耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌易感因素及其碳青霉烯酶表型分析

許曉波，杜恒超，陸爾杰

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，浙江 杭州 310053；2.浙江省榮軍醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 嘉興 314001)

碳青霉烯類藥物是一類具有β內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素。隨著此類藥物的應(yīng)用，臨床上對其產(chǎn)生耐藥的革蘭陰性桿菌也越來越多，這給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)[1]。從2005年到2017年，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥率從3.0%上升到20.9%[2]。分析耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-resistantEnterobacterales, CRE)感染的危險(xiǎn)因素可以在一定程度上避免耐藥菌的產(chǎn)生，為避免易感因素的暴露提供依據(jù)，同時(shí)也是預(yù)防醫(yī)院感染的重要依據(jù)。碳青霉烯酶可分為A、B、C、D 4類，其中A、C和D類具有水解碳青霉烯類活性而被稱為絲氨酸碳青霉烯酶。B類需要金屬離子來催化活性，金屬碳青霉烯酶就屬于此類酶[3]。研究[4]顯示，阿維巴坦有廣泛抑菌作用，但僅對絲氨酸碳青霉烯酶有抑制作用。本文分析CRE產(chǎn)碳青霉烯酶情況，以期為臨床應(yīng)用阿維巴坦復(fù)合制劑藥物提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集浙江省榮軍醫(yī)院2019年6月—2020年1月臨床感染的耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌114株，其中包括大腸埃希菌14株、肺炎克雷伯菌86株、奇異變形桿菌5株、黏質(zhì)沙雷菌8株、普羅維登斯菌1株，并選擇同期同科室收集的碳青霉烯類藥物敏感腸桿菌目細(xì)菌(carbapenem-sensitiveEnterobacterales，CSE)110株作為對照組(菌株分布與耐藥組大致相同)。114株CRE采集的患者為CRE組，男79名，女35名；平均年齡(70.83±18.29)歲。110株CSE采集的患者為CSE組，男66名，女44名，平均年齡(73.77±17.23)歲。兩組研究對象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 數(shù)據(jù)收集 查閱相關(guān)文獻(xiàn)及資料，結(jié)合患者病歷病程，收集患者以下資料：患者年齡、性別，住院時(shí)間是否大于30天、ICU入住史、7天內(nèi)是否進(jìn)行機(jī)械通氣，基礎(chǔ)疾病情況(肺部疾病、高血壓、糖尿病)，抗生素使用情況(碳青霉烯類、氨基糖苷類、β內(nèi)酰胺類復(fù)合制劑、喹諾酮類)。

1.3 藥敏試驗(yàn) 采用法國梅里埃VITEK-2 COMPACT 全自動微生物鑒定分析儀及配套 GN 鑒定卡、AST-GN13 藥敏卡進(jìn)行鑒定。根據(jù)CLSI M100(2019版)中的藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)，CRE為腸桿菌目細(xì)菌中對厄他培南最小抑菌濃度 MIC≥2 μg/mL、對亞胺培南或美羅培南 MIC≥4 μg/mL的菌株。所有耐藥菌株均通過紙片法進(jìn)行驗(yàn)證，亞胺培南及美羅培南抑菌圈直徑≤19 mm(變形桿菌屬、普羅威登菌、摩根氏菌除亞胺培南外的碳青霉烯類藥物耐藥確認(rèn)為CRE)。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌 ATCC25922、肺炎克雷伯菌 ATCC700603及銅綠假單胞菌 ATCC27853，所有操作嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行。

1.4 耐藥表型分析

1.4.1 mCIM試驗(yàn)與eCIM試驗(yàn) 改良碳青霉烯類失活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)試驗(yàn)：取1 μL接種環(huán)菌于含2 mL TSB肉湯試管中，振蕩混勻后加入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片。乙二胺四乙酸碳青霉烯類失活法(ethylenediaminetetraacetic acid-modified carbapenem inactivation method，eCIM)試驗(yàn)：取1 μL接種環(huán)菌于含2 mL TSB肉湯試管中，振蕩混勻后加入1張含10 μg美羅培南的無菌紙片，加入20 μL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)。兩個實(shí)驗(yàn)的試管均放置于35 ℃孵育(240±15) min。用10 μL接種環(huán)取出美羅培南紙片，貼于已涂布大腸埃希菌ATCC25922懸液的MH平板表面，35 ℃孵育18～24 h，量取抑菌圈直徑。mCIM試驗(yàn)抑菌圈直徑6～15 mm，或抑菌圈直徑16～18 mm但抑菌圈內(nèi)有針尖樣菌落，為mCIM試驗(yàn)陽性結(jié)果；抑菌圈直徑≥19 mm為陰性結(jié)果；抑菌圈直徑16～18 mm，或抑菌圈直徑≥19 mm但抑菌圈內(nèi)有散在菌落為中介結(jié)果。mCIM試驗(yàn)陽性結(jié)果表示菌株產(chǎn)碳青霉烯酶。當(dāng)eCIM 試驗(yàn)與mCIM試驗(yàn)抑菌圈直徑相差≥5 mm時(shí)為陽性結(jié)果，即菌株產(chǎn)金屬碳青霉烯酶；當(dāng)eCIM試驗(yàn)與mCIM試驗(yàn)抑菌圈直徑相差≤4 mm時(shí)為陰性結(jié)果，即菌株產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶，見封三圖1A、圖1B。

1.4.2 酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn) CRE菌株調(diào)0.5麥?zhǔn)蠞岫?，涂布于MH平板上，在平板四角距邊10 mm分別貼上4張亞胺培南紙片，其中1張紙片加0.1 mol/L EDTA 10 μL，其中1張紙片加50 mg/mL 3-氨基苯硼酸6 μL，其中1張紙片同時(shí)加0.1 mol/L EDTA 10 μL和50 mg/mL 3-氨基苯硼酸6 μL，另1張紙片不加試劑。加EDTA/硼酸試劑紙片與不加試劑紙片抑菌圈直徑相差>5 mm，表明分別產(chǎn)金屬酶和絲氨酸酶。若加EDTA/硼酸試劑紙片與不加試劑紙片抑菌圈直徑均>5 mm，表明既產(chǎn)金屬酶又產(chǎn)絲氨酸酶，見封三圖1C、圖1D。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 影響CRE感染的單因素分析 CRE組和CSE組患者住院時(shí)間大于30天、機(jī)械通氣、患有糖尿病、聯(lián)合使用抗生素、使用碳青霉烯類藥物、使用氨基糖苷類藥物、使用β內(nèi)酰胺酶復(fù)合制劑、使用喹諾酮類藥物、入住ICU比例比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 影響CRE感染的單因素分析[n(%)] Table 1 Univariate analysis of CRE infection [n(%)]

2.2 影響CRE感染的Logistic回歸分析 以單因素分析結(jié)果為基礎(chǔ)，P<0.05的因素為自變量，采用Logistic回歸分析對CRE感染的影響因素進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：住院時(shí)間大于30天、患有糖尿病、使用碳青霉烯類藥物、入住ICU、使用β內(nèi)酰胺酶復(fù)合制劑是CRE感染的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，聯(lián)合使用抗生素是CRE感染的保護(hù)因素(P<0.05)，見表2。

表2 影響CRE感染的Logistic回歸分析Table 2 Logistic regression analysis of CRE infection

2.3 耐藥表型分析 mCIM試驗(yàn)與eCIM試驗(yàn)結(jié)果顯示，114株CRE菌株中產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶90株、產(chǎn)金屬碳青霉烯酶24株。酶抑制劑增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，114株CRE菌株中產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶90株、產(chǎn)金屬碳青霉烯酶20株，既產(chǎn)絲氨酸碳青霉烯酶又產(chǎn)金屬碳青霉烯酶4株。

3 討論

文獻(xiàn)[5]報(bào)道，CRE細(xì)菌可在腸道定植并在免疫力低下時(shí)發(fā)病。ICU患者免疫力低下且面臨機(jī)械性操作，若醫(yī)院感染防護(hù)措施不到位則容易導(dǎo)致耐藥菌院內(nèi)感染，危及患者生命。文獻(xiàn)[6]顯示，手術(shù)室、ICU、急診科是CRE感染的重災(zāi)區(qū)。碳青霉烯類藥物可在抗生素壓力下導(dǎo)致細(xì)菌選擇性產(chǎn)生耐藥，易導(dǎo)致CRE菌株的產(chǎn)生。本研究檢出CRE菌株114株，其中肺炎克雷伯菌86株(75.44%)，與秦慧玲等[7]研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，長時(shí)間住院、入住ICU、使用碳青霉烯類藥物、糖尿病會導(dǎo)致患者更容易被CRE感染，這與楊璐等[8]分析的CRE感染的易感因素相符。

目前對CRE敏感的藥物有多黏菌素、替加環(huán)素、磷霉素，但從總體上而言，治療方案有限[9]。頭孢他啶/阿維巴坦對A、C、D類酶有一定的效果，對B類酶無效，因此耐藥表型檢測對臨床用藥具有一定的指導(dǎo)作用[10]。研究[11]表明，mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)、酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)在碳青霉烯酶表型鑒定中有較好的特異性和敏感性。mCIM聯(lián)合eCIM試驗(yàn)的符合率為97.5%，酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)的符合率為96.3%[12]。CRE菌株的產(chǎn)酶情況結(jié)合病情，可以制定更為合理的用藥方案。

綜上所述，長時(shí)間住院、入住ICU、使用碳青霉烯類藥物和β內(nèi)酰胺酶復(fù)合制劑、糖尿病可導(dǎo)致患者更容易被CRE感染；開展耐藥表型分析，可指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物。