氯化鈉貯存大鼠皮膚抗原性的表達(dá)及活力研究

劉軍，王濤濤，侯明奎

（甘肅省人民醫(yī)院燒傷科，甘肅蘭州730000）

異體皮移植一直是搶救大面積燒傷患者的重要手段，但因其抗原性導(dǎo)致的免疫排斥反應(yīng)，只能用作暫時(shí)性創(chuàng)面覆蓋物。為此，許多學(xué)者不斷尋找降低異體皮抗原性的方法，以增加或延長(zhǎng)異體皮創(chuàng)面存活時(shí)間，為大面積燒傷患者的救治贏得更多機(jī)會(huì)。

低溫保存異體皮已成為燒傷外科對(duì)異體皮貯存常用方法。既往研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理的異體皮移植成活時(shí)間明顯長(zhǎng)于新鮮異體皮，但要求貯存的條件及成本較高[1]。2004年波蘭學(xué)者OLSZEWSKI等[2]首先將人體皮膚用氯化鈉處理后成功移植于裸鼠體表，在移植成功后的第3～4 周對(duì)裸鼠進(jìn)行組織學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)移植的人體皮膚可長(zhǎng)期存在于裸鼠體表而不被裸鼠皮膚取代。筆者也采用氯化鈉貯存異體皮并進(jìn)行臨床小型創(chuàng)面的成功移植及修復(fù)，收到了與低溫保存異體皮進(jìn)行移植的相似效果[3]。

人表皮所攜帶的HLA-DR 抗原及鼠類動(dòng)物表皮存在的MHC-DR 抗原均為重要的移植抗原，在激發(fā)同種皮膚移植發(fā)生免疫排斥反應(yīng)方面起著關(guān)鍵作用[4]。調(diào)控免疫反應(yīng)的Ir基因亦位于MHC－D區(qū)，所以Ⅱ類抗原的基因亦具有相同的功能，可調(diào)控免疫反應(yīng)的幅度[5-7]。其免疫病理現(xiàn)象是移植排斥反應(yīng)、對(duì)疾病的反應(yīng)過(guò)度或反應(yīng)不足。臨床最常見的急性排斥反應(yīng)主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，皮膚移植排斥反應(yīng)也主要是細(xì)胞免疫反應(yīng)，此過(guò)程需要第一信號(hào)分子與第二信號(hào)協(xié)同刺激分子共同完成[8-10]。

為研究不同貯存條件下皮膚的抗原性，筆者以大鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，選擇第一信號(hào)分子MHC-DR和第二信號(hào)協(xié)同刺激分子CD86 通過(guò)免疫組織化學(xué)染色對(duì)其抗原性進(jìn)行對(duì)比，通過(guò)熒光染色法對(duì)大鼠皮膚活力進(jìn)行對(duì)比，為氯化鈉替代液氮冷凍方法處理異體皮降低皮膚抗原性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SPF 級(jí)SD 大鼠30 只[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（甘）2011-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（甘）2013-0002]，體重（206±18）g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑及儀器

氯化鈉（純度99%）購(gòu)自江蘇鹽城制藥廠，MHC-DR 單克隆抗體、CD86 單克隆抗體、免疫組織化學(xué)SP 試劑盒購(gòu)自福州邁新生物工程公司，SYTO 13 核酸染料、GoldViewI 核酸染料購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。

TP1020 脫水機(jī)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司，YABO BMJ-400 組織包埋機(jī)購(gòu)自常州中威電子有限公司，MICROM 315 切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)萊卡公司，YABO 200 漂烘片機(jī)購(gòu)自常州中威電子有限公司，BX51顯微鏡、BX53 熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.3 動(dòng)物分組及模型復(fù)制

將健康雄性SPF 級(jí)SD 大鼠隨機(jī)分為氯化鈉制備組、液氮制備組和新鮮皮膚組，每組10 只。

氯化鈉制備組：在大鼠背側(cè)脊柱旁設(shè)計(jì)一2 cm×3 cm 矩形創(chuàng)面進(jìn)行脫毛，長(zhǎng)軸與脊柱平行。在局部麻醉下注射體積分?jǐn)?shù)1%普魯卡因，在脫毛區(qū)域中間切取1 cm×1 cm 大小全層皮膚，生理鹽水漂洗后直接置入氯化鈉（純度99%）中貯存，室溫貯存時(shí)間3 個(gè)月。液氮制備組：其他同氯化鈉制備組，切取皮膚經(jīng)抗凍液處理后置于液氮中貯存3 個(gè)月。新鮮皮膚組：在3 個(gè)月時(shí)，同上述方法切取大鼠皮膚，各組分別進(jìn)行MHC-DR、CD86 檢測(cè)及組織活力檢測(cè)[11-14]。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

氯化鈉制備組和液氮制備組組織塊進(jìn)行復(fù)蘇后與新鮮皮膚組組織塊用10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片。按免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行MHC-DR、CD86 檢測(cè)，其中一抗1∶100 稀釋，另用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline, PBS）代替一抗作作為陰性對(duì)照。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：以胞膜或/和胞漿著棕色作為陽(yáng)性染色。高倍鏡下（400 倍）隨機(jī)選取5 個(gè)視野，根據(jù)著色程度和陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行評(píng)分。每份標(biāo)本進(jìn)行3 次檢測(cè)，計(jì)算均值。著色程度評(píng)分：無(wú)色計(jì)0 分，黃色計(jì)1 分，棕色計(jì)2 分，深棕色計(jì)3 分；陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)分：<10%計(jì)0 分，10%～< 30%計(jì)1 分，30%～< 50%計(jì)2 分，≥50%計(jì)3 分。兩者之和作為大鼠評(píng)分[15-16]。

1.5 組織活力檢測(cè)

采用SYTO/EB 活力測(cè)定法檢測(cè)，氯化鈉制備組和液氮制備組組織塊進(jìn)行復(fù)蘇后與新鮮皮膚組組織塊進(jìn)行冷凍切片，撈片后PBS洗3次，3 min/次，滴加SYTO 13 工作液50 μl（1 μmol/L），37℃避光孵育20 min，PBS 洗3 次，3 min/次。滴加GoldViewI工作液50 μl（1 μg/ml）在冰浴中避光30 min，PBS洗3 次，3 min/次。在488 nm/ 520 nm 激發(fā)，熒光顯微鏡觀察?；罴?xì)胞發(fā)綠色熒光，死細(xì)胞發(fā)紅色熒光。記數(shù)后計(jì)算出組織細(xì)胞活力程度[17-20]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組皮膚MHC-DR、CD86抗原表達(dá)水平比較

各組MHC-DR、CD86 抗原表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），液氮制備組與氯化鈉制備組MHC-DR 抗原表達(dá)水平處于中等水平，且氯化鈉制備組較液氮制備組低（P>0.05），新鮮皮膚組MHC-DR 抗原表達(dá)水平處于高水平表達(dá)，且較液氮制備組與氯化鈉制備組高（P<0.05），氯化鈉制備組與液氮制備組CD86 抗原表達(dá)水平均處于低水平表達(dá)，且氯化鈉制備組較液氮制備組低（P>0.05），新鮮皮膚組CD86 抗原表達(dá)水平處于高水平表達(dá)，且較液氮制備組與氯化鈉制備組高（P<0.05）。見表1和圖1～3。

表1 各組皮膚的MHC-DR、CD86CD86抗原表達(dá)水平比較 （n=10，±s）

表1 各組皮膚的MHC-DR、CD86CD86抗原表達(dá)水平比較 （n=10，±s）

組別液氮制備組氯化鈉制備組新鮮皮膚組F 值P 值CD86 2.47±0.71 2.26±0.49 4.41±0.55 36.668 0.000 MHC-DR 2.71±0.44 2.58±0.56 4.70±0.40 62.834 0.000

圖1 CD86免疫組織化學(xué)染色 （×400）

圖2 MHC-DR免疫組織化學(xué)染色 （×400）

圖3 SYTO/EB熒光染色 （×400）

2.2 各組皮膚活力值比較

液氮制備組、氯化鈉制備組和新鮮皮膚組的皮膚活力值分別為（67.2±5.5）%、（65.4±3.2）%和（95.4±4.5）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=98.361，P=0.000），液氮制備組與氯化鈉制備組在3 個(gè)月時(shí)其組織活力均超過(guò)半數(shù)，但兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），新鮮皮膚組較液氮制備組與氯化鈉制備組高（P<0.05）。

3 討論

異體皮在大面積燒傷患者的救治中及小面積創(chuàng)面治療中均起重要作用[20-23]，但異體皮的最佳貯存方式一直是使用液氮冷凍貯存，既往有研究顯示，經(jīng)過(guò)液氮貯存異體皮的組織活力較高[24]。且經(jīng)過(guò)此方式處理的異體皮的抗原性明顯減弱，有助于延長(zhǎng)異體皮移植后的存活時(shí)間[25]，從而更好地起到對(duì)創(chuàng)面覆蓋與修復(fù)作用。眾所周知，液氮貯存異體皮臨床應(yīng)用成本較高，且過(guò)程相對(duì)繁瑣，因此，筆者選用氯化鈉貯存異種皮與液氮貯存異種皮進(jìn)行抗原性及組織活力的對(duì)比研究，希望能尋找一種新的、簡(jiǎn)便易行的皮膚貯存方式，又能使保存的皮膚起到與液氮貯存的皮膚相似的作用，此項(xiàng)研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

本研究中通過(guò)免疫組織化學(xué)法對(duì)氯化鈉貯存異種皮、液氮貯存異種皮及新鮮異種皮抗原性進(jìn)行檢測(cè)，新鮮異種皮MHC-DR、CD86 抗原表達(dá)最強(qiáng)，且與前兩種貯存方式的異種皮在MHC-DR、CD86 抗原表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著差異，從而也證實(shí)了既往研究中發(fā)現(xiàn)低溫處理的異體皮移植成活時(shí)間明顯長(zhǎng)于新鮮異體皮的觀點(diǎn)。同時(shí)本研究中，氯化鈉與液氮貯存異種皮MHC-DR、CD86 抗原表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異，兩種不同的異種皮貯存方式均可以減弱皮片的抗原性，是否有利于延長(zhǎng)異體皮移植后皮片的存活時(shí)間還需要進(jìn)一步臨床研究。本研究中應(yīng)用熒光染色法對(duì)氯化鈉、液氮貯存異種皮及新鮮異種皮的組織活力進(jìn)行檢測(cè)，新鮮異種皮的組織活力最高。氯化鈉和液氮貯存異種皮的組織活力較低，與新鮮異種皮的組織活力有顯著差異，但氯化鈉和液氮貯存異種皮的組織活力相近，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異。

綜上所述，氯化鈉貯存異種皮簡(jiǎn)便、易行，可成為替代液氮貯存異種皮的一種新方法。今后研究中，筆者將進(jìn)一步改進(jìn)方法，進(jìn)行氯化鈉處理異體皮的臨床研究，進(jìn)一步降低異體皮的抗原性，更好地服務(wù)于臨床。