維生素D受體基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折易感性的關(guān)系

鄭峰，王福榮，許喆

（青海省人民醫(yī)院骨科，青海西寧810007）

骨質(zhì)疏松是老年女性常見的骨骼系統(tǒng)疾病，我國女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患病率為34.25%～39.20%[1-2]。骨質(zhì)疏松容易導(dǎo)致骨折，使患者生活質(zhì)量下降[3]。絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，包括年齡、遺傳、活動(dòng)減少、營養(yǎng)失衡、維生素D 缺乏、吸煙、飲酒等[4]。維生素D是人類機(jī)體不可或缺的營養(yǎng)物質(zhì)，主要通過作用于維生素D 受體（vitamin D receptor, VDR）發(fā)揮調(diào)控體內(nèi)鈣、磷代謝的作用，與骨密度的變化密切相關(guān)[5]。近年來，VDR基因多態(tài)性對骨密度的影響倍受關(guān)注，研究證實(shí)VDR基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松的發(fā)生以及抗骨質(zhì)疏松治療反應(yīng)性均有關(guān)[6-7]，且VDR基因多態(tài)性存在明顯的種族差異[8]。青海地區(qū)藏族女性生活在青藏高原中高海拔地區(qū)，與其他民族地理環(huán)境、生活習(xí)性、飲食習(xí)慣等均不相同，其VDR基因多態(tài)性是否與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折易感的相關(guān)性尚不清楚。鑒于此，本研究擬探討VDR基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折易感的相關(guān)性，并找出相關(guān)的VDR基因位點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月—2020年6月青海省人民醫(yī)院收治的205 例藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折患者作為觀察組。其中，年齡63～75 歲，平均（67.92±4.21）歲；閉經(jīng)6～15年，平均（9.11±3.51）年；居住地：牧區(qū)83例，城鎮(zhèn)122例；吸煙85例；飲酒112例；運(yùn)動(dòng)水平：經(jīng)常運(yùn)動(dòng)80 例、缺乏運(yùn)動(dòng)125 例；攝入足夠鈣制品75 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)X 射線片或CT確診骨折；②T 值≤-2.5 或T 值> -2.5～< -1.0 但發(fā)生脆性骨折，符合2017 版《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診療指南》[9]中骨質(zhì)疏松的標(biāo)準(zhǔn)；③青海地區(qū)常駐居民，無外地長期旅居史；④藏族絕經(jīng)女性。排除標(biāo)準(zhǔn)：①交通事故、高空墜落、撞擊等暴力因素引起的骨折；②骨密度正常，T 值≥-1.0；③既往確診有小兒佝僂病、乙型肝炎病毒感染、結(jié)直腸癌；④漢族絕經(jīng)女性。另選取同期于本院體檢的209 例藏族絕經(jīng)后無骨質(zhì)疏松女性作為對照組。對照組排除骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕或類風(fēng)濕疾病、骨腫瘤、骨結(jié)核等疾病。其中，年齡60～73 歲，平均（67.69±4.01）歲，停經(jīng)5～14年，平均（9.06±3.35）年；居住地：牧區(qū)80 例，城鎮(zhèn)129 例；吸煙42 例；飲酒107 例；運(yùn)動(dòng)水平：經(jīng)常運(yùn)動(dòng)146 例、缺乏運(yùn)動(dòng)63 例；攝入足夠鈣制品141 例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

研究對象入組后均采集外周靜脈血3 ml，應(yīng)用Biomek NXP 核酸提取儀（美國貝克曼庫爾特公司）及配套試劑提取DNA，選擇吸光度（A260 nm/A280 nm）值在1.6～1.8，濃度> 50 ng/μl 的DNA 樣品待檢。Phusion?kit（美國Thermo 公司）擴(kuò)增VDR基因，特異性正反向引物設(shè)計(jì)由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。Fok I位點(diǎn)正向引物：5'-GCCAGCTATGTAGG GCGAATC-3'，反向引物：5'-AAGTGAAAGCCAGTGGC TCG-3'，長度36 bp。Bsm Ⅰ位點(diǎn)正向引物：5'-CCCTCACTGCCCTTAGCTC-3'，反向引物 ：5'-GCTGAGCTCCCTGGTGGT-3'，長度24 bp。ApaⅠ位點(diǎn)正向引物：5'-CAGAGCATGGACAGGGAGCAA-3'，反向引物：5'-GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC-3'，長度30 bp。TaqⅠ位點(diǎn)正向引物：5'-GGTGGGATTGAGC AGTGAG-3'，反向引物：5'-CTTCTGGATCATCTTGGCA TA-3'，長度20 bp。反應(yīng)體系25 μl，含有60 ng 的DNA，正反向引物各1 μl，dNTPs（2 mmol/L）2.5 μl，加ddH2O 至25 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸5 min。1.2%瓊脂糖凝膠對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物（10 μl）電泳30 min，溴化乙錠染色，采用FR-250 電泳儀（上海復(fù)日公司）分析掃描。SNaPshot 技術(shù)（美國應(yīng)用生物公司）進(jìn)行VDRBsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性測定。

1.3 骨密度檢測

Prodigy 雙能X 射線骨密度儀（美國GE 公司）測定兩組腰椎（L2～L4前后位腰椎均值）、股骨頸、全髖的骨密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SHEsis 和SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比表示，比較用χ2檢驗(yàn)。影響因素的分析用Logistic 回歸模型。SHEsis 軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，P>0.05 為符合遺傳平衡吻合度。相關(guān)性分析用Spearman 法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組VDR基因多態(tài)性比較

兩組VDRBsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（觀察組P=0.619、0.705、0.802 和0.902；對照組P=0.768、0.892、0682 和0.781），具有群體代表性，可進(jìn)行遺傳學(xué)分析。兩組BsmⅠ和FokⅠ位點(diǎn)基因型、等位基因分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），兩組ApaⅠ和TaqⅠ位點(diǎn)基因型、等位基因分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見表1）。Bsml 位點(diǎn)bb 基因型[=1.924（95% CI：1.735，2.203）]、Bb 基因型[=1.739（95% CI：1.602，1.867）]骨質(zhì)疏松骨折患病風(fēng)險(xiǎn)度較BB 基因型明顯增加，b 等位基因[=2.521（95% CI：2.203，2.863）]骨質(zhì)疏松骨折患病風(fēng)險(xiǎn)度較B等位基因明顯增加。FokⅠ位點(diǎn)ff 基因型[=1.903（95% CI：1.721，2.163）]、Ff 基因型[=1.541（95% CI：1.409，1.720）]骨質(zhì)疏松骨折患病風(fēng)險(xiǎn)度較FF 基因明顯增加，f 等位基因[=2.021（95% CI：1.813，2.363）]骨質(zhì)疏松骨折患病風(fēng)險(xiǎn)度較F等位基因明顯增加。

表1 兩組VDR基因多態(tài)性比較 例（%）

2.2 觀察組VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)不同基因型患者骨密度值比較

觀察組VDRBsml、FokⅠ位點(diǎn)不同基因型患者腰椎、股骨頸、全髖骨密度值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)不同基因型之間腰椎、股骨頸、全髖骨密度值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。VDRBsmⅠ位點(diǎn)BB 和Bb 基因型、FokⅠ位點(diǎn)FF 和Ff 基因型腰椎、股骨頸、全髖骨密度值大于bb 基因型和ff 基因型（P<0.05），VDR Bsml 位點(diǎn)BB 基因型與bb 基因型，F(xiàn)okⅠ位點(diǎn)FF 基因型與Ff 基因型之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 觀察組VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)不同基因型患者骨密度值比較 （g/cm2，±s）

表2 觀察組VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)不同基因型患者骨密度值比較 （g/cm2，±s）

注：?與bb基因型、ff基因型比較，P<0.05。

基因型BsmⅠBB Bb bb F 值P 值FokⅠFF Ff ff F 值P 值A(chǔ)paⅠAA Aa aa F 值P 值TaqⅠTT Tt tt F 值P 值n 腰椎股骨頸全髖10 11 184 0.45±0.08?0.42±0.07?0.36±0.05 19.468 0.000 0.63±0.12?0.61±0.11?0.50±0.07 23.889 0.000 0.92±0.15?0.90±0.13?0.82±0.10 7.027 0.001 20 79 106 0.41±0.08 0.42±0.06?0.32±0.05?74.892 0.000 0.55±0.11 0.56±0.10?0.47±0.06?28.951 0.000 0.89±0.15 0.88±0.13?0.78±0.10?19.306 0.000 61 110 34 0.38±0.12 0.36±0.13 0.36±0.10 0.570 0.566 0.53±0.10 0.50±0.13 0.52±0.12 1.308 0.273 0.84±0.14 0.82±0.15 0.84±0.13 0.492 0.612 0.85±0.12 0.81±0.15 0.85±0.13 2.162 0.118 71 106 28 0.38±0.10 0.36±0.12 0.37±0.11 0.680 0.508 0.52±0.11 0.50±0.13 0.54±0.10 1.458 0.235

2.3 VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)基因型與骨密度值相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)性分析顯示，VDRBsmⅠ基因型、FokⅠ基因型與腰椎、股骨頸、全髖骨密度值呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），ApaⅠ基因型、TaqⅠ基因型與腰椎、股骨頸、全髖骨密度值無相關(guān)性（P>0.05）。見表3。

表3 VDR BsmⅠ、FokⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)基因型與骨密度值相關(guān)系數(shù)

2.4 影響青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折的Logistic回歸分析

以是否患有骨質(zhì)疏松性骨折作為因變量（0 =否，1=是），以居住地（0=城鎮(zhèn)，1=牧區(qū)）、吸煙（0=否，1 =是）、飲酒（0 =否，1 =是）、運(yùn)動(dòng)水平（0 =經(jīng)常運(yùn)動(dòng)、1=缺乏運(yùn)動(dòng)）、飲食習(xí)慣（0=攝入足夠鈣制品，1 =未攝入足夠鈣制品）、BsmⅠ位點(diǎn)多態(tài)性[0 =野生型（BB 基因型），1 =突變型（Bb+bb 基因型）]、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性[0 =野生型（FF 基因型），1=突變型（FF+Ff 基因型基因型）]、ApaⅠ位點(diǎn)多態(tài)性[0 =野生型（AA 基因型），1=突變型（Aa+aa）]、TaqⅠ位點(diǎn)多態(tài)性[0 =野生型（TT 基因型），1 =突變型（Tt+tt基因型）]作為自變量，進(jìn)行單因素Logistic 回歸分析。連續(xù)性變量直接代入方程未賦值，逐步法篩選變量（進(jìn)入水準(zhǔn)為0.05，排除水準(zhǔn)為0.10）。結(jié)果顯示：吸煙、運(yùn)動(dòng)水平、飲食習(xí)慣、BsmⅠ位點(diǎn)多態(tài)性、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性是青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折的危險(xiǎn)因素（P<0.05）（見表4）。多因素Logistic 回歸結(jié)果顯示：未攝入足夠鈣制品[=1.223（95% CI：1.021，1.464）]、Bsml 位點(diǎn)多態(tài)性[=1.603（95% CI：1.870，1.997）]、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性[=11.886（95% CI：1.169，1.764）]是青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表5。

表4 青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折易感的單因素Logistic回歸分析參數(shù)

表5 青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折易感的多因素Logistic回歸分析參數(shù)

3 討論

女性絕經(jīng)后卵巢功能衰竭，雌激素分泌量急劇下降，雌激素抑制破骨細(xì)胞的作用減弱，導(dǎo)致破骨細(xì)胞增殖，骨生成細(xì)胞凋亡，骨重建障礙，最終引起骨吸收增加，骨量流失，骨微結(jié)構(gòu)改變，發(fā)生骨質(zhì)疏松[10]。骨質(zhì)疏松性骨折是導(dǎo)致老年女性殘疾和死亡的主要原因，對高危人群進(jìn)行識(shí)別具有重要臨床意義。維生素D 是維持機(jī)體正常骨代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，VDR是維生素D 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子，位于12q13.1，長度> 100 kB，VDR基因在調(diào)節(jié)骨代謝和骨穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。1996年BERG 等[11]首次報(bào)道VDRBsml 多態(tài)性與絕經(jīng)后女性骨礦物質(zhì)密度有關(guān)。自此以后VDR多態(tài)性廣受關(guān)注，被視為探索導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥遺傳因素的重要候選基因之一[12]。VDR基因多態(tài)性對應(yīng)多個(gè)酶切位點(diǎn)，不同位點(diǎn)多態(tài)性對VDR 基因表達(dá)影響不同，目前研究較多的VDR位點(diǎn)是BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點(diǎn)[13]。

Bsml 是VDR 基因多態(tài)性最重要的亞型之一，其多態(tài)性位于3'-非翻譯區(qū)，參與調(diào)節(jié)VDRmRNA的穩(wěn)定性，目前關(guān)于VDR Bsml 位點(diǎn)多態(tài)性和骨質(zhì)疏松癥易感性的研究多種多樣，但結(jié)果不一致[14]。張華等[15]指出廣東省中山地區(qū)絕經(jīng)后女性的VDR基因型與骨密度之間存在顯著相關(guān)性，其中bb 基因型的骨密度最低，但Bsml 多態(tài)性與泰國絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)生無明顯關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)VDRBsmⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折易感有關(guān)，bb 是易感基因型。分析原因?yàn)閂DRBsmⅠ位點(diǎn)基因突變可能影響VDR骨代謝調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致骨量的丟失。FokⅠ位于VDR的5'-端啟動(dòng)區(qū)域第二個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，當(dāng)T→C 轉(zhuǎn)變時(shí)可引起f 型VDR轉(zhuǎn)變?yōu)镕 型VDR，由于F 位點(diǎn)所表達(dá)的VDR長度短于f 位點(diǎn)，因此其親和力、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運(yùn)活力更強(qiáng)，更能促使胃腸道對鈣的吸收，增加骨密度[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組VDRFokⅠ位點(diǎn)ff 基因型頻率高于對照組，ff 基因型骨密度低于對照組，回歸分析證實(shí)VDRFokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折易感有關(guān)。TECHAPATIPHANDEE 等[16]發(fā)現(xiàn)FokⅠ位點(diǎn)基因多態(tài)性是泰國絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松的易感因素。吳昌新等[18]發(fā)現(xiàn)VDRFokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與黎族老年骨質(zhì)疏松的易感有關(guān)，F(xiàn)f 基因型骨質(zhì)疏松風(fēng)險(xiǎn)是FF基因者的1.13 倍，ff 基因型是FF 基因型的1.64 倍。分析VDRFokⅠ位點(diǎn)基因多態(tài)性可能通過影響維生素D 和鈣的吸收引起骨質(zhì)疏松。

ApaⅠ位于VDR第8 個(gè)內(nèi)含子，ApaⅠ位點(diǎn)多態(tài)性不影響VDR的氨基酸序列，但影響VDRmRNA 穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯，與腸道鈣吸收受損有關(guān)[19]。本研究結(jié)果表明，VDRApaⅠ位點(diǎn)基因多態(tài)性與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折無關(guān)，ApaⅠ位點(diǎn)基因型與骨密度無明顯關(guān)聯(lián)性。秦躍娟等[20]研究結(jié)果顯示上海市女性BMD 值變異無關(guān)聯(lián)。分析原因可能為VDRApaⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與雌激素受體介導(dǎo)的成骨細(xì)胞骨代謝無關(guān)[21]。本研究也尚未觀察到VDRTaqⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折的相關(guān)性。一項(xiàng)薈萃分析報(bào)道也指出TaqⅠ位點(diǎn)基因型分布，等位基因分布與椎體骨折無明顯相關(guān)性[22]。

綜上所述，VDRBsmⅠ、FokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性可能與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折易感有關(guān)，BsmⅠ位點(diǎn)bb 和FokⅠ位點(diǎn)ff 是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折易感基因型。ApaⅠ、TaqⅠ位點(diǎn)多態(tài)性與青海地區(qū)藏族絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松性骨折無明顯關(guān)聯(lián)。本研究局限之處在于樣本例數(shù)偏少，在以后研究中將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本范圍和例數(shù)。