天山棱子芹的DNA條形碼分子鑒定①

朱金芳，張 平，胡江蘭，阿吉艾克拜爾·艾薩

（1中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆特有藥用資源利用重點(diǎn)實驗室，烏魯木齊 830011；2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

天山棱子芹[Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]又名矮膜苞芹（Hymenolaena nanaRupr.），俗名庫魯木提，為傘形科（Umbelliferae）棱子芹屬（Pleurospermum）高山膜苞芹亞屬（HymenolaenaDC）多年生草本植物[1]，是分布在我國新疆西南部海拔4 000 m以上山坡草地的珍稀藥用植物[2]，是該地區(qū)具有較好藥用價值的民族藥材，當(dāng)?shù)鼐用褚恢庇惺褂锰焐嚼庾忧鄯乐翁悄虿?、高血壓、冠心病、腦血栓等疾病的習(xí)俗[3-4]。

由于中藥材質(zhì)量受生長環(huán)境、氣候條件、歷史沿革等多種因素的影響，使其性狀及質(zhì)量存在較大的差異，甚至出現(xiàn)同名異物或同物異名的情況[5-6]。而僅通過植物形態(tài)學(xué)及傳統(tǒng)的檢測方法進(jìn)行中藥材的分類及質(zhì)量控制已經(jīng)不能滿足我國中藥現(xiàn)代化的要求。棱子芹屬由植物學(xué)家Hoffmann于1814年建立以來，其范疇和亞屬的區(qū)分主要依據(jù)植物形態(tài)學(xué)差異[7]。但由于形態(tài)學(xué)分類的局限性，導(dǎo)致棱子芹屬的分類與鑒定比較困難。DNA條形碼技術(shù)可以從基因水平彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類的不足，其分析的是生物的基因型而非表現(xiàn)型，鑒定結(jié)果不受環(huán)境、樣品形態(tài)和材料來源的影響，可更加準(zhǔn)確可靠地鑒定中藥材[8-9]。目前，尚未見天山棱子芹DNA條形碼鑒別方面的研究報道。

DNA條形碼技術(shù)對藥用植物的鑒定，通常選用核糖體DNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer,ITS）、核糖體DNA第二內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer 2,ITS2）和葉綠體基因psbA-trnH間隔區(qū)片段（psbA-trnH spacer sequences,psbA-trnH）進(jìn)行擴(kuò)增。ITS2適用范圍較廣，在動植物及真菌中均有應(yīng)用。由于ITS2對植物DNA序列的擴(kuò)增效率較為突出，因此常作為藥用植物鑒定的主體序列[10-11]。psbA-trnH位于葉綠體基因，可作為藥用植物輔助序列，避免鑒定結(jié)果受真菌影響[11]。本實驗以ITS2和psbA-trnH為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到相應(yīng)DNA片段，考證天山棱子芹的基原，以期為天山棱子芹將來的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑BIO-RAD電泳儀（美國伯樂公司）；BIO-RAD T100型PCR儀（美國伯樂公司）；Gel Doc XR凝膠成像儀（美國伯樂公司）；渦旋混合儀（無錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司）；天山棱子芹樣本及種子（2019年9月采自新疆塔什庫爾干塔吉克自治縣）經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院盛萍教授鑒定為傘形科植物天山棱子芹[Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]及種子；DP320新型植物基因組提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)；KT201 2×Taq PCR Master Mix(天根生化科技北京有限公司)；ITS2及psbA-trnH引物[生工生物工程（上海）股份有限公司合成]；GelRed染色劑[生工生物工程（上海）股份有限公司]；TBE緩沖溶液[生工生物工程（上海）股份有限公司]；瓊脂糖（西班牙BIOWEST）。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取植物種子50 mg，加入液氮充分碾磨，參照新型植物基因組提取試劑盒（DP320）提取樣品總DNA。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量及其完整性。將剩余DNA樣品密封置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序 本實驗引物參考文獻(xiàn)[12-13]使用ITS2及psbA-trnH序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增，由Taq PCR Master Mix 25 μL，Sterilized dd H2O 19 μL，DNA模板2 μL、正反向引物各2 μL組成總體積為50 μL的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系。各引物對及其PCR反應(yīng)條件詳見表1。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行雙向測序。

表1 PCR擴(kuò)增引物及反應(yīng)程序

1.3 數(shù)據(jù)處理測序結(jié)果使用Codon Code Aligner V6.0.2軟件校對拼接，并將兩引物測得的序列導(dǎo)入美國國立生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進(jìn)行比對。使用 MEGA-X軟件對天山棱子芹及下載序列進(jìn)行NJ樹聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 總DNA檢測結(jié)果總DNA主條帶（＞15 000 bp）清晰，表明已成功提取出天山棱子芹植物總DNA。見圖1。

圖1 樣品總DNA電泳圖

2.2 PCR擴(kuò)增ITS2引物擴(kuò)增產(chǎn)物主條帶（500 bp）清晰，表明已成功擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，見圖2A。psbA-trnH引物擴(kuò)增產(chǎn)物主條帶（500 bp）清晰，表明已成功擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，見圖2B。

圖2 PCR擴(kuò)增樣品電泳圖

2.3 測序結(jié)果引物ITS2測序成功，共有403 bp，GC%：56.58%，擴(kuò)增產(chǎn)物測定序列為：ATTTTCAAGCTGGGCTATTCCCGGTTCGCTCGCCGT TACTAGGGGAATCCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCCGC TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGGTAGTCCCGCC TGACCTGGGGTCACAGTCGAGCGCGCACACTTTGT GGCACCGAAGGGTCCTCGAGCTAGCTTTGGTGACG GGTATTCGCGCAACATGAAAAGAGGGTCTTTTTAC AACCACAAATGTCACGACGTCCGTCGCCACAGGCT CACTTTTGGGCCAGCCACGCCGCAAGGCACGGGAG GCCAGTATCCGCCCCCGAACCAACGCATCTCCACA AGGAGAGTGTGGTTAAGGGCAACACGATGCGTGAC ACCCAGGCAGACGTGCCCTCAGCCTAGAGGACTTCGGGCGCAACTTGCGT引物psbA-trnH測序成功，共有499 bp，GC%：28.66%，擴(kuò)增產(chǎn)物測定序列為：GTTATATCTTATATTGGCTAATCCGCCCCCCTAGTTT TTTTATTTGAATTTCAAAGGATTCCTTTTTGATCAAA TTGATCATACAATATTTATCTAAAAAGAGTCTTAAA ATAAAAATAAGTAAAAAATTACAACATTTTTTTTTT AAGAAATCCTTCCCAAAATAAAAATATTGGAAAAT ATTGGGAAGAAGGCAGCCAAGTTGTATAGAATGCA AGTATGATATTCAATCACGAACGAGCCCATAAAAA GAAAAATACGTTTGTCAAAATTTTTTTAAACAAACT AGGTAAATACTACTAAAAAAAAATAAAAAAAAAA GGAGCAAAACCGCCCCCTTGAAAAAACAAAAAAA AGGTTATTGCCCCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTTCAA AAAACCCGAAAAAAAAAAAACCCGGCTTTACCCTT TTGAAAAGGGGGCTTCACCACCCCCTAAATCTAAG GGGAAGTTTTGAGCTTTACTTTCTCAAAAAAAAA。

2.4 鑒定ITS2序列鑒定結(jié)果見表2，由引物ITS2所得DNA片段與數(shù)據(jù)庫比對，最接近的物種為雙子葉植物傘形科棱子芹屬天山棱子芹（Hymenidium nanum），其相似性為98.2%。psbA-trnH序列鑒定結(jié)果見表3，引物psbA-trnH所得DNA片段與數(shù)據(jù)庫比對，最接近的物種為雙子葉植物傘形科瘤果芹屬裂苞瘤果 芹（Trachydium involucellatum），其相似性為93.92%，小于天山棱子芹的相似性。因ITS2序列鑒定結(jié)果未受真菌影響，且相似度較高，故以此序列鑒定結(jié)果為主并對其進(jìn)行聚類分析。

表2 天山棱子芹ITS2序列NCBI鑒定

表3 天山棱子芹psbA-trnH序列NCBI鑒定結(jié)果

2.5 NJ樹聚類分析天山棱子芹樣本（S）與天山棱子芹（Hymenidium nanum）聚為一支，支持率為92%，可推測樣品的基原為天山棱子芹。另外，美麗棱子芹（Hymenidium amabile）與天山棱子芹、天山棱子芹樣本（S）聚為一大支，支持率為85%，表明天山棱子芹與美麗棱子芹的親緣關(guān)系較近。剩余各支的支持率均大于50%，表明ITS2序列可用于區(qū)分天山棱子芹與其它同屬植物。見圖3。

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 植物形態(tài)特征圖4A、4B所示，天山棱子芹多年生草本植物，整株長5～30 cm，主根粗壯，質(zhì)堅硬，直徑0.3～1 cm，表面附有鱗片，棕褐色或灰棕色，底部有細(xì)橫皺紋，基部有褐色或灰褐色殘存的葉鞘。莖彎曲不分枝，圓柱形，長0.8～10 cm，直徑0.1～0.5 cm，有條棱，帶紫紅色，中空，易折斷。片輪廓長橢圓形，黃綠色至紅棕色，皺縮卷曲，質(zhì)脆易脫落。頂生復(fù)傘形花序腋生，直徑3～5 cm?；ü?個月，果圓形或橢圓形，有明顯隆起的縱棱，果梗長0.2～0.8 cm。氣微香，味微苦。對比《中國植物志》中對其形態(tài)學(xué)特征的描述，見圖4C所示，二者形態(tài)特征一致?？蛇M(jìn)一步確認(rèn)樣本的基原為天山棱子芹。

圖4 植物形態(tài)特征圖

3 結(jié)論

棱子芹屬建立初期物種較少，隨著更多學(xué)者的研究陸續(xù)將膜苞芹屬、滇蒿本屬、滇芎屬等屬的植物歸入該屬，使該屬不斷被擴(kuò)大[7,14]。由于以上演化過程，使棱子芹屬植物存在同物異名現(xiàn)象?！吨袊参镏尽分惺珍浱焐嚼庾忧壅麨閇Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]，異名為矮膜苞芹（Hymenolaena nana）,Pleurospermum nanum[2]，《中國生物物種名錄》中收錄天山棱子芹正名為[Pleurospermum lindleyanum(Lipsky)B.Fedtsch.]，異名為Hymenolaena lindleyana,Hymenolaena nana,Hymenidium nanum[15]。本文以ITS2序列為主，以psbA-trnH序列為參考，對采集的樣本進(jìn)行基原鑒定，以ITS2擴(kuò)增序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，得到該樣本與Hymenidium nanum（天山棱子芹異名）的相似度最高為98.2%。由此可以判斷，與樣本相似度最高的植物為天山棱子芹。再通過NJ樹聚類分析，驗證樣本與天山棱子芹及其相似度較高的其他植物之間的分類并計算其可信度，結(jié)果表明樣本與天山棱子芹聚為一支，再次證明ITS2序列對樣品的鑒定結(jié)果可信度較高。最后，以《中國植物志》中天山棱子芹的形態(tài)特征為參考，比對樣本的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)樣本與天山棱子芹形態(tài)特征吻合。綜合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)與現(xiàn)代DNA條形碼鑒定結(jié)果，最終確定樣本的基原為天山棱子芹。