硒對鉛中毒誘導蛋雞腎臟炎癥損傷緩解作用研究

趙 騫，劉桐序，李 琦，秦 雪，黃 賀

（東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱150030）

鉛（Pb）是一種有毒物質(zhì)，不僅導致飼料、食品、水土污染，也損害人類神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)[1-2]。鉛過量可誘發(fā)人和動物炎癥并損害腎臟[3]。炎癥產(chǎn)生與白細胞介素-6（IL-6）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）和環(huán)氧化酶-2（COX-2）有關(guān)[4]。NF-κB可介導炎癥反應且調(diào)控TNF-α和COX-2等表達[5]；NF-κB、TNF-α和COX-2均參與鉛誘導的肝臟炎癥[6]。氧化應激與雞法氏囊和腸道損傷有關(guān)[7]，鉛可通過改變谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）誘導氧化應激。雞血清中肌酐（CREA）和尿酸（UA）含量是檢測機體腎功能的指標，當腎臟發(fā)生損傷時，腎功能減退，引起CREA和UA含量升高[8]，可通過檢測兩者濃度判斷鉛對腎功能的損傷。

硒（Se）是一種具有抗氧化和抗炎特性的微量元素[9]，可減輕鉛處理后雞只氧化應激反應[10]、細胞因子[7]和炎癥損傷[11]。楊凱研究發(fā)現(xiàn)硒改善鉛誘導雞免疫器官中T-AOC、GPx、GST、SOD和CAT活力及GSH、MDA和H2O2含量[12]；王克鑫研究表明硒緩解鉛對雞腎臟毒性[13]；Xu等研究表明長期暴露于硒和鉛會影響雞肝中離子分布，硒對鉛的緩解作用可能與雞肝中離子譜變化有關(guān)[14]。

目前關(guān)于鉛中毒對機體損傷研究較多，且大多集中于人類與嚙齒動物。腎臟是鉛中毒重要靶器官之一，但硒對鉛誘發(fā)腎臟炎癥的緩解作用尚未完全了解，需進一步研究。因此，文章以雞為研究對象，設計鉛硒互作模型，通過檢測鉛硒濃度、腎臟功能、氧化應激指標和炎癥相關(guān)因子，繼續(xù)探討炎癥機制及硒對鉛引起的雞腎臟炎癥緩解作用，為鉛對腎臟的毒性研究和硒對鉛引起的腎臟炎癥緩解提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組與管理

于哈爾濱先鋒孵化場購買80只1日齡海蘭白蛋雞，飼喂一周標準日糧和飲水后，選擇體重相近72只健康小雞隨機平均分配到對照組、鉛組、硒組和鉛硒組中，各組日糧和飲水分別為：對照組采用標準日糧，標準飲水；鉛組采用標準日糧，加鉛飲水（350 mg·L-1鉛）；硒組采用加硒日糧（1 mg·kg-1硒），標準飲水；鉛硒組采用加硒日糧（1 mg·kg-1硒），加鉛飲水（350 mg·L-1鉛）。日糧和飲水中通過添加Na2SeO3和（CH3OO）2Pb達到設定濃度。蛋雞在正式試驗過程中單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水。分別在試驗第4、8和12周后，心臟取血后置于EP管中用于檢測腎功能指標。然后對蛋雞進行安樂死，置于冰盤上解剖，采集腎臟組織，用于試劑盒檢測和mRNA表達、蛋白質(zhì)表達檢測。

1.2 腎臟中硒和鉛濃度檢測

每個腎臟樣品（約1 g）和空白對照分別于80℃下消化4 h后用純水將溶液定容至10 mL，溶液分別在100℃、150℃和180℃加熱3、10和45 min。用純水將獲得的樣品體積定容至10 mL，電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS；Thermo iCAPQ，USA）測定樣品中鉛和硒濃度。

1.3 腎功能指標檢測

將采集血液樣品靜置30 min后以4 000 r·min-1離心10 min取上清液，使用自動化診斷分析儀按照試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）說明檢測雞血清中肌酐（CREA）（Kit number：C011-2）和尿酸（UA）（Kit number：C012-1）含量。

1.4 氧化應激指標檢測

將一部分腎臟組織樣本勻漿，用生理鹽水稀釋10倍，2 500 r·min-1離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明（購自南京建成生物工程研究所）測定MDA、GSH、GPx和SOD含量。

1.5 mRNA表達檢測

每個腎臟樣本取約0.1 g，加入1 mL TRIzol試劑（TaKaRa，Japan），用冷凍研磨儀反復研磨至樣本粉碎，提取腎臟組織總RNA。用分光光度計（保健生物科學公司，瑞典）測定RNA的OD260/OD280。使用試劑盒（PrimeScriPt?RT，日本），在60 μL反應體系中將提取總mRNA合成cDNA。β-actin作為內(nèi)參基因，引物由上海Invitrogen公司合成，序列見表1。用試劑盒（羅氏公司，瑞士）在10 μL反應體系中作實時熒光定量PCR反應，用2-ΔΔCT方法計算mRNA相對表達量。

表1 實時定量PCR引物Table 1 Primers used for quantitative real-time PCR

1.6 蛋白質(zhì)表達檢測

第12周用Western、IP細胞裂解緩沖液（Beyo?time，上海）和苯甲基磺酰氟（Beyotime，上海）提取雞腎臟總蛋白。蛋白濃度用BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo Scientific，美國）測定?？偟鞍子肧DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在含20%甲醇的三甘氨酸緩沖液中轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂牛奶在37℃用一級抗體孵育硝化纖維素膜2 h（cas?pase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2），4℃過夜保存，在磷酸緩沖鹽水中用吐溫20洗滌3次（每次15 min），用過氧化物酶結(jié)合物和辣根過氧化物酶結(jié)合物二級抗體孵育細胞膜。添加新制的BeyoECL Plus（Beyotime，Shanghai，上海），最后使用化學發(fā)光儀器（Amersham Imager 600 RGB，General Electric Company，美國）對膜進行成像。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結(jié)果以平均數(shù)±標準差（n=6）表示，用R 3.6.2作統(tǒng)計分析。對硒和鉛濃度、肌酐和尿酸含量及caspase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2蛋白表達量作正態(tài)性和方差齊性檢驗，通過后用單因素方差分析，對存在顯著差異因素用Bonfferoni作多重比較分析。對氧化應激指標、細胞因子和炎癥相關(guān)基因mRNA表達量作正態(tài)性和方差齊性檢驗，通過后用雙因素方差分析，對存在顯著差異的因素用Bonfferoni法作多重比較；若未通過正態(tài)性和方差齊性檢驗，用Kruskal-Wallis秩和檢驗分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中肌酐和尿酸含量及腎臟中硒和鉛濃度

為評估鉛和硒對腎功能的影響，在第12周時測定血清中肌酐和尿酸含量及腎臟中硒和鉛濃度，結(jié)果見圖1。

由圖1A和1B可知，肌酐和尿酸含量在對照組和硒組中差異不顯著（P>0.05）；鉛組和鉛硒組中肌酐含量顯著高于對照組和硒組（P<0.05），鉛組顯著高于鉛硒組（P<0.05）。由圖1C可知，硒濃度由高到低為硒組、對照組、鉛硒組和鉛組，組間差異顯著（P<0.05）。由圖1D可知，鉛濃度由高到低為鉛組、鉛硒組、對照組和硒組，組間差異顯著（P<0.05）。

圖1 血清中肌酐和尿酸含量及腎臟中硒和鉛濃度Fig.1 Se and Pb concentrations in chicken kidneys and CREA and UA contents in chicken serum

2.2 MDA、GSH含量及SOD、GPx活性

為評估鉛和硒對氧化應激的影響，在第4、8和12周時測定雞腎臟中MDA和GSH含量及SOD和GPx活性（見圖2）。除對照組和硒組之間MDA和GSH含量及SOD活性外，各組MDA（見圖2A）和GSH（見圖2B）含量及SOD（見圖2C）和GPx（見圖2D）活性在3個時間點上均差異顯著（P<0.05）。與對照組和硒組相比，鉛組和鉛硒組MDA含量顯著提高（P<0.05），其他3個指標顯著降低（P<0.05）。與鉛硒組相比，鉛組MDA含量顯著升高（P<0.05），其他3個因子顯著降低（P<0.05）；對照組GPx活性顯著低于硒組（P<0.05）。此外，MDA含量隨鉛處理時間增加呈顯著上升趨勢（P<0.05），其他指標均呈顯著下降趨勢（P<0.05）。

圖2 氧化應激指標Fig.2 Oxidative stress indicators

2.3 細胞因子mRNA表達

本試驗中，在3個時間點檢測雞腎臟中IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ中mRNA表達水平（見圖3）。4種細胞因子中檢測結(jié)果在對照組和硒組間均無顯著差異（P>0.05）。與對照組相比，IL-1β（見圖3A）、IL-6（見圖3B）、IL-17（見圖3C）mRNA表達水平顯著升高（P<0.05）；第8和12周時鉛硒組和鉛組IFN-γ的mRNA表達水平顯著低于對照組和硒組（P<0.05）。第4、8和12周，鉛組中IL-1β、IL-6、IL-17的mRNA表達隨鉛處理時間增加顯著升高（P<0.05），相反IFN-γ的mRNA表達顯著降低（P<0.05）?？煽闯鯥L-1β、IL-6、IL-17的mRNA表達隨鉛處理時間增加呈顯著升高趨勢（P<0.05），IFN-γ mRNA表達水平呈顯著下降趨勢（P<0.05）。

圖3 細胞因子mRNA表達Fig.3 mRNA expression of cytokines

2.4 炎癥因子mRNA和蛋白質(zhì)表達

為確定鉛是否能引起炎癥損傷和硒對鉛毒性緩解作用，在第4、8和12周檢測caspase-1（見圖4A）、TNF-α（見圖4B）、NF-κB（見圖4C）、NLRP3（見圖4D）、COX-2（見圖4E）mRNA表達及上述因子在第12周蛋白質(zhì)表達水平（見圖4F）。上述指標在對照組與硒組間差異不顯著（P>0.05）。與對照組和硒組相比，鉛組和鉛硒組中caspase-1、TNF-α、NF-κB、NLRP3和COX-2中mRNA和 蛋 白 質(zhì) 相對表達量顯著升高（P<0.05）。鉛組上述因子mRNA和蛋白質(zhì)表達量也顯著高于鉛硒組（P<0.05），且mRNA表達量均隨鉛處理時間增加呈顯著升高趨勢（P<0.05）。

圖4 炎癥因子mRNA和蛋白表達Fig.4 mRNA and protein expression of inflammatory factors

3 討論

腎臟是鉛積累主要器官，過量鉛損害雞腎臟功能并引起炎癥。NLRP3激活有助于小鼠慢性促炎狀態(tài)發(fā)展[15]，研究發(fā)現(xiàn)炎癥參與鉛引起的小鼠腎臟損傷[16]。本研究中鉛處理后蛋雞腎臟中發(fā)現(xiàn)高濃度鉛，血清中肌酐和尿酸含量升高說明鉛發(fā)揮毒性并誘導雞腎臟發(fā)生炎癥損傷。此外，發(fā)現(xiàn)補充鉛增加蛋雞腎臟組織鉛濃度且降低硒濃度，進一步證明鉛在腎臟有積累效應。

NLRP3炎癥體是炎癥性疾病的廣泛特征之一。NLRP3炎癥小體中caspase-1的激活可誘導IL-1β和IL-18成熟，促進炎癥反應[17]。NLRP3、caspase-1和IL-1β在血紅素引起的小鼠腎臟炎癥中表達上調(diào)[18]；H2S暴露增加IL-1β的表達導致蛋雞胸肺炎癥損傷[19]。因此，研究NLRP3、caspase-1和IL-1β是否與鉛處理蛋雞腎臟炎癥損傷有關(guān)。在鉛處理蛋雞腎臟中，NLRP3、caspase-1和IL-1β表達上調(diào)并發(fā)生炎癥反應，表明NLRP3是通過觸發(fā)caspase-1和IL-1β介導鉛引起炎癥損傷。此外第12周鉛組NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA表達水平分別是對照組的10.45倍、13.05倍和4.90倍，因此推測NLRP3炎癥小體、caspase-1和IL-1β可能是鉛致蛋雞腎臟炎癥損傷的敏感因子。

NF-κB、TNF-α和COX-2在炎癥反應中起重要作用。研究表明，過量鉛增加NF-κB、TNF-α和COX-2中mRNA表達水平進而引起蛋雞腸道炎癥反應[20]。本研究中進一步研究發(fā)現(xiàn)，鉛處理蛋雞腎臟中NF-κB、TNF-α和COX-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平升高，IL-6、IL-17 mRNA表達水平升高、IFN-γmRNA表達水平下降并發(fā)生炎癥反應，進一步證實鉛對雞腎臟造成炎癥損傷。另外發(fā)現(xiàn)，在雞腎臟中NLRP3、caspase-1、細胞因子（包括IL-1β、IL-6、IL-17和IFN-γ）和炎癥因子（包括NF-κB、COX-2和TNF-α）mRNA表達與染鉛毒時間有關(guān)。Sun等研究也認為NF-κB、TNF-α和COX-2的mRNA在淋巴細胞[21]和睪丸[22]中表達均具有時間效應。

有害物質(zhì)（如鎘、硫化氫、氨）也可誘導氧化應激。GSH、SOD和GPx是抗氧化酶，能抵抗活性氧引起的副作用，相反MDA是氧化應激標志物，指示活性氧過度產(chǎn)生和細胞膜損傷。Chi等研究發(fā)現(xiàn)，鉛暴露導致雞肝臟氧化損傷，抑制GST和GPx等抗氧化酶活性同時增加MDA含量[23]；鉛通過降低雞睪丸中GSH、SOD和GPx導致氧化應激[24]。本文預測氧化應激與炎癥發(fā)生有關(guān)，并通過測定GSH和MDA含量及SOD和GPx活性驗證。本研究發(fā)現(xiàn)鉛處理后MDA含量升高，GSH含量、SOD和GPx活性降低且出現(xiàn)氧化應激反應。從上述發(fā)現(xiàn)推斷，鉛引起的氧化應激激活NLRP3進一步刺激炎癥反應引起雞腎臟損傷，與上述研究結(jié)果一致。另外，上述氧化應激指標變化也與鉛處理時間有關(guān)。

硒可減輕鉛對雞器官造成的損傷。研究發(fā)現(xiàn)鉛濃度、CREA和UA含量升高及硒濃度下降，表明硒減輕鉛引起腎臟炎癥損傷。硒具有拮抗鉛引起雞肝臟炎癥因子及熱休克蛋白表達增加的作用[25]；?zkan-Y?lmaz等研究發(fā)現(xiàn)，硒可改善鉛誘導鯉魚肝臟和腦組織氧化應激[26]；硒拮抗鉛引起尼羅羅非魚腎毒性，可改善鉛中毒尼羅羅非魚腎功能[27]，均與本文研究結(jié)果一致。但具體緩解作用機制尚不明確，可能是因硒與重金屬鉛形成硒-鉛復合物，緩解鉛毒性[28]。

考慮到硒抗氧化和抗炎特性，本文進一步研究硒是否緩解鉛誘導雞腎臟氧化應激和炎癥。硒處理使雞睪丸中GSH含量和SOD活性增加并緩解氧化應激[29]。硒通過降低脂多糖處理巨噬細胞中NF-κB、TNF-α和IL-6緩解炎癥[30]。本試驗中，硒緩解由鉛引起的MDA、NLRP3炎性小體、cas?pase-1、NF-κB、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17增多及GSH、SOD、GPx、IFN-γ減少，與前人研究結(jié)果一致。從上述結(jié)果推斷，硒緩解雞腎臟中鉛引起的氧化應激和炎癥反應。

4 結(jié)論

硒緩解鉛處理過的雞腎臟炎癥損傷；NLRP3炎癥小體、caspase-1、TNF-α、NF-κB和COX-2參與硒緩解鉛誘導的雞腎臟氧化應激介導的炎癥損傷機制，其中NLRP3炎性小體、caspase-1和IL-1β可能是鉛致雞腎臟炎癥損傷敏感因子。