星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)對(duì)大鼠急性心肌梗死后炎癥反應(yīng)的影響

徐曈，馮作炫，周凡，朱藝霞，王明虹

（寧德市醫(yī)院麻醉科，福建寧德352100）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是目前臨床上常見的心血管疾病之一，有病情進(jìn)展迅速、患者預(yù)后差、致死率較高的特點(diǎn)。過度炎癥反應(yīng)與AMI 后心肌損傷、心室重構(gòu)等密切相關(guān)[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，AMI 發(fā)生后患者會(huì)出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)和中性粒細(xì)胞浸潤，分泌大量的炎癥因子，導(dǎo)致心肌細(xì)胞進(jìn)一步受損，加重心肌組織損傷，進(jìn)而導(dǎo)致血清心肌損傷標(biāo)志物水平上升[4-5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，星狀神經(jīng)節(jié)阻滯術(shù)（stellate ganglion block, SGB）可抑制心肌梗死后室性心律失常，且對(duì)心肌損傷有一定的保護(hù)作用[6-7]。但SGB 對(duì)心肌梗死后炎癥反應(yīng)的影響尚不清楚，本研究主要探討SGB 對(duì)大鼠AMI 后心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響及對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（上海楓嶺生物技術(shù)有限公司），普通PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司），全自動(dòng)生化分析儀（美國羅氏公司），Trizol（美國Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR 試劑盒（日本TaKaRa 公司），白細(xì)胞介素6（Interleukin-6,IL-6）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β, IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和GAPDH 引物（深圳華大基因科技有限公司），IL-6、IL-1β 及TNFα ELISA 試劑盒（美國Abcam 公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理選取8 周齡雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠60 只[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(閩）2018-003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK(閩）2018-009]，購自于廈門大學(xué)。大鼠體重200～250 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組、AMI 組和SGB 組，每組20 只。飼養(yǎng)條件：在溫度為22℃恒溫，濕度60%，明暗交替各12 h，自由攝食、飲水。大鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后進(jìn)行相應(yīng)處理。假手術(shù)組只打開胸腔暴露心臟，不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈；AMI 組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支并復(fù)制AMI 模型，AMI 模型復(fù)制成功的標(biāo)準(zhǔn)為心電圖至少有2 個(gè)相關(guān)導(dǎo)聯(lián)ST 段抬高>0.2 mV，且可見血管結(jié)扎部位下有局部心肌缺血呈暗紫色；SGB 組在AMI 模型復(fù)制成功后行SGB，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，在動(dòng)脈分叉處的背側(cè)面注射0.2 ml 0.25%羅哌卡因。SGB 成功標(biāo)準(zhǔn)：阻滯側(cè)約10 min 后出現(xiàn)Horner 征。造模后1 周采集各組大鼠心臟組織。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）采用qRT-PCR 檢測各組大鼠心肌組織中炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α mRNA 的水平。稱取大鼠心肌組織50 mg，采用電動(dòng)勻漿器將組織研磨成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清取沉淀。采用TRIzol 法提取心肌組織的總RNA，并將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA 為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系：ddH2O 8.9 μl，正反向游引物各0.8 μl，SYBR Green 12.5 μl，cDNA 2 μl，共25 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，58℃退火30 s，共40 個(gè)循環(huán)。IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA 相對(duì)表達(dá)水平以GAPDH 的表達(dá)水平作為參照，2?△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immuno‐sorbent assay, ELISA）采用ELISA 法檢測各組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 的表達(dá)水平。稱取心肌組織50 mg，采用電動(dòng)勻漿器將組織研磨成單細(xì)胞懸液，離心后棄上清取沉淀。采用超聲波破碎儀破碎心肌細(xì)胞，離心取上清進(jìn)行試驗(yàn)。按試劑盒說明書進(jìn)行ELISA，步驟如下：①按說明書準(zhǔn)備所有試劑、樣品和標(biāo)準(zhǔn)品；②每孔加50 μl 標(biāo)準(zhǔn)品或樣品；③每孔加50 μl Antibody cocktail；④室溫條件下孵育1 h；⑤吸去液體，加350 μl Wash Buffer，重復(fù)3 次；⑥每孔加100 μl TMB Development Solution，室溫條件下孵育10 min；⑦每孔加100 μl Stop Solution，450 nm 處讀取吸光度值，并計(jì)算濃度。

1.2.4 檢測血清中心肌酶含量實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采集大鼠腹主動(dòng)脈血5 ml，3 000 r/min 離心20 min，分離血清，置于4℃冰箱保存，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測大鼠血清中心肌酶[谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）]水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較采用SNK-q 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織中炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

AMI 組、SGB 組、假手術(shù)組IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為（29.66±3.17）、（19.72±8.18）和（1.00±1.00），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=230.500，P=0.000）。AMI 組、SGB 組、假手術(shù)組IL-1β mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為（16.65±2.65）、（11.95±2.84）和（1.00±1.00），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=256.300，P=0.000）。AMI 組、SGB 組、假手術(shù)組TNF-α mRNA 的相對(duì)表達(dá)量分別為（17.99±4.12）、（14.80±1.73）和（1.00±1.00），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=245.600，P=0.000）。SGB 組IL-6、IL-1β 及TNF-α mRNA 的相對(duì)表達(dá)量均較AMI 組降低（P<0.05）。見圖1、2。

圖1 qRT-PCR擴(kuò)增曲線

圖2 qRT-PCR熔解曲線

2.2 各組大鼠血清中炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α表達(dá)水平比較

假手術(shù)組、AMI 組和SGB 組IL-6 表達(dá)水平分別為（22.75±4.10）μg/ml、（53.33±8.95）μg/ml和（42.05±3.16）μg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=134.000，P=0.000）；假手術(shù)組、AMI 組和SGB 組IL-1β 表達(dá)水平分別為（16.09±5.14）μg/ml、（91.30±5.80）μg/ml 和（51.89±4.47）μg/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 060.000，P=0.000）；假手術(shù)組、AMI 組和SGB 組TNF-α 表達(dá)水平分別為（31.33±6.80）ng/ml、（82.44±8.60）ng/ml 和（63.21±6.49）ng/ml，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=246.300，P=0.000）。AMI 組、SGB 組IL-6、IL-1β及TNF-α 表達(dá)水平較假手術(shù)組升高（P<0.05），SGB組IL-6、IL-1β 及TNF-α 表達(dá)水平較AMI 組降低（P<0.05）。

2.3 各組大鼠血清中心肌酶表達(dá)水平比較

假手術(shù)組、AMI 組和SGB 組AST 表達(dá)水平分別為（15.57±6.28）u/L、（75.13±10.51）u/L 和（41.70±9.49）u/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=222.800，P=0.000）；假手術(shù)組、AMI 組和SGB 組LDH 表達(dá)水平分別為（159.96±28.19）u/L、（252.50±34.83）u/L 和（202.87±34.36）u/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=40.350，P=0.000）；假手術(shù)組、AMI 組和SGB 組CK-MB 表達(dá)水平分別為（14.21±6.45）u/L、（77.0.3±7.80）u/L 和（45.44±7.78）u/L，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=363.200，P=0.000）。AMI 組、SGB 組AST、LDH 及CK-MB 表達(dá)水平較假手術(shù)組升高（P<0.05），SGB 組AST、LDH 和CK-MB表達(dá)水平較AMI 組降低（P<0.05）。

3 討論

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年約1 200 萬人死于心腦血管疾病，其中AMI 是主要原因之一[8-9]。所謂AMI 是指由于冠狀動(dòng)脈阻塞導(dǎo)致心肌持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。AMI 后機(jī)體的促炎作用可使機(jī)體炎性介質(zhì)增加，促進(jìn)心肌炎癥細(xì)胞浸潤，使梗死的心肌組織釋放溶酶體酶和氧化應(yīng)激物質(zhì)[10-12]。此外，AMI 后由于左心室節(jié)段性收縮和舒張功能降低，機(jī)體啟動(dòng)代償機(jī)制來緩解心肌細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞反應(yīng)性伸長，梗死區(qū)室壁變薄，最終影響心臟血流動(dòng)力學(xué)和心臟功能的降低[13-14]。因此，炎癥反應(yīng)在AMI 患者的預(yù)后中發(fā)揮著舉足輕重的作用。IL-6、IL-1β 及TNF-α 是機(jī)體炎癥反應(yīng)過程中重要的調(diào)節(jié)因子，能夠通過激活中性粒細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-1β 及TNF-α 參與炎癥性免疫細(xì)胞介導(dǎo)的心肌損傷過程，且AMI 患者血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 水平顯著上升[15-16]。本研究結(jié)果顯示，AMI 組大鼠心肌組織和血清IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量均明顯高于假手術(shù)組，與以往報(bào)道一致。

心外膜密集分布于冠狀動(dòng)脈和冠狀小動(dòng)脈上交感神經(jīng)，交感神經(jīng)的功能狀態(tài)與心肌梗死、心絞痛及嚴(yán)重的心率失常密切相關(guān)[17-18]。交感神經(jīng)過度興奮可使正常或者已發(fā)生病變的冠狀動(dòng)脈收縮進(jìn)而引起心肌缺血性疼痛，甚至心肌梗死，且心肌缺血的痛覺傳入神經(jīng)就是交感神經(jīng)。星狀神經(jīng)節(jié)是頸部交感神經(jīng)節(jié)之一，由頸下神經(jīng)節(jié)與第1 胸交感神經(jīng)節(jié)融合而構(gòu)成，星狀神經(jīng)節(jié)發(fā)出的心下神經(jīng)沿鎖骨下動(dòng)脈后方，氣管的前方下降，加入心叢而參與心臟的活動(dòng)。而SGB 是指通過阻滯交感神經(jīng)的活性，達(dá)到緩解疼痛，較少心肌做功，降低心肌耗氧，擴(kuò)張收縮的冠狀動(dòng)脈，改善心肌血流分布，抑制機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，從而減少應(yīng)激激素的釋放，最終阻斷疼痛引起的惡性循環(huán)[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，頭面部及上胸部帶狀皰疹行SGB 可阻斷疼痛的傳導(dǎo)，改善血行，增強(qiáng)防御能力，有抗炎作用，且能縮短病程[20-21]。但SGB 在AMI 中是否有抗炎作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，SGB 組大鼠心肌組織和血清炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 含量均低于AMI 組，且SGB 組大鼠血清中心肌酶AST、LDH 和CK-MB 含量也低于AMI 組，提示SGB 可能通過抑制炎癥反應(yīng)減少心肌細(xì)胞的損傷，但具體機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究。