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    匹諾塞林對缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)鈣離子及Caspase-12 表達的影響

    2021-11-11 08:18:38武彩霞馬曉茜唐敏芳于宗琴李婭寧霍連廣
    中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用 2021年19期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)鈣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)孵育

    武彩霞 馬曉茜 唐敏芳 于宗琴 李婭寧 霍連廣

    匹諾塞林是中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的一種新型腦保護新藥,屬于黃酮類化合物,蜂膠中含量較高。已有多項研究資料證明,匹諾塞林有抗氧化、抗炎、抗凋亡、血管舒張等多方面藥理作用[1-6],能減輕腦缺血再灌注損傷[7],但其作用靶點仍然不清楚。為進一步探討匹諾塞林腦保護的作用機制,為尋找其作用靶點提供啟示,本文用缺糖缺氧/復(fù)糖復(fù)氧損傷SHSY5Y 細(xì)胞模擬腦缺血再灌注損傷模型,觀察匹諾塞林對細(xì)胞內(nèi)鈣離子[Ca2+]i 變化及Caspase-12 表達的影響?,F(xiàn)報告如下。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑 匹諾塞林凍干粉,批號 201804;SH-SY5Y 細(xì)胞株,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所提供;DMEM/F12 培養(yǎng)基,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,Gibco 公司產(chǎn)品;胰蛋白酶、Sigma 公司產(chǎn)品;鈣離子熒光探針Furo 4-AM,Invitrogin 公司產(chǎn)品;Caspase-12(SC-5627)一抗,美國Santa Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品,Dylight651-conjugated 熒光二抗:美國CST 公司產(chǎn)品。

    1.2 主要儀器與設(shè)備 細(xì)胞孵育箱,日本三洋公司;高內(nèi)涵細(xì)胞成像儀,英國Thermo Fisher 公司;超凈純水儀,美國Beckman 公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 SH-SY5Y 細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM/F12 基質(zhì)中培養(yǎng),每2~3 天換液1 次。細(xì)胞呈對數(shù)增長時,加0.25%胰蛋白酶消化,200 μl/孔(5000 個/孔)接種在96 孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h 后,更換無糖EBSS 平衡鹽溶液(154 NaCl,5.6 KCl,5.0 HEPES,3.6 NaHCO3,2.3 CaCl2,pH 7.4;單位mmol/L)[8],隨機分為OGD/R 組及匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組,OGD/R 組不加任何藥物;匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組調(diào)整終濃度分別為0.01、0.10、1.00 μM。三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:37℃,5%CO2,1%O2,94%N2;培養(yǎng)2 h 后,移除培養(yǎng)液,更換完全培養(yǎng)基,復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:37℃,5%CO2,飽和濕度下培養(yǎng)12 h。對照組更換完全培養(yǎng)基,正常條件下培養(yǎng)。

    1.3.2 匹諾塞林對細(xì)胞Caspase-12 表達的影響 根據(jù)細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果(另文發(fā)表),高內(nèi)涵成像分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達的變化。

    上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 h 后,用預(yù)溫的PBS 洗滌細(xì)胞3 次,37℃條件下,4%多聚甲醛100 μl 固定20 min。吸除固定液,PBS 再洗滌3 次,用0.5% Triton X-100/PBS 100 μl 室溫條件下孵育10 min 后,PBS 再洗滌3 次;用含2%胎牛血清的PBS 37℃孵育60 min,吸除,加入一抗50 μl(1∶200 稀釋)4 ℃孵育過夜;吸除一抗,PBS洗滌3 次后,加入Dylight651-conjugated 熒光二抗50 μl(1∶200 稀釋)避光孵育2 h(37℃);吸除二抗,PBS 洗滌2 次,棄去上清,最后加入PBS 200 μl 于高內(nèi)涵成像儀拍照分析。

    1.3.3 匹諾塞林對細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響 預(yù)先用0.01%多聚賴氨酸包被96 孔板,按前述方法接種細(xì)胞。除去培養(yǎng)基,使用HBSS 溶液洗滌細(xì)胞3 次。每孔加入Fluo 4-AM 工作液(用HBSS 溶液稀釋配制,濃度5 μM)50 μl,37℃孵育30min。用HBSS 溶液洗滌細(xì)胞3 次,每孔加入100 μl HBSS 溶液,高內(nèi)涵成像儀拍照分析。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS18.0 進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用單因素方差分析(one-wayanalysis of variance,ANOVA)進行多組間數(shù)據(jù)比較。結(jié)合Student-Newman-Keuls 檢驗,P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 匹諾塞林對細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達的影響 與對照組比較,OGD/R 組細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與OGD/R 組比較,匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達均降低,其中匹諾塞林中劑量組、高劑量組細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達均低于OGD/R 組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

    圖1 匹諾塞林對OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)Caspase-12 表達的影響

    2.2 匹諾塞林對OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響與對照組比較,OGD/R 組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i 顯著增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與OGD/R 組比較,匹諾塞林低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i均下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05 或0.01)。見圖2。

    圖2 匹諾塞林對OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i 的影響

    3 討論

    SH-SY5Y 細(xì)胞株來源于人類胚胎中腦,其細(xì)胞形態(tài)、生理生化功能與正常神經(jīng)元相似[9]。通過缺糖缺氧后快速恢復(fù)氧糖供應(yīng)損傷SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞,可在細(xì)胞水平模擬臨床腦缺血再灌注損傷,進行細(xì)胞機制和藥物研究[10-12]。在本實驗中,采用OGD/R 損傷的SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞模型,證實匹諾塞林可以減輕OGD/R 造成的[Ca2+]i 升高及Caspase-12 表達增加。

    關(guān)于匹諾塞林,已有大量資料證實其可以減輕腦缺血再灌注損傷[7]。關(guān)于腦缺血再灌注損傷的病理機制非常復(fù)雜,近些年來,腦缺血再灌注時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生啟動的細(xì)胞凋亡通路引起廣泛關(guān)注[13,14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡主要有三條途徑:Caspase-12 的激活、CHOP/GADD153 轉(zhuǎn)錄激活及c-jun 氨基末端激酶(JNK)誘導(dǎo)凋亡[15]。本實驗室已經(jīng)證實,OGD/R 損傷SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞,可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生,細(xì)胞凋亡增加,匹諾塞林可以減少CHOP/GADD153 表達,減少細(xì)胞凋亡(該研究結(jié)果另文發(fā)表),本研究繼續(xù)探討對Caspase-12 的影響。

    Caspase-12 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一種特異性蛋白酶,其表達水平的高低直接反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。通常Caspase-12 主要以無活性的前體形式存在,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時活化[16],活化的Caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入到細(xì)胞漿中作用于Caspase-9,激活Caspase-3 引起細(xì)胞凋亡[17,18]。匹諾塞林能下調(diào)OGD/R損傷的SH-SY5Y 細(xì)胞Caspase-12 的表達,這可能是也是其抗凋亡,減輕腦缺血再灌注損傷的機制之一。

    研究表明,細(xì)胞內(nèi)Ca2+可能是主動調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要因素,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高參與了細(xì)胞凋亡早期的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存細(xì)胞內(nèi)80%~90%Ca2+,腦缺血再灌注時,引發(fā)細(xì)胞凋亡的多種刺激因素均可使Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放,造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯著增加[19],繼而引起線粒體通透孔的開放,導(dǎo)致線粒體腫脹、線粒體內(nèi)Ca2+超載,最終導(dǎo)致線粒體外膜破裂;同時釋放的Ca2+還可以激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、鈣蛋白酶、死亡相關(guān)蛋白酶和其相關(guān)的線粒體分裂融合蛋白,促使細(xì)胞色素C 釋放,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此細(xì)胞凋亡的線粒體相關(guān)信號途徑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)功能及[Ca2+]i 密切相關(guān)[20,21]。

    由上可知,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的耗竭是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要原因,相反,阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+外流可以促進細(xì)胞生存[22]。還有學(xué)者認(rèn)為,Caspase-12的活化也與細(xì)胞Ca2+平衡失調(diào)有關(guān)[17]。在本實驗中,匹諾塞林降低細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i,聯(lián)系本實驗室前期的研究結(jié)果——匹諾塞林能保護線粒體的結(jié)構(gòu)和功能[23-25],推測匹諾賽林可能在腦缺血再灌注的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時,對維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常結(jié)構(gòu)和功能有幫助,而這可能是其線粒體保護作用的上游事件。此外,匹諾塞林下調(diào)Caspase-12 表達,也可能與其降低細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i 有關(guān)。但是,對于OGD/R 損傷SH-SY5Y 細(xì)胞后,匹諾塞林降低細(xì)胞內(nèi)鈣的具體機制是什么,還需要更加深入的探討。

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