天香丹對內皮細胞氧化損傷及抗氧化因子和eNOS水平的影響①

辛錦鈺，張亞潔，古麗葛娜·薩吾爾，何 歡，任 珊，安冬青

（新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院；新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，烏魯木齊 830011）

冠脈微循環(huán)是由前小動脈、微動脈、微靜脈和毛細血管組成的循環(huán)網絡結構，擔負調控心肌血流量和外周血管阻力的重要作用，生理狀態(tài)下，可通過調節(jié)血管舒縮、內在肌源性反應和物質代謝等來保證局部血流與組織代謝供需相匹配[1]，當其結構或功能發(fā)生障礙時，血流阻力增加，冠脈血流儲備下降，積累日久可損害心肌灌注，致使心肌纖維化甚或心肌壞死[2-3]，這一病理過程即為冠脈微循環(huán)功能障礙（coronary microcirculation dysfunction，CMD）。研究顯示，CMD是冠心病患者發(fā)生心肌缺血的重要原因，在沒有明顯心外膜冠狀動脈阻塞情況下，它可導致50%的慢性冠狀動脈綜合征患者心肌缺血情況加劇[4]，同時它也與不良心血管事件的發(fā)生密切相關[5-6]。內皮功能障礙是CMD發(fā)生發(fā)展的重要病理機制，而氧化應激是內皮功能障礙形成的主要影響因素。在氧化應激狀態(tài)下，氧自由基產生增加，觸發(fā)線粒體功能障礙、鈣超載、DNA損傷和心肌膜脂質過氧化，最終可導致細胞死亡[7]。大量研究證實，中醫(yī)藥在改善患者微循環(huán)功能，提高患者生活質量方面具有獨特優(yōu)勢[8-9]，用于CMD治療具有良好發(fā)展前景。天香丹是新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院的院內制劑，多年來一直應用于冠心病及心肌缺血綜合征的臨床治療，療效確切[10-11]。該方由紅景天、丹參、降香和新塔花組成，方中紅景天為君，丹參為臣，兩藥合用，氣血互生，降香與新塔花性味辛香，中醫(yī)理論中辛香類藥材可走竄通絡，達到開痹止痛的作用。既往研究顯示，紅景天苷具有抗氧化、抗缺氧等藥理作用[12]，丹參多酚鹽可抑制ROS的產生[13]，降香與新塔花也皆具有抗氧化應激，保護血管內皮的作用[14-15]。本課題組前期研究已表明，天香丹可有效改善CMD動物的心肌損傷[16]。本研究采用叔丁基過氧化氫（tert-butyl hydroperoxide，tBHP）誘導制備人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）氧化損傷模型，探究其對CMD的相關作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥天香丹顆粒（新疆華世丹藥業(yè)有限公司，批號：Z20200820），維生素C（北京索萊寶科技有限公司，批號：A8100），內皮細胞培養(yǎng)基（美國ScienCell公司，批號：1001），胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號：25200-056），青霉素-鏈霉素（美國Gibco公司，批號分別為：25200-056），PBS（美國Hyclone公司，批號：SH30256.01），四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索萊寶科技有限公司，批號：M8180），二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號：D8370），超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A001-3-2），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A020-2），微量還原型谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A006-2-1），人8羥基脫氧鳥苷Elisa試劑盒試劑盒（上海江萊生物有限公司，批號：JL11850），人內皮型一氧化氮合酶Elisa試劑盒（上海江萊生物有限公司，批號：JL11316）。

1.2 儀器MSC-Advantage生物安全柜，Multiskan GO多功能酶標儀（美國Thermo公司），Sigma3-30K低溫高速離心機（美國Sigma公司）。

1.3 細胞株人臍靜脈血管內皮細胞（HUVECs，購于上海賽百慷生物技術股份有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 HUVECs的培養(yǎng)方法 用含有10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素）和1%內皮細胞生長因子的內皮細胞培養(yǎng)液，在37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞，每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期的活躍細胞進行實驗。

1.4.2 tBHP對HUVECs存活率的影響 當培養(yǎng)瓶中HUVECs密度達到80%～90%時，用胰蛋白酶進行消化，1 000 r/min離心5 min得到細胞沉淀。用內皮細胞培養(yǎng)液重懸細胞，接種于96孔板中，使每孔細胞數(shù)為1.5×104個，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁完全且密度達到80%～90%后棄去舊培養(yǎng)液。將細胞分為調零組、對照組、tBHP組 60 μmol/L 、tBHP組 120 μmol/L 、tBHP組180 μmol/L 和tBHP組240 μmol/L ，每組4個復孔，除調零組（不含細胞）和對照組（含細胞）加200 μL無血清培養(yǎng)液外，其他各組分別加入等體積含對應不同濃度tBHP的無血清培養(yǎng)液。將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，隨后各孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入150 μL DMSO溶液，使藍紫色甲臜充分溶解，酶標儀492 nm波長處測各孔吸光度A值，計算各組細胞存活率，實驗重復3次，細胞存活率/%=[（A實驗組-A調零組）/（A對照組-A調零組）]×100%。

1.4.3 天香丹對HUVECs活性的影響 培養(yǎng)瓶中HUVECs密度達到80%～90%時，用胰蛋白酶進行消化，1 000 r/min離心5 min得到細胞沉淀。內皮培養(yǎng)液重懸細胞后，按每孔1.5×104個將細胞均勻接種于96孔板中，待細胞貼壁完全且密度達到80%～90%后棄去舊培養(yǎng)液，并將細胞分為6組（調零組、對照組、天香丹30、60、90、120 μg/mL濃度組），每組4個復孔，調零組不含細胞只加200 μL無血清培養(yǎng)液，對照組含細胞并加等體積無血清培養(yǎng)液，其余各組分別加入等體積含對應不同濃度天香丹的無血清培養(yǎng)液。將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育24 h，按“1.4.2”項下MTT法檢測各組細胞活性，每組重復3次，細胞活性/%=[（A實驗組-A調零組）/（A對照組-A調零組）]×100%。

1.4.4 天香丹對tBHP誘導的HUVECs存活率的影響當培養(yǎng)瓶中HUVECs長至80%～90%時，用胰蛋白酶進行消化、離心，重懸細胞沉淀，按每孔1.5×104個將細胞均勻接種于96孔板中，待細胞密度達到80%～90%后棄去舊培養(yǎng)液，將細胞分為調零組、對照組、模型組、維生素C組（50 μg/mL）和低、中、高（30、60、90 μg/mL）劑量天香丹組，其中調零組、對照組、模型加入200 μL無血清培養(yǎng)液，維生素C組和天香丹低、中、高劑量組分別加入等體積含對應不同濃度藥物的無血清培養(yǎng)液，預處理12 h后棄去培養(yǎng)液，加入240 μmol/L tBHP作用24 h。按“1.4.2”項下MTT法檢測各組細胞存活率，每組重復3次。細胞存活率/%=[（A實驗組-A調零組）/（A對照組-A調零組）]×100%。

1.4.5 HUVECs中LDH、SOD、GSH含量的測定 按每孔3×105個的密度將HUVECs均勻接種于96孔板中，待細胞密度達到80%～90%時按“1.4.4”項下方法處理細胞，tBHP誘導24 h后，收集各組別胞，按試劑盒說明書操作測定各組細胞中LDH、SOD和GSH的含量。

1.4.6 HUVECs中8OHdG、eNOS含量的測定 將HUVECs均勻接種于96孔板上，按“1.4.4”項下方法處理細胞，tBHP誘導24 h后，收集各組細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心20 min，取上清液，按說明書操作測定各組細胞中8OHdG和eNOS的含量。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 26.0和Graph Pad Prism 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度tBHP對HUVECs存活率的影響與對照組相比，tBHP 60 μmol/L濃度組HUVECs存活率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），tBHP 120、180、240 μmol/L濃度組HUVECs存活率均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同濃度tBHP對HUVECs存活率的影響（±s，n=3）

表1 不同濃度tBHP對HUVECs存活率的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別調零組對照組tBHP60 μmol/L濃度組tBHP120 μmol/L濃度組tBHP180 μmol/L濃度組tBHP240 μmol/L濃度組存活率/%-99.99±1.50 99.34±0.23 83.31±0.44*70.27±0.16**50.79±0.53**吸光度0.057±0.001 0.469±0.006 0.452±0.016 0.386±0.012 0.309±0.045 0.195±0.107

2.2 天香丹對HUVECs活性的影響與對照組相比，天香丹30、60 μg/mL濃度組HUVECs細胞活性無明顯變化，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；天香丹90、120 μg/mL濃度組HUVECs細胞活性均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。

表2 不同濃度天香丹對HUVECs活性的影響（±s，n=3）

表2 不同濃度天香丹對HUVECs活性的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，**P＜0.01。

組別 吸光度 細胞活性/%調零組0.057±0.001-對照組0.675±0.019100.00±3.05天香丹30 μg/mL濃度組0.659±0.016101.19±2.40天香丹60 μg/mL濃度組0.630±0.01796.57±1.50天香丹90 μg/mL濃度組0.574±0.02187.62±0.37**天香丹120 μg/mL濃度組0.499±0.02275.74±1.25**

2.3 天香丹對tBHP誘導的HUVECs存活率的影響與對照組相比，模型組HUVECs存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，維生素C組和天香丹低、中、高劑量組HUVECs存活率均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與維生素C組相比，天香丹低劑量組HUVECs存活率升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），天香丹中、高劑量組HUVECs存活率均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 天香丹對tBHP誘導的HUVECs存活率的影響（±s，n=3）

表3 天香丹對tBHP誘導的HUVECs存活率的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與維生素C組相比，^P＜0.05，^^P＜0.01。

存活率/%-100.00±6.13 49.34±2.45*^64.51±2.39#66.63±2.73#79.52±1.00##^84.63±1.53##^^組別調零組對照組模型組維生素C組天香丹低劑量組天香丹中劑量組天香丹高劑量組吸光度/A 0.057±0.001 0.553±0.030 0.205±0.023 0.330±0.023 0.356±0.020 0.430±0.019 0.489±0.014

2.4 天香丹對tBHP誘導的HUVECs細胞LDH、SOD、GSH的影響與對照組相比，模型組細胞LDH釋放量上升，SOD活性和GSH含量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，維生素C和天香丹各劑量組LDH釋放量下降，SOD活性和GSH含量上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與維生素C組相比，天香丹各劑量組SOD活性和GSH含量均上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），天香丹中高劑量組LDH釋放量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），天香丹低劑量組LDH釋放量下降，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表4 天香丹對各組HUVECs細胞LDH、SOD和GSH的影響（±s，n=3）

表4 天香丹對各組HUVECs細胞LDH、SOD和GSH的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與維生素C組相比，^P＜0.05，^^P＜0.01。

組別對照組模型組維生素C組天香丹低劑量組天香丹中劑量組天香丹高劑量組GSH/（μmol/g）17.84±0.70##^^5.66±0.22**^^8.60±0.32**##12.69±0.17**##^^14.03±0.83**##^^15.58±0.53**##^^LDH/（U/g）156.38±9.90##^^388.02±6.93**^^256.70±3.56**##254.49±3.67**##186.27±4.05**##^^205.20±2.58**##^^SOD/（U/mg）16.55±0.31##^^10.00±0.57**^^13.39±0.60**##14.58±0.36**##^16.34±0.54##^^17.78±0.53*##^^

2.5 天香丹對tBHP誘導的HUVECs細胞8OHdG和eNOS的影響與對照組相比，模型組細胞eNOS水平降低，8OHdG水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組相比，維生素C組及天香丹各劑量組細胞eNOS水平均上升，8OHdG水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與維生素C組相比，天香丹低劑量組8OHdG和eNOS水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），天香丹中高劑量組8OHdG水平降低，eNOS水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 天香丹對各組HUVECs細胞8OHdG和eNOS的影響（±s，n=3）

表5 天香丹對各組HUVECs細胞8OHdG和eNOS的影響（±s，n=3）

注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01；與維生素C組相比，^P＜0.05，^^P＜0.01。

eNOS/（ng/mL）8.34±0.45##^^4.83±0.47**^6.06±0.51**#6.38±0.58**##7.08±0.17*##^7.48±0.76##^^對照組模型組維生素C組天香丹低劑量組天香丹中劑量組天香丹高劑量組11.73±0.34##^^13.75±0.09**^^13.01±0.04**##12.91±0.17**##12.20±0.20**##^^12.13±0.05*##^^組別8OHdG/（ng/mL）

3 討論

CMD在心血管疾病中普遍存在，在心肌缺血缺氧、高血脂等病理因素作用下，內皮活性因子的產生和釋放受到影響，內皮功能出現(xiàn)異常，微血管順應性調節(jié)失常，可進一步導致CMD的惡性循環(huán)[17-18]。氧化應激是內皮功能障礙的重要誘因，tBHP是常見的體外氧化應激模型誘導劑，較H2O2具有穩(wěn)定性強，不易分解的優(yōu)點[19-20]。研究顯示，山楂酸可通過降低LDH釋放，提高SOD活性和GSH含量，減輕H2O2導致的細胞損傷[21]。本研究采用tBHP誘導HUVECs建立氧化損傷模型，細胞存活率顯著降低，細胞膜受損嚴重，LDH釋放量升高，DNA經氧化修飾，8OHdG水平升高，SOD的活性、GSH的含量及eNOS的水平均下降，提示此時細胞抗氧化能力不足，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，內皮細胞結構與功能均發(fā)生障礙。

維生素C是天然抗氧化劑的一種，具有極強的還原型，有研究顯示，其可有效抑制氧化應激誘導的HUVECs死亡，本研究將其作為陽性對照藥，研究結果也與其他研究結果相符[22]：經過維生素C預處理后，與模型組相較，細胞存活率逐漸上升，LDH釋放量和8OHdG的水平有所下降，eNOS的水平則有所上升，提示此時細胞膜及細胞中DNA分子的氧化損傷程度較輕，內皮功能得到改善，氧化應激受到一定程度的抑制。與維生素C組相比，HUVECs經天香丹不同劑量組預處理后，細胞存活率、SOD的活性、GSH的含量和eNOS水平均有上升，LDH釋放量和8OHdG的水平均有下降，天香丹對HUVECs氧化損傷和內皮功能具有改善作用，這種改善作用隨劑量加大而增強。綜上所述，天香丹對HUVECs氧化損傷具有抑制作用，在一定程度上能夠改善內皮功能，這與細胞抗氧化能力的增強有關，本研究為天香丹防治CMD提供了實驗依據(jù)。