一区二区三区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 成年av动漫网址| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| h视频一区二区三区| av天堂久久9| 成年人免费黄色播放视频| 嫩草影院入口| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲成人一二三区av| 久久这里只有精品19| 国产日韩欧美在线精品| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 九草在线视频观看| 日本欧美国产在线视频| 久久99精品国语久久久| 免费黄网站久久成人精品| 久久久久视频综合| 国产精品国产av在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 熟女电影av网| 久久精品夜色国产| 观看av在线不卡| 久久精品国产a三级三级三级| 大码成人一级视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美国产精品一级二级三级| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 男的添女的下面高潮视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 寂寞人妻少妇视频99o| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一区在线观看完整版| 国产野战对白在线观看| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产成人一区二区在线| 嫩草影院入口| 国产成人精品无人区| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产极品粉嫩免费观看在线| 精品一区二区三卡| 久久久久久久精品精品| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美97在线视频| 久久久久人妻精品一区果冻| 波野结衣二区三区在线| 欧美日韩av久久| 国产一区二区三区av在线| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 91久久精品国产一区二区三区| 国产在线视频一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 免费人妻精品一区二区三区视频| 十八禁高潮呻吟视频| 免费av中文字幕在线| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品av麻豆狂野| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 视频区图区小说| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲国产精品一区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产黄色视频一区二区在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 欧美97在线视频| 人人澡人人妻人| 国产高清不卡午夜福利| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 亚洲av欧美aⅴ国产| 黄色 视频免费看| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品二区激情视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产黄频视频在线观看| 日日啪夜夜爽| 久久影院123| 亚洲人成77777在线视频| 久久精品夜色国产| 亚洲美女视频黄频| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 老鸭窝网址在线观看| 999久久久国产精品视频| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲中文av在线| 欧美日韩av久久| 最新中文字幕久久久久| 久久婷婷青草| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 边亲边吃奶的免费视频| 999久久久国产精品视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| www.av在线官网国产| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产精品一国产av| 男人添女人高潮全过程视频| 免费观看性生交大片5| 成人毛片60女人毛片免费| 18禁动态无遮挡网站| 午夜激情久久久久久久| 五月开心婷婷网| 国产精品免费视频内射| 色婷婷av一区二区三区视频| 亚洲国产精品999| 高清欧美精品videossex| 日本av免费视频播放| 国产xxxxx性猛交| 国产av国产精品国产| av网站免费在线观看视频| 九九爱精品视频在线观看| 免费av中文字幕在线| 国产男女超爽视频在线观看| 青春草国产在线视频| 一级毛片 在线播放| 高清视频免费观看一区二区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 美女主播在线视频| 人妻 亚洲 视频| 久久精品国产综合久久久| 只有这里有精品99| 日本欧美视频一区| 亚洲 欧美一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产精品 欧美亚洲| 大陆偷拍与自拍| 超碰97精品在线观看| 午夜激情久久久久久久| 成人免费观看视频高清| 人妻系列 视频| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久精品夜色国产| 成人国语在线视频| 尾随美女入室| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费看不卡的av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产精品免费视频内射| av片东京热男人的天堂| 精品少妇黑人巨大在线播放| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲美女视频黄频| 免费在线观看完整版高清| 老司机影院成人| 日韩伦理黄色片| 少妇的逼水好多| 午夜福利影视在线免费观看| 观看av在线不卡| 国产午夜精品一二区理论片| 高清欧美精品videossex| av福利片在线| 亚洲欧美成人精品一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲美女视频黄频| 深夜精品福利| 国产精品99久久99久久久不卡 | 婷婷色综合www| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产av一区二区精品久久| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 五月伊人婷婷丁香| 午夜福利一区二区在线看| 一级毛片我不卡| 99香蕉大伊视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 五月天丁香电影| 少妇人妻久久综合中文| 亚洲人成网站在线观看播放| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品成人av观看孕妇|