蛙類腦膜膿毒性伊麗莎白菌多克隆抗體的制備及應(yīng)用

張新艷 曾占壯 葉小軍 卓玉琛 鐘全福 余培建

摘要：【目的】制備蛙類腦膜膿毒性伊麗莎白菌多克隆抗體，建立間接ELISA檢測方法，進行病原菌在宿主體內(nèi)的示蹤研究，為病原菌的致病機理研究奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繉⒎蛛x白患歪頭病的棘胸蛙的腦膜膿毒性伊麗莎白菌（Elizabethkingia meningosepticum）RsB1151018NA甲醛火活后，免疫新西蘭大白兔制備兔抗血清。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立腦膜膿毒性伊麗莎白菌間接ELISA的檢測方法;兔抗血清多克隆抗體采用ProteinA親和層析柱分離純化，以異硫氰酸熒光素（ FITC）標記，標記后的抗體與感染RsB1151018NA的棘胸蛙小同臟器組織的冷凍切片反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察，跟蹤RsB1151018NA在棘胸蛙體內(nèi)的遷移。【結(jié)果】試驗結(jié)果表明，制備的兔抗棘胸蛙腦膜膿毒性伊麗莎白菌多克隆抗體血清效價為1：5.12×10 5，純化后的抗體效價為1：1.6×10 4，且建立的問接ELISA方法檢測腦膜膿毒性伊麗莎白菌具有高度特異性，與其他水產(chǎn)常見病原菌沒有交叉反應(yīng)，檢測靈敏度為1.0×10 4 CFU·mL-1。腦膜膿毒性伊麗莎白菌在棘胸蛙體內(nèi)隨血液循環(huán)而分布至全身，可侵襲肌肉、肝臟、腎臟、脾臟、腸道、心臟、眼和腦等組織器官，腎臟、眼和腦感染程度最嚴重，推測這三個組織器官是其靶器官;創(chuàng)傷感染是可能的感染途徑之一。【結(jié)論】建立的檢測方法能夠快速、靈敏、特異地檢測腦膜膿毒性伊麗莎白菌，對蛙類歪頭病的防控和早期診斷可提供理論參考依據(jù);另外利用免疫熒光檢測病原菌在宿主體內(nèi)的遷移，研究病原的致病機理及發(fā)病過程等，能為防治藥物的研發(fā)和防治方法的確定提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：腦膜膿毒性伊麗莎白菌;多克隆抗體;酶聯(lián)免疫反應(yīng);檢測;蛙“歪頭病”

中圖分類號：S 947

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-078508

Preparation and Application of Rabbit Polyclonal Antibodies against

Elizabethkingia meningosepticum on Frogs

ZHANG Xinyan. ZENG Zhanzhuang，YE Xiaojun，ZHUO Yuchen，ZHONG Quanfu，YU Peijian

（The FreShwdter FlSherieS Resenrch Institute of Fujian Province，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，Chinn）Abstract：【Objective】 Rabbit p01yclonal antibodies against Elizabethkingia meningosepticum （Em） were prepared toestablish an indirect ELISA detection to trace the pathogenic attack in organs of frogs（Rana spp） 【Method】 The strainRsB 1151018NA of Em from a diseased R.spinasa was iso1ated，formalin-inactivated，and injected into a rabbit for the semmpreparation An optimized indirect ELISA using the rabbit p01yclonal antibodies was developed for tracing RsB1151018NAThe rabbit immun0910bulin G was purified on a protein A column The purined antibodies were marked with FITC and furtherpurified on a desalting column Sephadex G-25 for subsequently tracing the pathogen in organs of the inoculated frogs【Results】The obtained rabbitpolyclonal antibodies showed atiterupt01：5 12×10 5，andl：1.6×104 afterpurification.Theindirect ELISA assay on the p01yclonal antibody was specific and sensitive in detecting Em without cross-reaction on otherbacteia.It had a detection limit of 1 0×104 cfu mL_1 According to the in vivo tracing test，RsB1151叭8NA distibutedthoughout me entire frog body by blood circulation with the most serious infections in the kidney，eyes，and brain【Conclusion】 The optimized indirect ELISA detection of Em was rapid，sensitive，and specific in tracing the bacterialinfection on R.spp.It was considered applicable for early diagnosis of the“crooked-head disease”and breeding ofhealthyfrogs for food and medicine

Key words： Elizabethkingia meningosepticum;

polyclonal antibodies; ELISA; detection; "crooked-head disease" of frogs

0 引言

【研究意義】腦膜膿毒性伊麗莎白菌（ Elizabethkingia meningosepticum），又腦髓膜炎敗血伊麗莎白菌，早期曾被稱為腦膜膿毒性金黃桿菌（ Chryseobacterium meningosepticum）、腦膜炎敗血黃桿菌（ Flavobacterim meningosepticum），為革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于河水、海水、土壤和醫(yī)院等環(huán)境中，可引起人的敗血癥與腦膜炎，還能引起各器官感染性炎癥，甚至是獲得性骨髓炎等[1-6]。同時，腦膜膿毒性伊麗莎白菌還可對各種蛙類造成重大危害，引發(fā)蛙類“歪頭病”，造成養(yǎng)殖蛙類的大量死亡，直接造成重大經(jīng)濟損失[7-12]。2008年《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告》第1125號將蛙腦膜炎敗血金黃桿菌病列為三類動物疫病。同時該菌對其他水生動物也有一定的致病性[13-18]。鑒于此，有必要對其檢測技術(shù)及在棘胸蛙體內(nèi)的遷移規(guī)律進行研究，建立該病的早期診斷方法，初步掌握該病原菌的致病機理，為該病的防治提供技術(shù)支撐?！厩叭搜芯窟M展】酶聯(lián)免疫吸附試驗（ EIISA）敏感性高，操作簡便，已廣泛用于多種病原體的抗原或抗體的檢測。多抗血清因其檢測制備周期短且使用比較簡單方便，檢測的靈敏度較高，在水產(chǎn)類的細菌性疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)揮了重要作用[19-28]。熒光素標記抗體（FA）是目前廣泛應(yīng)用于免疫病理、細胞化學(xué)、流式細胞學(xué)、病理學(xué)及自身抗體的臨床免疫中的特異、靈敏、定性和定位相結(jié)合的免疫化學(xué)試劑[29-34]?！颈狙芯壳腥朦c】國內(nèi)外學(xué)者已開展關(guān)于腦膜膿毒性伊麗莎白菌引起的蛙類“歪頭病”的研究，主要集中在PCR檢測及傳統(tǒng)的防治藥物篩選，有關(guān)病原的免疫學(xué)檢測及病原在宿主（蛙類）體內(nèi)遷移規(guī)律及該菌對蛙類的致病機理的研究有待深入探討。本研究通過制備蛙類腦膜膿毒性伊麗莎白菌多克隆抗體并建立檢測方法，同時將制備的多克隆抗體進行熒光標記用于腦膜膿毒性伊麗莎白菌在蛙體內(nèi)的示蹤研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究擬建立能夠快速、靈敏、特異地檢測腦膜膿毒性伊麗莎白菌的間接ELISA檢測方法，對棘胸蛙歪頭病的防控和早期診斷可提供理論參考依據(jù);另外利用免疫熒光檢測對病原菌在寄主體內(nèi)的示蹤，研究病原的致病機理及發(fā)病過程等，從而進一步掌握該病的發(fā)病規(guī)律，有助于對病害的診斷與防治提出更為有效的方法。

1材料與方法

1.1試驗菌株及材料

腦膜膿毒性伊麗莎白菌菌株RsB1151018NA為本實驗室分離白患“歪頭病”的養(yǎng)殖棘胸蛙腦部，其他菌株為本實驗室保存。

新西蘭大耳白兔2只，體重1.5 kg左右，經(jīng)檢疫無病原菌的一級動物，購于青島康大生物科技有限公司。

弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、四甲基聯(lián)苯胺（ TMB）、異硫氰酸熒光素（FITC）為美國SIGMA公司產(chǎn)品，ProteinA親和層析柱、Sephadex G-25柱、蛋白質(zhì)量標準（ Marker）為GE公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG（ Goat anti rabbit IgG-HRP）為Thermo Scientific Pierce產(chǎn)品，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1抗原制備 RsB1151018NA接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28℃、180 r·mm-1振蕩培養(yǎng)24 h，5 000 r·min-l離心10 min，弁上清，無菌PBS重懸菌體，再次離心收集菌體，4%甲醛滅活，經(jīng)涂布營養(yǎng)瓊脂平板驗證無活菌后離心棄上清，無菌PBS重懸菌體，超聲波破碎菌體，12 000 r·mm-1離心5 min，取上清得到抗原蛋白，蛋白定量，進行動物免疫。

1.2.2動物免疫 調(diào)整抗原蛋白含量，取免疫抗原與弗氏完全佐劑（基礎(chǔ)免疫）或弗氏不完全佐劑（加強免疫）充分乳化，之后分別在兔的背部皮內(nèi)多點注射。免疫兩只兔子，共免疫5次，免疫量每次I mg·只-1，每次免疫間隔20 d，第五次免疫后14 d取全血。靜置30 min后3 000 r·mm-1離心20 min，取上清即為多克隆抗體血清。

1.2.3抗體效價測定 調(diào)整抗原蛋白含量包被于96孔酶標板，0.1 ug·孔-1。以5%脫脂奶粉或1%BSA溶液封閉后備用。

將兔抗血清稀釋成：1：500，1：2 000，1：8 000，1：32 000.1：16 000，1：128 000，1：512 000.

1：2 048 000.100 uL·孔-1用于ELISA檢測。每個梯度設(shè)置2個平行組，以正常兔血清（免疫前的）1：10 000稀釋作為陰性對照。37℃孵育th，PBST清洗酶聯(lián)反應(yīng)孑L。Goat anti rabbit IgG-HRP反應(yīng)45 min，PBST清洗酶聯(lián)反應(yīng)孔。TMB顯色10 min后加入50 uL H2S04溶液（2 mol·L-1）終止反應(yīng)。OD450 nm處測得光密度值并進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4間接ELISA檢測方法的建立 腦膜膿毒性伊麗莎白菌間接ELISA檢測方法的最適含量和反應(yīng)條件采用方陣滴定法確定。特異性檢測：取抗原蛋白及其他對照菌株（表1）蛋白包被于酶聯(lián)反應(yīng)孔中，封閉后用于抗體特異性測定。

靈敏度檢測：無菌生理鹽水調(diào)整腦膜膿毒性伊麗莎白菌RsB1151018NA含量進行包被，稀釋倍數(shù)從1×lOs CFU·mL-l起，1%BSA封閉液封閉后，加入最適工作濃度兔抗腦膜膿毒性伊麗莎白菌多克隆抗體，進行間接ELISA法檢測。以檢測結(jié)果陽性的最小數(shù)值對應(yīng)的菌體濃度為檢測靈敏度。

1.2.5抗體純化 取10 mL兔血清用ProteinA親和層析柱進行抗體純化，并進行SDS-PAGE分析其純度。

1.2.6抗體標記 取6 mg抗體，用0.01 mol·L-1 PBS（ pH7.4）透析，再用0.1 mol·L-l NaHC03（ pH9.5）調(diào)pH值至9.0，然后加入FITC混勻，避光反應(yīng)2h，12 000 r·min-1高速離心5 min去除變性蛋白，用Sephadex G-25分離除去游離FITC并脫鹽，監(jiān)測回收第一峰即為IgG-FITC復(fù)合物。離心濃縮并凍干，使用0.01 mol·L-l PBS（ pH7.4）緩沖液（含1%BSA，50%甘油，0.03 %Proclin300）調(diào)整含量至2 mg-mL-l，500uL·管-1分裝。-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。

1.2.7病原菌體內(nèi)示蹤研究 菌株RsB1151018NA劃線接種BHI平板，30℃培養(yǎng)24h，以無菌生理鹽水洗下菌苔制備菌懸液母液，平板活菌計數(shù)法計數(shù)。以無菌生理鹽水稀釋菌懸液母液至10' CFU.mL-l，背部皮下注射10只健康棘胸蛙，注射劑量為0.5 mL.只-1。試驗持續(xù)3d，其間水溫保持18.5±1.0℃。于人工感染后的6、12、24、36、48、60、72 h，隨機抽取試驗蛙3只制備檢測樣本：無菌解剖試驗蛙，分別取背部肌肉、肝臟、腎臟、脾臟、腸道、心臟、血液、眼、腦等器官組織，常規(guī)冷凍切片，用異硫氰酸熒光素（ FITC）標記的兔抗腦膜膿毒伊麗莎白菌多克隆抗體與樣本反應(yīng)th，熒光顯微鏡觀察。每個標本觀察5個視野，以5個視野菌體數(shù)量平均值的對數(shù)繪制各器官組織中菌體數(shù)量動態(tài)變化曲線。

2結(jié)果與分析

2.1抗體效價測定

抗體效價測定結(jié)果見表2，結(jié)果顯示，兔抗多克隆抗體血清的效價達1：5.12×105以上。

2.2 ELISA條件優(yōu)化

經(jīng)方陣滴定法確定，抗原最適包被含量為1×10 7 CFU·mL-l，在加蓋恒溫箱中37℃包被過夜，用1%BSA封閉液封閉1.5 h;多克隆抗體最適含量為1：8×103（ 0.5 ug·mL-l），37℃作用1 h;羊抗兔IgG-HRP最佳含量為1：10 4，37℃加蓋恒溫箱中反應(yīng)，時間45 min。

2.3檢測靈敏度分析

兔多克隆抗體檢測抗原RsB1151018NA靈敏度分析結(jié)果見表3，結(jié)果表明，所制備的兔多克隆抗體對抗原RsB1151018NA的檢測靈敏度是1×104 CFU·mL-l。

2.4抗體純化

抗體純化效果見圖1～2，純化后的抗體僅出現(xiàn)50 kD和25 kD的條帶，與IgG蛋白電泳圖譜相符，表明抗體得到了有效純化。 抗體純化后抗體的效價分析結(jié)果見表4，結(jié)果表明，經(jīng)純化的多克隆抗體效價為1：1.6×10 4。

2.5抗體特異性分析

間接ELISA法分析兔多克隆抗體的檢測特異性結(jié)果見表5，結(jié)果表明，兔多克隆抗體與腦膜膿毒性伊麗莎白菌RsB1151018NA及LCCiL90625NA-C的檢測結(jié)果為陽性，與其他細菌的檢測結(jié)果為陰性，因此，制備的兔多克隆抗體可特異性檢測腦膜膿毒性伊麗莎白菌。

2.6抗體標記

標記后抗體純化圖譜見圖3，純化后抗體效價測定見表6，結(jié)果表明：抗體經(jīng)過標記且純化后的效價可達到1：1.6×10 3。

2.7病原菌體內(nèi)示蹤研究

試驗菌株RsB1151018NA不同時間段在蛙體不同組織器官的分布詳見表7、圖4～5。試驗結(jié)果顯示：（1）前12 h內(nèi)，RsB1151018NA在肌肉中含量最高，24 h后，在腎臟中含量最高，48 h后則是腦部含量最高，一直維持至72 h試驗結(jié)束;（2）肌肉、心臟中的菌體含量隨試驗時間推移逐漸減少，肌肉至60 h后、心臟至72 h后即無法觀測到菌體存在;血液在試驗期間菌數(shù)含量無明顯變化;肝臟、腎臟、脾臟則表現(xiàn)出先增加后逐步減少的趨勢;腸道白24h開始觀察到菌體后，一直到試驗結(jié)束，菌數(shù)均維持在相對穩(wěn)定的水平;眼、腦則白12 h觀測到菌體后，一直到試驗結(jié)束，菌數(shù)呈現(xiàn)出隨時間推移逐漸增多的趨勢;（3）試驗期間，部分臟器菌數(shù)的達峰時間分別為：肌肉、心臟6h，肝臟48 h，腎臟、脾臟和腸道36h。

試驗結(jié)果說明：RsB1151018NA在棘胸蛙體內(nèi)隨血液循環(huán)而分布至全身，可侵襲肌肉、肝臟、腎臟、脾臟、腸道、心臟、眼和腦等組織器官，腎臟、眼和腦感染程度最嚴重，推測這三個組織器官是其靶器官。

3討論

制備病原體的抗體，進行免疫學(xué)檢測已成為水產(chǎn)動物病原檢測的一個重要手段，間接ELISA技術(shù)應(yīng)用于其他水產(chǎn)病害方面的報道很多，國內(nèi)外學(xué)者已對嗜水氣單胞菌、鰻弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌等水產(chǎn)養(yǎng)殖重要致病菌建立了行之有效的快速檢測手段[19_28]，但是用于檢測棘胸蛙腦膜膿毒性伊麗莎白菌的有效方法尚待深入探討。

水產(chǎn)養(yǎng)殖動物細菌性病害的發(fā)生往往具有暴發(fā)性，快速檢測病原、診斷病害將實現(xiàn)病害及時防治、降低損失，但傳統(tǒng)的生理生化鑒定往往費時費力，影響病害的診斷及防治。酶聯(lián)免疫吸附實驗是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)。其操作方法很多，對于檢測抗原而言，主要有雙抗體夾心法和間接法兩種。由于EILSA敏感性高，操作簡便，現(xiàn)已廣泛用于多種病原體的抗原或抗體的檢測。多抗血清因其檢測制備周期短使用比較簡單方便，檢測的靈敏度較高，在水產(chǎn)類的細菌性疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查中都發(fā)揮了重要作用。本研究制備兔抗棘胸蛙腦膜膿毒性伊麗莎白菌多克隆抗體，效價為1：5.12×105.適用于后續(xù)研究;建立了間接ELISA檢測方法. 檢測靈敏度為1.0×104CFU·mL-l.由于該菌為條件致病菌，需達到一定濃度方可引起蛙發(fā)病，因此，本研究制備的抗體及檢測方法能夠滿足條件致病菌在生產(chǎn)實際的檢測、防治和預(yù)警的需要。該方法能檢測到的病原菌，與弧菌科常見水產(chǎn)動物病原菌無交叉反應(yīng)，在實際生產(chǎn)中對腦膜膿毒性伊麗莎白菌的檢測具有較強的實際意義，并為腦膜膿毒性伊麗莎白菌商品化檢測試劑盒的研制提供了理論依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

細菌對生物體的致病機理研究歷來是病原菌研究的重點，對防治藥物的研發(fā)和防治方法的確定具有重要的意義。對于腦膜膿毒性伊麗莎白菌的致病機理，目前主要集中于人類[35-36]，至于該菌對蛙類的致病機理，國內(nèi)外則鮮見研究與報道。本文嘗試通過對腦膜膿毒性伊麗莎白菌在棘胸蛙體內(nèi)的示蹤研究，掌握其在蛙體內(nèi)各臟器間的遷移規(guī)律，試驗結(jié)果提示，腦膜膿毒性伊麗莎白菌在棘胸蛙體內(nèi)隨血液循環(huán)而分布至全身各臟器組織，其靶器官為棘胸蛙的腎臟、眼和腦部，這與感染腦膜膿毒性伊麗莎白菌后病蛙主要癥狀表現(xiàn)為歪頭、白內(nèi)障、活動失衡等相符合。

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（責任編輯：林海清）

收稿日期：2021-04-15初稿;2021-0531修改稿

作者簡介：張新艷（ 1980-），女，碩士，高級工程師，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害（E-mail： swallowz47@163.com）

通信作者：曾占壯（ 1972-），男，碩士，副研究員，研究方向：水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害（E-mail： zengzhanzhuang@126.com）

基金項目：福建省科技計劃公益類專項（2019Rl014-5）：福建省海洋與漁業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整專項（閩財指[2017]1177號、閩財指[2018]829號）