GmSTK12基因轉(zhuǎn)化大豆及對轉(zhuǎn)化體生物量影響的研究

柏 錫，陳 云，楊 雪，焦 爽，楊亞男，黃榮梅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

大豆作為糧食和經(jīng)濟作物在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用廣泛，作為常用豆制品、榨取豆油、提取蛋白質(zhì)、釀造醬油原料，其體內(nèi)所含氨基酸種類及比例與人體所需十分接近，易被消化吸收，是人類優(yōu)質(zhì)蛋白主要來源。由于環(huán)境影響，在遭受各種非生物脅迫時，其生長發(fā)育明顯滯后，生理機能遭到破壞，導(dǎo)致大豆產(chǎn)量降低[1-3]。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶是一類龐大的生物酶家族，參與蛋白質(zhì)磷酸化途徑，對真核生物生物學(xué)過程產(chǎn)生影響[4-5]。在植物中，蛋白激酶磷酸化過程被證實參與多種信號傳導(dǎo)途徑，目前已從擬南芥、小麥、玉米、水稻、番茄和大豆等植物中克隆出絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因。蔣正寧等研究發(fā)現(xiàn)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶TaS/TK基因可提高小麥條銹病菌抗性[6]；楊郁文等研究陸地棉發(fā)現(xiàn)編碼絲蘇氨酸蛋白激酶GhPK1基因參與鹽脅迫反應(yīng)[7]；陶曉迎等研究發(fā)現(xiàn)鹽藻絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因DsSTPK顯著提高鹽藻耐鹽性[8]；Karl-Jo?sef等研究水稻發(fā)現(xiàn)編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶SAPK4提高水稻耐鹽性[9]。與此同時，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)黃瓜中編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因Cs?PID導(dǎo)致葉片形狀發(fā)生改變，葉片形狀是植物重要結(jié)構(gòu)特征，受植物激素（特別是生長素）影響[10]；晉育丹研究發(fā)現(xiàn)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因PID在調(diào)節(jié)擬南芥信號通路中，促進側(cè)根細胞分裂和生長[11]；魏述剛研究發(fā)現(xiàn)馬鈴薯StBL-SLG/PK是一個典型的G-type lectin絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，顯著增強植株生長狀況，如株高、根長、鮮重等[12]。

上述研究表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類基因在植物抗逆、生長發(fā)育不同階段發(fā)揮重要作用，但對大豆中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶類基因功能研究知之甚少。為此，本文將大豆中絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12轉(zhuǎn)化大豆，獲得基因過量表達大豆材料，探究GmSTK12基因功能，闡明其對大豆植物生長發(fā)育影響，為培育大豆優(yōu)良品種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用供試大豆品種為東農(nóng)50；載體：pEASY-T3和pTF101.1；菌株：大腸桿菌DH5α和農(nóng) 桿 菌EHA101；TransStart FastPfu DNA Poly?merase，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Easy Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）和熒光定量試劑盒（TransStart Top Green qPCR SuperMix）均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1GmSTK12基因植物表達載體構(gòu)建

根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫提供的GmSTK12編碼區(qū)序列，設(shè)計克隆基因引物，以大豆品種Williams82葉片cDNA為模板，應(yīng)用TransStart FastPfu DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司）作PCR擴增，獲得GmSTK12基因CDS區(qū)，引物P1（見表1）。反應(yīng)體系為50 μL，包含cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各2.5 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 0.5 μL，buffer 25 μL，ddH2O 18.5 μL。PCR反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s；60℃退火20 s；72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃終延伸7 min。通過同源重組方法構(gòu)建植物表達載體。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.2大豆GmSTK12基因過表達材料獲得及鑒定

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化獲得大豆過表達材料，提取陽性大豆植株和東農(nóng)50葉片總DNA，以DNA為模板，使用Bar基因特異性引物作PCR擴增，引物P2（見表1）。根據(jù)擴增獲得的GmSTK12基因序列，設(shè)計半定量和定量引物P3和P4（見表1）。以過表達大豆和東農(nóng)50植株葉片180 ng·μL-1cDNA為模板，應(yīng)用EasyTaqMix（康為世紀公司）作半定量PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μL，包含cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，EasyTaqMix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。以過表達大豆和東農(nóng)50植株葉片180 ng·μL-1cDNA為模板，Tua5為內(nèi)參基因，引物P5（見表1）。應(yīng)用全式金熒光定量試劑盒（Trans?Start TopGreen qPCR SuperMix）作實時定量PCR擴增。反應(yīng)體系為15 μL，包含cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.6 μL，2xTransStart Top?Green qPCR SuperMix 7.5 μL，ddH2O 5.3 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s；60℃退火30 s,40個循環(huán)；溶解曲線，95℃15 s；65℃60 s；95℃1 s。每個反應(yīng)設(shè)1次重復(fù)。利用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。利用GraphPad Prism 5作圖及顯著性分析。

1.2.3 大豆GmSTK12基因生物學(xué)功能分析

挑選無病害、表面光滑、無破損東農(nóng)50和過量表達GmSTK12基因大豆種子，待種子萌發(fā)后，將其放置于溫度24℃，相對濕度60%，光照/黑暗為16 h/8 h人工氣候室中培養(yǎng)。分別取過表達及野生型V3和V6期植株各30株，使用毫米位直尺測量過表達及野生型（Wild type，WT）相同部位大豆葉片長寬比、葉面積、根長，并統(tǒng)計主根及側(cè)根數(shù)量。測定大豆生育期內(nèi)植株鮮重、植株干重、根鮮重、根干重，使用清水沖洗植株表面雜物，濾紙吸干表面稱量鮮重，105℃下30 min，80℃下烘干至恒重，稱量干重。使用葉綠素測定儀（型號：TYS-B）測定植株葉片葉綠素含量，每個試驗均使用3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。

1.2.4 大豆GmSTK12基因過表達植株農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

對在人工氣候室中種植東農(nóng)50和過量表達GmSTK12基因T1和T2代植株作常規(guī)農(nóng)藝性狀考種。每個品種隨機選取5株，收獲后調(diào)查每株株高、主莖節(jié)數(shù)、有效分枝數(shù)、單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重，取5株平均值作為各性狀表型數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆GmSTK12基因過表達材料獲得及鑒定

如圖1A所示，通過同源重組方法構(gòu)建pTF101.1-GmSTK12植物表達載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化法對東農(nóng)50轉(zhuǎn)化，對獲得植株完全展開嫩葉作草銨膦涂抹陽性苗鑒定（草銨膦濃度為160 ng·μL-1）培養(yǎng)，獲得GmSTK12基因過量表達大豆材料T1代陽性植株7株，分別命名為：FTDY-1、FTDY-4、FTDY-5、FTDY-11、FT?DY-13、FTDY-14、FTDY-15（見圖1B、E）。

心臟瓣膜二尖瓣位于左房室口周緣，與乳頭肌相連，其主要作用是維持心室血液的正常循環(huán)，防止左心室血液回流[6]。瓣葉、瓣環(huán)、乳頭肌或左心室中任何一個部分出現(xiàn)結(jié)構(gòu)改變，均可導(dǎo)致二尖瓣關(guān)閉不全，嚴重影響患者的健康安全[7-8]。目前，臨床上普遍采用單純的CABG治療輕度二尖瓣關(guān)閉不全，有利于改善左心室體積。而對于重度二尖瓣關(guān)閉不全通常需要行CABG聯(lián)合MVR治療[9-10]。

將所獲得T1和T2代植株取材，分別提取東農(nóng)50和過量表達GmSTK12基因植株DNA鑒定標記基因Bar是否成功導(dǎo)入受體大豆。由圖1C、F可看出，7份材料中均有Bar基因，且轉(zhuǎn)基因材料中GmSTK12基因表達量高于受體品種東農(nóng)50。同時，研究東農(nóng)50和過量表達GmSTK12基因植株轉(zhuǎn)錄水平上測定目的基因是否表達，通過提取東農(nóng)50和過量表達GmSTK12基因植株RNA作反轉(zhuǎn)錄cDNA，分析目的基因轉(zhuǎn)錄水平。由圖1D、G可看出，qRT-PCR檢測結(jié)果中T1代材料FTDY-11中GmSTK12基因表達量上調(diào)倍數(shù)達到300倍以上，T2代材料FTDY-11中GmSTK12基因表達量上調(diào)倍數(shù)也達到200倍以上。材料FTDY-1、FTDY-4、FT?DY-13、FTDY-14、FTDY-15中GmSTK12基因表達量上調(diào)倍數(shù)也超過100倍。表明已成功獲得Gm?STK12基因過量表達的大豆材料，下一步將選取表達量較高的FTDY-4、FTDY-11、FTDY-15開展下一步試驗，分析GmSTK12基因生物學(xué)功能。

圖1 GmSTK12過量表達大豆植株分子鑒定Fig.1 Molecular identification of GmSTK12 overexpressing soybean plants

2.2 GmSTK12基因過量表達對大豆葉片長寬比和葉面積的影響

在溫室內(nèi)應(yīng)季盆栽播種GmSTK12基因過量表達大豆材料FTDY-4、FTDY-11、FTDY-15和對照品種東農(nóng)50各30株開展試驗，在調(diào)查植株初期性狀時并未發(fā)現(xiàn)大豆植株有明顯差異，但當植株生長至V6期時發(fā)現(xiàn)過量表達GmSTK12基因植株葉面積發(fā)生明顯改變，推測GmSTK12基因可能調(diào)控植株葉片大小，故調(diào)查植株V3、V4、V5、V6不同生長階段葉長、葉寬及葉面積并作統(tǒng)計（V4、V5數(shù)據(jù)見圖2）。由圖3可知，植株生長VC至V3期時，兩者葉片大小無顯著差異（見圖3A~C），且由圖2數(shù)據(jù)顯示，V4、V5期時植株葉片大小也無明顯差異，而待植株生長至V6期時，過量表達GmSTK12基因植株葉片長寬比及葉面積開始高于對照品種。經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，T1代過量表達植株葉面積約為對照品種葉面積2倍，且植株葉片長寬比差異顯著，同時由圖3可知，T2代植株葉面積及葉片長寬比與T1代一致，均顯著高于對照品種，且T2代植株與T1代相比，表型更明顯（見圖3D~F）。結(jié)果表明，Gm?STK12基因可改變大豆植株葉片大小。

圖3 大豆GmSTK12基因過量表達對T1、T2代植株葉片大小的影響Fig.3 Effects of soybean GmSTK12 gene overexpression on leaf size of T1 and T2 generation plants

2.3 GmSTK12基因過量表達對大豆根部的影響

為進一步分析GmSTK12基因功能，研究過量表達GmSTK12基因?qū)Υ蠖沟叵赂康挠绊懀虼诉x擇3份GmSTK12基因過量表達大豆材料FTDY-4、FTDY-11、FTDY-15和對照品種東農(nóng)50植株數(shù)量各30株，分別測量其根長及側(cè)根數(shù)量。

由圖4A~C可看出，T1代GmSTK12基因過量表達植株根長與對照品種相比顯著增長，約為對照品種植株根長2倍，表明過量表達GmSTK12基因植株根長增加，更利于吸收地下水分及礦質(zhì)元素，植株生長旺盛；同時，過量表達植株側(cè)根數(shù)量也明顯高于對照品種植株，約為對照品種植株側(cè)根數(shù)量1.5倍，由圖4D~F可看出，T2代植株根長大于對照品種植株，側(cè)根數(shù)量也多于對照品種，但與T1代植株相比，根長略長，而側(cè)根數(shù)量相對較少。結(jié)果表明GmSTK12基因可使大豆植株根部形態(tài)發(fā)生改變。結(jié)果表明，過量表達GmSTK12基因根部生長情況較對照品種東農(nóng)50更具優(yōu)勢。

圖4 大豆GmSTK12基因過量表達對T1、T2代植株根長及側(cè)根數(shù)量的影響Fig.4 Effects of soybean GmSTK12 gene overexpression on root length and lateral root number of T1 and T2 generation plants

2.4 GmSTK12基因過量表達對大豆植株地上及地下部分生物量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，過量表達GmSTK12基因?qū)Υ蠖怪仓耆~片大小及根部形態(tài)均有顯著影響，為進一步確定過量表達GmSTK12基因?qū)Υ蠖怪仓甑厣霞暗叵虏糠稚锪渴欠褚灿杏绊?，測定T1、T2代過量表達GmSTK12基因植株鮮重、干重、根干重、根鮮重。由圖5A~H可看出，T1、T2代過量表達Gm?STK12基因植株鮮重和干重略高于對照品種，而根干重和根鮮重顯著高于對照品種，均約為對照品種植株2倍。結(jié)果表明，過量表達GmSTK12基因增加大豆植株生物量，說明過量表達GmSTK12基因有助于植株營養(yǎng)代謝、生命活動旺盛。

圖5 GmSTK12基因過量表達對大豆植株生物量的影響Fig.5 Effects of GmSTK12 gene overexpression on soybean plant biomass

2.5 GmSTK12基因過量表達對大豆植株葉綠素含量的影響

圖6 GmSTK12基因過量表達對大豆植株葉綠素含量的影響Fig.6 Effects of GmSTK12 gene overexpression on chlorophyll content of soybean plants

2.6 GmSTK12基因過量表達對大豆植株產(chǎn)量性狀的影響

通過分析植株地上葉片面積及地下部分主根長度、側(cè)根數(shù)量及葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，過量表達Gm?STK12基因增強植株地上及地下生長發(fā)育狀況，主根增長以及葉綠素含量增加優(yōu)勢使過量表達Gm?STK12基因植株地上部分葉面積增加，增強其光合作用合成有機物。因此進一步分析GmSTK12基因是否可通過增強大豆植株生長發(fā)育，進而提高大豆產(chǎn)量。

對農(nóng)藝性狀考種，由圖7可看出，T2代過量表達GmSTK12基因植株主莖節(jié)數(shù)、有效分枝數(shù)、株高與對照品種相比無顯著差異，但單株莢數(shù)、單株粒數(shù)、百粒重均顯著高于對照品種。結(jié)果表明，GmSTK12基因通過調(diào)控主根長度增加以及地下部分生物量改變，提高對水分及礦質(zhì)元素含量吸收，增強植物營養(yǎng)物質(zhì)，且地上V6期葉片面積增加提高植物葉綠素含量，并有助于植物光合作用，增強營養(yǎng)生長期營養(yǎng)物質(zhì)儲備，以此改善生殖生長期地上部分對大豆產(chǎn)量的調(diào)控。

圖7 GmSTK12基因過量表達對大豆植株產(chǎn)量性狀的影響Fig.7 Effects of GmSTK12 gene overexpression on yield characters of soybean plants

3 討論

絲/蘇氨酸蛋白激酶基因是一類龐大信號分子，在作物生長發(fā)育中具有重要應(yīng)用價值，其功能涉及作物生殖生長、株型、植株生物量及脅迫耐受性等方面。本研究克隆大豆中絲/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因株系，研究過量表達植株地上部分表型發(fā)現(xiàn)，過量表達GmSTK12基因植株葉面積明顯大于對照品種植株（見圖3C、F），與Zhang等在黃瓜中發(fā)現(xiàn)編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶基因CsPID導(dǎo)致葉片增長結(jié)果一致[10]，為探究其葉面積增加對植株光合作用影響，同時測定過量表達Gm?STK12基因植株和對照品種東農(nóng)50葉片中葉綠素含量，過量表達植株葉綠素含量顯著高于對照品種（見圖6A、B），推測過量表達植株可能通過葉綠素含量增加吸收更多光能增強植株光合作用，合成有機物，使過量表達GmSTK12基因植株在營養(yǎng)生長期優(yōu)于對照品種東農(nóng)50；同時研究植株地下部分表型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其根長與側(cè)根數(shù)量均顯著優(yōu)于野生型，研究發(fā)現(xiàn)水稻中編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶基因OsASR6過表達品系使植株葉片增大，花序抽穗、角果和種子增多，且在根部生長中影響顯著，與莖生物量增加1.7倍相比，根生物量增加4倍[13]，與本試驗結(jié)果一致，從而推測GmSTK12基因可能通過增加根部生物量（根干重，根鮮重等），增強植株吸水及保水能力，提高地下部分對水分及礦質(zhì)元素的吸收，通過地下部分向地上部分運輸營養(yǎng)物質(zhì)，使植株地上部分也優(yōu)于野生型植株，如植株鮮重和干重顯著高于野生型（見圖5A~H）。與此同時，過量表達植株側(cè)根數(shù)量增多，根毛也隨之增加，根毛是由根尖表皮的生毛細胞（Trichoblasts）發(fā)育而來，根毛形成顯著增加根表皮細胞表面積，有助于根對土壤水分營養(yǎng)吸收和與土壤微生物的相互作用，促進植物生長發(fā)育[14-15]。通過統(tǒng)計植株生殖生長期產(chǎn)量性狀發(fā)現(xiàn)，過量表達GmSTK12基因植株株系單株粒數(shù)、單株莢數(shù)及百粒重顯著高于野生型，說明GmSTK12基因還具有提高大豆產(chǎn)量的功能，這一功能可能與植株根生長狀況、葉面積大小及葉綠素含量均存在一定相關(guān)性，但GmSTK12基因?qū)τ诖蠖股L發(fā)育影響的具體機制還需進一步研究。

目前大豆中有關(guān)絲/蘇氨酸蛋白激酶對植株生長發(fā)育的功能研究尚未明確，因此本研究以東農(nóng)50為受體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法獲得GmSTK12過表達植株，分析其全生育期表型及生物量。驗證大豆中編碼絲/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12具有增加大豆植株生物量及產(chǎn)量的功能，為進一步探討大豆中絲/蘇氨酸蛋白激酶基因GmSTK12生理機制提供重要線索。