丹參注射液對(duì)神經(jīng)病理痛大鼠DRG神經(jīng)元P2X3受體的影響

張曉丹

神經(jīng)病理痛已經(jīng)被認(rèn)定為慢性疾病,其發(fā)生與神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等的作用影響有關(guān),因此,在臨床中很難被治愈。丹參的藥理活性體現(xiàn)在改善腦缺血再灌注損傷、血小板功能、血液流變學(xué)等方面,有鎮(zhèn)痛效果的可能性［1］。本研究分析丹參注射液對(duì)CII 大鼠P2X3 受體表達(dá)的影響,報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取由某醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的SD 大鼠18 只,均已成年,雄性,將其在室溫下進(jìn)行飼養(yǎng),不限制飲食。取250 g±25 g SD 雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、CCI 模型組、CCI+丹參注射液組,每組6 只。

1.2 研究方法 ①建立CCI 大鼠動(dòng)物模型：隨機(jī)將大鼠分為對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù),CCI 模型組與SF+CCI 模型組均建立疼痛模型,SF+CCI 模型組單獨(dú)進(jìn)行丹參注射液治療。②動(dòng)物行為學(xué)方法：觀察丹參注射液對(duì)CCI 大鼠痛覺(jué)行為的影響(測(cè)定痛閾)：測(cè)定各組動(dòng)物機(jī)械剌激及熱剌激痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象。③免疫組織化學(xué)反應(yīng)：先用兔抗P2X3(1∶500,CHEMICON International,Inc.)及生物素標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗血清(P2X3 和p38,1∶200,Vector,Burlingame)分別進(jìn)行抗生物素-生物素-辣根過(guò)氧化酶(ABC)免疫組化法反應(yīng),DAB 呈色。然后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)P2X3 和p38 雙重標(biāo)記染色觀察。采用Image-Pro Plus 圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化反應(yīng)結(jié)果的反應(yīng)密度進(jìn)行觀察并予以分析。對(duì)所有組別大鼠背根神經(jīng)節(jié)免疫組化反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。④原位核酸分子雜交試驗(yàn)：用地高辛標(biāo)記的P2X3 和p38 寡核苷酸探針對(duì)各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行原位雜交。⑤逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR 檢測(cè)：分別提取各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本總RNA 進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè),PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電［2］。⑥Western blot 分析：分別提取各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本蛋白,電泳樣品分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,用兔抗P2X3 和p38(1∶500,CHEMICON International,Inc.)及生物素標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗血清(P2X3 和p38,1∶200,Vector,Burlingame)進(jìn)行抗生物素-生物素-辣根過(guò)氧化酶(ABC)反應(yīng),進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 細(xì)胞面積測(cè)量以及數(shù)量統(tǒng)計(jì) 采用系統(tǒng)隨機(jī)抽樣法,在對(duì)照組和CCI 模型組、CCI+丹參注射液組的DRG 標(biāo)本中進(jìn)行片子挑選,每組挑選30 張,將OLYMPUS 顯微鏡的視野調(diào)節(jié)至適當(dāng)水平,將挑出的組織切片置于該顯微鏡下收集陰性及陽(yáng)性神經(jīng)元,收集過(guò)程中需進(jìn)行拍照,各50 張,同時(shí)利用HPIAS-1000 高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng),該系統(tǒng)中的面積測(cè)定功能可以完成對(duì)免疫陽(yáng)性細(xì)胞、免疫陰性細(xì)胞面積的測(cè)定,分別計(jì)算對(duì)照組和CCI 模型組、CCI+丹參注射液組大鼠免疫陽(yáng)性細(xì)胞的占比,按照百分比來(lái)計(jì)算,對(duì)各個(gè)區(qū)間內(nèi)免疫陽(yáng)性細(xì)胞面積的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì),對(duì)不同區(qū)間內(nèi)免疫陽(yáng)性細(xì)胞在總細(xì)胞中的占比進(jìn)行計(jì)算［3］。

1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 倒置顯微鏡 (Olympus,日本)1臺(tái)；超凈工作臺(tái)(國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；分析天平 (國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；電熱恒溫干燥箱(國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；電熱恒溫水浴箱(國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；隔水孵箱(國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；低溫冰柜(國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；高壓蒸汽滅菌器(國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；電子天平(國(guó)產(chǎn))1 臺(tái)；德國(guó)艾本德公司生產(chǎn)的低溫超速離心機(jī)和分光光度計(jì)各1 臺(tái)；Thermomixer(Eppendorf 公司)1 臺(tái)；電泳儀(Bio-Rad 公司)1 臺(tái)；垂直式電泳槽(Bio-Rad 公司)1 臺(tái)；硝酸纖維素膜電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(Bio-Rad 公司)1 臺(tái)；凝膠成像系統(tǒng)。

2 結(jié)果

2.1 正常大鼠DRG P2X3 受體表達(dá) 對(duì)照組中的所有大鼠背根神經(jīng)節(jié)處存在感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞,其屬于P2X3受體免疫陽(yáng)性反應(yīng),細(xì)胞被染色,呈現(xiàn)為深藍(lán)色,胞漿的標(biāo)記的關(guān)鍵處,胞核未被染色。免疫陰性反映中的感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞染色不深,強(qiáng)度有所不同。P2X3 受體免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞大部分為小細(xì)胞,在總細(xì)胞數(shù)中所占比例達(dá)到31.6%。對(duì)細(xì)胞面積進(jìn)行測(cè)量,并統(tǒng)計(jì)其數(shù)量后,P2X3 受體免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞面積的平均值達(dá)到(344.03±10.59)μm2。

2.2 各組術(shù)前術(shù)后的疼痛程度比較 術(shù)后1～24 d,SF+CCI 組疼痛程度均低于CCI 組與對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組術(shù)前術(shù)后的疼痛程度比較()

表1 各組術(shù)前術(shù)后的疼痛程度比較()

注：與SF+CCI 組比較,aP<0.05

2.3 免疫組化檢測(cè)DRG 神經(jīng)元P2X3 免疫反應(yīng) P2X3受體的表達(dá)在CCI+SF 組為(173.81±2.96),低于CCI 組的(282.31±2.69),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=66.447,P<0.05)。

3 討論

慢性炎癥痛很容易引發(fā)痛過(guò)敏、觸誘發(fā)痛等,但是具體的發(fā)生機(jī)制尚不明確,需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。大量研究表示,C 纖維以及Aδ 纖維會(huì)受到外周炎癥的影響,興奮度會(huì)有所增強(qiáng)［4］。C 傳入纖維緊密聯(lián)系于P2X3 表達(dá)小細(xì)胞。背根節(jié)小細(xì)胞存在P2X3 表達(dá),小細(xì)胞的占比較高,其屬于具有傷害性的感受器,說(shuō)明腺嘌呤核苷三磷酸發(fā)生傷害性感受器激活時(shí),腺嘌呤核苷三磷酸發(fā)揮了介導(dǎo)作用。其他相關(guān)研究也指出,發(fā)生面部慢性炎癥痛后,P2X3 表達(dá)的小細(xì)胞面積平均值有所增加,大細(xì)胞比例也有所上升。有研究結(jié)果顯示,對(duì)照組大鼠的P2X3 受體表達(dá)分布依然以中小型細(xì)胞為主［5］。

為發(fā)生異常的情況下,感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中的大細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行觸覺(jué)刺激傳送時(shí),主要是經(jīng)由AB 纖維來(lái)完成的。大量研究證實(shí),炎癥痛影響了AB 纖維的化學(xué)表型使其發(fā)生了變化,與此同時(shí),在無(wú)異常情況發(fā)生時(shí),背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可以選擇是否表達(dá)P 物質(zhì)。

三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate,ATP)是重要能量物質(zhì)。大部分學(xué)者表示,ATP 是作為遞質(zhì)存在于外周與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間。以腺苷和ATP 的選擇親和力為依據(jù),對(duì)“嘌呤受體”進(jìn)行區(qū)分,共有兩大類(lèi)型,即P1 受體和P2 受體。P2X 受體歸屬于離子通道受體家族,所包含的氨基酸有379～595 個(gè),跨膜結(jié)構(gòu)域2 個(gè),保守序列以胞外環(huán)結(jié)構(gòu)為集中位置。翻譯后修飾有兩類(lèi),即糖基化和磷酸化。現(xiàn)如今,應(yīng)用分子克隆技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物P2X 受體亞單位進(jìn)行克隆,已經(jīng)成功獲得7 個(gè)。ATP 刺激細(xì)胞興奮性被P2X 受體激活后,興奮性氨基酸得以大量釋放,傷害感受性反映被激發(fā),出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。功能性P2X 受體近似與配體門(mén)控離子通道,其組成結(jié)構(gòu)中包含大量的亞單位組合。在P2X 受體中,P2X2/3、P2X3、P2X4、P2X7 受體均與神經(jīng)病理痛有密切聯(lián)系。P2X3 受體在表達(dá)背根神經(jīng)節(jié)、結(jié)狀神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)等初級(jí)傳入感覺(jué)神經(jīng)時(shí)具有一定的選擇性,主要包括中小型神經(jīng)節(jié)細(xì)胞［6］。P2X 受體與神經(jīng)病理痛有密切關(guān)聯(lián),其中以P2X2/3、P2X3 受體為主。DRG 胞體P2X3 受體被交感神經(jīng)所釋放出的ATP激活后,在神經(jīng)病理痛中發(fā)揮影響,ATP 的釋放可以協(xié)同神經(jīng)肽和去甲腎上腺素,DRG 感覺(jué)神經(jīng)元因此被激活進(jìn)而產(chǎn)生疼痛感。初級(jí)傳入感覺(jué)神經(jīng)元被P2X3 受體表達(dá)時(shí),植物凝集素B4(IB4)、瞬時(shí)感受器電位香草酸受體1 (TRPV1)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)或P 物質(zhì)也可能會(huì)參與其中,表示該受體會(huì)影響痛信息處理。機(jī)體所感受到的疼痛程度受到P2X3 受體的影響,其表達(dá)上調(diào)或者活性增強(qiáng)均可能讓痛感加劇,反之則痛感得到緩解。目前,關(guān)于疼痛的治療研究更加偏向于P2X3 受體功能與數(shù)量的調(diào)節(jié)機(jī)制類(lèi)型、P2X3 受體表達(dá)下降或者脫敏的方法等［7］。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),P2X3 受體激動(dòng)劑的內(nèi)向電流受到前列腺素E2(PGE2)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (NGF)、P 物質(zhì)和谷氨酸等的影響會(huì)有所增強(qiáng),P2X3 受體功能因此可在短時(shí)間內(nèi)迅速上調(diào)。傳入神經(jīng)活化和炎癥反應(yīng)經(jīng)P2X 受體作為介導(dǎo),受到癌癥痛和慢性神經(jīng)病理痛的影響。P2X3 受體克隆取得成功后,其功能性在背根神經(jīng)節(jié)被發(fā)現(xiàn),這一發(fā)現(xiàn)為首例,經(jīng)深入研究后發(fā)現(xiàn),P2X3 受體表達(dá)僅局限于初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元,尤其是小直徑背根神經(jīng)節(jié),其對(duì)傷害性感受尤為明顯。在背根神經(jīng)節(jié)中,P2X 受體受到ATP的影響,與神經(jīng)病理痛的發(fā)生、感覺(jué)信息傳遞等密切相關(guān)。出現(xiàn)神經(jīng)病理痛的情況下,在背根神經(jīng)節(jié)中,P2X3 受體mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)［8］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,P2X3 受體與神經(jīng)病理性疼痛存在緊密的聯(lián)系,在預(yù)防和治療神經(jīng)病理痛時(shí)可作為靶點(diǎn)。所以,特異性的P2X3 受體阻斷劑可應(yīng)用于預(yù)防和治療神經(jīng)病理痛。

丹參屬于唇形科,是一種科鼠尾草植物,在活血化瘀的中藥材中應(yīng)用率較高,在《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次被記載,并認(rèn)為其屬于草部上品。丹參味道微苦,屬寒性,其主要功效包括活血化瘀、調(diào)經(jīng)止痛、養(yǎng)血安神、清心去燥等。古人認(rèn)為,丹參的功效可抵當(dāng)歸、地黃、芍藥、川穹,其具備當(dāng)歸補(bǔ)血生血、芍藥調(diào)血斂血、川穹生新祛瘀的功效。丹參之所以可以起到活血祛瘀的作用,主要是因?yàn)槠溆叙B(yǎng)血功效。丹參是一種傳統(tǒng)中藥材,同時(shí)也在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中占據(jù)重要地位。其由多種化學(xué)成分組成,主要包括水溶性酚酸類(lèi)化合物、脂溶性二萜醌類(lèi)化合物。近些年,有研究指出,在治療腦缺血再灌注損傷、血小板功能缺失、血液流變學(xué)異常等方面,丹參的藥理活性較為理想。通過(guò)清除、減少自由基產(chǎn)生,抑制過(guò)氧化反應(yīng)、抗炎癥介質(zhì),調(diào)節(jié)氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)保護(hù)神經(jīng)元,抑制凋亡細(xì)胞等實(shí)現(xiàn)藥理活性。由此提示丹參可能具有鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述,丹參注射液可抑制CII 大鼠P2X3 受體的表達(dá),對(duì)外周神經(jīng)疼痛的緩解作用主要通過(guò)免疫抑制劑抗炎效果來(lái)實(shí)現(xiàn)。